Applicazioni biotecnologiche in
systems biology
Lezione #12
Dr Marco Galardini
AA 2012/2013
Systems biology
Case studies
Lezione #12
Dr. Marco Galardini
AA 2012/2013
Cell cycle in α-proteobacteria
M. genitalium whole cell model
Cell cycle in α-proteobacteria
Cell cycle in α-proteobacteria
Il ciclo cellulare è una serie ordinata e periodica di eventi che
determinano la crescita della cellula e la sua divisione in due
cellule figlie.
Comprende:
-Replicazione del DNA
-Crescita di volume
-Formazione di nuove strutture cellulari (flagello, pilus etc etc)
-Divisione cellulare
From Emanuele Biondi @IRI CNRS, Lille
Cell cycle in α-proteobacteria
Caulobacter crescentus, organismo modello per il ciclo cellulare:
-Gram negativo
- Vive in ambiente acquatico
- Replica il DNA una volta sola a ciclo cellulare
- Puo’ essere sincronizzato
- La cellula madre e’ morfologicamente distinguibile dalla cellula figlia
Regolazione del ciclo cellulare nei batteri
Caulobacter crescentus
Stalked cell:
- Presenza di un peduncolo
con terminazione adesiva
per aderire alle superfici
- Cellula “madre”: produce
molte cellule figlie
Swarmer cell:
- Presenza di un flagello
chemotattico
Regolazione del ciclo cellulare nei batteri
Caulobacter crescentus:
Photo courtesy of Y. Brun
Regolazione del ciclo cellulare nei batteri
Caulobacter crescentus:
Photo courtesy of Y. Brun
- Regolazione temporizzata di un grande numero di geni?
- Quali sono questi regolatori e come attuano la loro funzione?
Trascrizione regolata durante il ciclo cellulare
>3
induzione
>1.5
1:1
>1.5
>3
repressione
• 533 geni (19% del totale) sono regolati durante il ciclo
cellulare
• Quali funzioni vengono attivate?
Laub et al., Science, 2000, (290:2144-8)
Trascrizione regolata durante il ciclo cellulare
>3
induzione
>1.5
1:1
>1.5
>3
Laub et al., Science, 2000, (290:2144-8)
repressione
• L’attivazione delle funzioni e’ contestuale al loro
utilizzo
• Quali sono i regolatori trascrizionali (master
regulators) che controllano questi processi?
MUTANTI DEL CICLO CELLULARE
wild type
DCC0138
DCC0744
DCC0909
DCC1063
DCC3315
Funzioni di CtrA
wt
ctrAts
-Niente divisione cellulare
-Niente strutture cellulari (flagello, piede, pilus…)
-Accumula cromosomi (nessun controllo della replicazione del DNA)
Sistemi a due componenti e fosforelay
Componenti fondamentali
della regolazione del ciclo
cellulare
Trascrizione regolata durante il ciclo cellulare
>3
induzione
>1.5
1:1
>1.5
>3
repressione
• 144 geni su 533 sono regolati direttamente o
indirettamente) da ctrA
• come funziona il suo meccanismo di regolazione?
• come viene attuata la temporizzazione?
Sistemi di regolazione di CtrA
Come è regolata la progressione del ciclo:
Regolazione dell’attività di CtrA:
- Trascrizione di CtrA
- Fosforilazione di CtrA
- Degradazione proteolitica di CtrA
CtrA, regolazione attraverso fosforilazione
CtrA controlla piu’ di 50 geni
• CtrA svolge la sua funzione solo nella forma fosforilata
• Attivazione/repressione trascrizionale di molti geni
• Regolazione trascrizionale diretta/indiretta
• Sequestro dell’origine di replicazione
• Impedisce la duplicazione del cromosoma
• Perché parta la duplicazione cellulare la forma fosforilata di CtrA deve sparire
• CtrA (de-fosforilato) viene facilmente proteolizzato
CtrA, regolazione attraverso fosforilazione
• CtrA-P si trova nelle swarmer cells, dove inibisce la progressione del ciclo cellulare
• Quale meccanismo e’ implicato nell’assenza di CtrA-P al momento giusto?
• Controllo trascrizionale del gene ctrA
• De-fosforilazione di CtrA-P - Degradazione proteolitica
• Proteolisi di CtrA
CtrA, degradazione proteolitica
CpdR controlla la degradazione CtrA
WT
DcpdR
CtrA
Feedback negativo di DivK su CtrA
Biondi et al (2006) Nature
Feedback negativo di DivK su CtrA
• CtrA-P regola negativamente se stesso
• Via via che CtrA-P si accumula, DivK-P previene la fosforilazione di CtrA
• CtrA (defosforilato) viene quindi degradato, assicurando la replicazione del DNA
Biondi et al (2006) Nature
Distribuzione asimmetrica di CtrA
flagellum
• Come viene assicurato che
CtrA-P sia assente nella
cellula madre?
B
A
stalk
NB: ancora le cellule non
sono separate, hanno quindi
ancora in comune il
citoplasma
Localizzazione asimmetrica di DivJ e PleC
CtrA-P
CtrA
Localizzazione dei sistemi a due componenti
Control of DivK phosphorylation
DdivJ
• Il ciclo cellulare non viene
mai fermato
• Molti cromosomi per
cellula
• Inibizione della formazione
del setto e separazione delle
cellule
DpleC
Wild type
• Fenotipo meno severo
CONCLUSION
Biondi et al (2006) Nature
Regolazione del ciclo cellulare in Caulobacter
Biondi et al 2006, Nature
Brilli et al 2010, BMC Syst Biol
Dove e’ conservata questa regolazione?
a-proteobatteri
Brucella abortus
Sinorhizobium meliloti
Rhodobacter sphaeroides
Agrobacterium tumefaciens
Hyphomonas neptunium
Rhodopseudomonas palustris
Gupta (2000) FEMS Micro. Rev.
• Quali proteine di Caulobacter sono conservate?
• CtrA controlla gli stessi geni nelle altre specie?
• I regolatori di CtrA sono presenti?
Ricerca degli ortologhi di Caulobacter tramite BBH
• Conservazione “modulare”
• Conservazione in accordo con la filogenia
CtrA controlla gli stessi geni nelle altre specie?
Ricerca della sequenza
di regolazione a monte
dei geni
• Conservazione della
regolazione
• L’autoregolazione di
CtrA sembra mantenuta
M. genitalium whole cell model
M. genitalium whole cell model
• Batterio patogeno (parassita) del
tratto genitale e respiratorio
umano
• Parassita = genoma ridotto
• Solo 525 geni
• ~600 kb (E.coli ~6Mb)
• Usato come modello per capire il
“genoma minimo”
• Qual’e’ il minimo numero di
geni capace di sostentare la
vita?
Perche’ M.genitalium?
• Il basso numero di geni riduce il numero di calcoli e possibili
interazioni
• Bottom-up approach
Perche’ un whole cell model?
• Usare ODEs (equazioni differenziali) presuppone la conoscenza dei
parametri di reazione
• Modelli costraint-based necessitano di indicare una objective
function
• Un modello completo cellulare puo’ predire il comportamento
cellulare a partire dalla concentrazione di ogni componente cellulare
• Scoprire la funzione di geni a funzione ignota
• In-silico mutagenesis
Model construction
• Divisione dei processi cellulari in 28 moduli indipendenti
• Ciascun modulo ha i suoi parametri e la propria implementazione matematica
• Parametri ricavati da 900 articoli e 1900 esperimenti
• I moduli sono considerati indipendenti per lasso di tempo brevissimo (~1s)
• Le concentrazioni degli input di ogni modulo dipendono dagli altri moduli
Model construction
• Le concentrazioni degli
input di ogni modulo
dipendono dagli altri
moduli
• Calcolo indipendente
lungo ~1s
• Ripetizione fino a
divisione cellulare completa
Model Training and Validation
• Il contenuto di macromolecole (DNA, Lipidi, Proteine, RNA) predette dal modello sono
comparabili a queli osservati sperimentalmente
Metabolic fluxes
• L’intensita’ di colore delle reazioni indica il flusso
• La glicolisi appare >100 volte piu’ utilizzata rispetto alla via dei pentoso fosfati e dei lipidi
DNA binding proteins
• La maggior parte delle DNA-binding
proteins “tocca” tutto il cromosoma
con eguale probabilita’
• La RNA polimerasi viene trovata piu’
spesso nella regione dei geni rRNA
(sintesi proteica)
• Il complesso della DNA polimerasi
viene trovata piu’ spesso verso il
termine di replicazione che verso
l’origine
• Perche’?
DNA binding proteins
• Le DNA-binding proteins “esplorano” la molecola di DNA molto velocemente
• L’unica eccezione e’ il complesso della DNA polimerasi
• La prima parte del cromosoma e’ sintetizzata velocemente, poi si ha un forte
rallentamento
Cell Cycle Control
• Il rallentamento della replicazione del
cromosoma avviene nello stesso
momento in cui la concentrazione dei
dNTP crolla
• I dNTP sono il fattore limitante la
velocita’ del ciclo cellulare
• La produzione di dNTP e’
strettamente legata al metabolismo
• Per Mycoplasma Genitalium il
controllo del ciclo cellulare appare
maggiormente metabolico che
genetico
Main Molecules in metabolism
• ATP e GTP sembrano essere le monete di scambio principali per il metabolismo di M.
genitalium
In-Silico mutagenesis: essential genes?
• Analisi della variazioni di vari parametri vitali dopo la rimozione di un gene dal modello
• 284 geni essenziali (~50%)
• In base al parametro toccato dalla mutazione si puo’ risalire alla funzione specifica del
gene
In-Silico mutagenesis: correzione del modello
• Le differenze fra il
mutante “vero” (tramite
esperimento) e il
modello servono per:
• correggere i
parametri cinetici
• determinare la
funzione del gene
mutato
Bottom-up
Perche’ M.genitalium?
• Il basso numero di geni riduce il numero di calcoli e possibili
interazioni
Problemi
• M. genitalium e’ difficile da manipolare sperimentalmente
• Microscopico (rispetto agli altri batteri)
• Alcuni parametri del modello sono ricavati da altre specie meglio
studiate
• La messa a punto e rifinizione dell’approccio permettera’ di creare
modelli metabolici completi di altre specie
