Melania Cardaropoli Lezione di medicina di laboratorio del 31/10/08 Prof.ssa Maria Antonietta Tufano Arial Narrow: aggiunte della Prof.ssa alle slides La Sepsi
La Sepsi è una Sindrome Clinica caratterizzata da un insieme di alterazioni
immunologiche, metaboliche, emodinamiche , respiratorie, secondarie ad un
processo infettivo (interazione tra ospite e agente infettante) e provocata da una
abnorme risposta infiammatoria dell’organismo (SIRS), sia di tipo umorale che cellulare.
La sepsi, è caratterizzata da un’ elevata mortalità soprattutto per quei pazienti critici che si trovano in
terapia intensiva, e da un’ invasione del circolo ematico da parte di microrganismi con il rilascio di prodotti
tossici e di fattori di virulenza con moltiplicazione dell’ agente patogeno in circolo. In seguito alla liberazione
di fattori trofici e di fattori di virulenza ne consegue un coinvolgimento multi sistemico con possibilità di
diffusione multiorganica, dando origine a quella che viene definita con la sigla “MODS”, ossia una Sindrome da
Disfunzione Multiorganica che rappresenta una condizione molto dannosa per il paziente.
SIRS
La SIRS (o Sindrome da Risposta Infiammatoria Sistemica) definisce la risposta
infiammatoria aspecifica dell’organismo ad una liberazione di mediatori infiammatori
e la sua diagnosi richiede la presenza di 2 o più tra i seguenti segni clinici:
Temperatura corporea 38 °C o 36°C;
Frequenza cardiaca 90 battiti/min;
Frequenza respiratoria 20 atti/min;
Iperventilazione (PaCO² 32 mmHg);
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WBC 12.000/mm³ o 4.000/mm ³;
Neutrofili immaturi 10% (perché il midollo osseo stimolato induce la liberazione in circolo
di neutrofili immaturi)
Per poter confermare la diagnosi di SIRS, questi segni devono essere di recente
comparsa e ad evoluzione acuta!
E’ importante sottolineare che la SIRS è una risposta aspecifica a svariati eventi
morbosi come l’ischemia, il trauma multiplo, la pancreatite, il danno termico, lo
shock, l’infezione….
Dati recenti indicano che intervengono anche cambiamenti emostatici
Sepsi : SIRS + Infezione
Sepsi:
– Infezione conclamata o probabile (cioè da verificare)
– Due o più criteri di SIRS
Quando ci troviamo di fronte ad una sepsi c’è un collegamento significativo con le
alterazioni dell’emostasi
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Sepsi Grave : Disfunzione acuta d’organo e alterazioni
dell’emostasi
Sepsi Grave:
Sepsi con segni di disfunzione d’organo in 1 dei seguenti sistemi :
– Cardiovascolare
– Renale
– Respiratorio
– Epatico
– Emostasi
– SNC
– Acidosi metabolica inspiegabile
Quindi, la sepsi severa ha come caratteristica anche la comparsa della MODS che può
riguardare proprio quei sistemi sopra elencati. Sono necessarie però alcune precisazioni
semantiche, nel senso che, dobbiamo distinguere la sepsi dalla batteriemia.
Sepsi: è caratterizzata da un’ invasione del circolo ematico, dalla moltiplicazione del
microrganismo in circolo e da una persistenza dei microrganismi in circolo con liberazione di
prodotti di virulenza.
Batteriemia: è caratterizzata dalla presenza transitoria dei microrganismi in circolo, senza
una moltiplicazione e senza la liberazione di fattori di virulenza, a dimostrazione del fatto che
da un punto di vista clinico la batteriemia è diversa dalla sepsi.
Dobbiamo fare un’ ulteriore distinzione della sepsi in:
Ospite-dipendente: sono caratterizzate da una condizione di deficit immunitario dell’ ospite e
compaiono in ambito ospedaliero lì dove ci sono pazienti fragili che hanno una riduzione delle
loro difese organiche ed immunologiche. I microrganismi che sono coinvolti in questo tipo di
sepsi, sono anche dei microrganismi ambientali, che non hanno dei particolari fattori di
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virulenza, ma che sono responsabili di patologie in un ospite fragile. Per tale motivo sono
denominati agenti patogeni “condizionati”, che si distinguono dagli agenti patogeni classici,
dato che quest’ ultimi si associano sempre ad una condizione di sepsi, indipendentemente
dalla condizione immunitaria dell’ ospite, a differenza dei condizionati che come abbiamo detto
approfittano di una condizione deficitaria della risposta immune dell’ ospite.
Microbico-dipendente: si tratta di sepsi che compaiono in corso di particolari infezioni
indipendentemente da condizioni di deficit della risposta immunologica dell’ospite. Infatti, sono
sepsi che accompagnano infezioni come il tifo, la brucellosi e la meningococcemia, che come
sappiamo è caratterizzata da una famosa forma di setticemia molto grave che conduce a
morte il soggetto.
Dobbiamo fare un’ ulteriore distinzione della sepsi in :
Primitiva: si tratta di una sepsi che segue all’ introduzione diretta del microrganismo nel
sangue ( trasfusione, emodialisi, applicazione di cateteri intravenosi, nutrizione parenterale
etc…)
Secondaria: riconosce un focolaio di partenza ( cute, apparato gastroenterico, vie urinarie, vie
genitali), dall’ ospite dal quale originano i microrganismi che secondariamente invadono il
circolo ematico.
Modalità con le
cardiocircolatorio
quali
i
microrganismi raggiungono
l’apparato
-Ferite cutanee : accidentali, chirurgiche
-Lesioni mucose : accidentali, chirurgiche, per pratiche di igiene orale
-Morsicature : animali, uomo incluso
-Iniezioni : farmaci, droghe, tatuaggi
-Trasfusioni
-Cateterismi intravascolari
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-Propagazione da processi infettivi ( che originano in determinate sedi con secondaria
propagazione nel circolo ematico)
Porta d’ingresso dei microrganismi
• a partenza dal cavo orale
streptococchi -emolitici, stafilococchi
• dall’apparato digerente
enterobatteri, batteri anaerobi (che colonizzano l’ intestino come i Bifidobatteri, gli
Streptococchi etc…)
• dalle vie urinarie
enterobatteri (E. coli, Klebsiella spp., Enterobacter, Enterococchi,
*Gram- non fermentanti)
* come Pseudomonas e Acinetobacter
• dall’apparato genitale femminile
enterobatteri, batteri anaerobi
• di origine iatrogena
enterobatteri (contaminanti di infusioni)
,
Legionella spp., Pseudomonas spp. (ventilazione assistita)
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Stafilococchi coagulasi positivi e negativi, Pseudomonas spp,* KES (cateteri venosi,
protesi)
*KES: Klebsiella, Enterobacter, Serratia
Annotazioni relative ai più comuni casi di sepsi causate da batteri
Neisseria gonorrea : non induce sempre setticemia, ma la induce quando si tratta di
particolari ceppi resistenti alla lisi complemento-mediata. Si tratta di ceppi che hanno un ricco
contenuto di proteine nella membrana interna, tale da rendere l’ esterna particolarmente
rigida. La Neisseria induce setticemia anche in quei soggetti che hanno un deficit della
componente complementare, infatti, come sappiamo, la lisi complemento- mediata è uno dei
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meccanismi immunitari più importanti che fa parte dell’ immunità innata. In caso di infezioni da
gram- ed in questi soggetti, le sepsi sono particolarmenete gravi e destruenti, colpiscono
anche le articolazioni e danno luogo a delle forme di artriti purulente con distruzione delle
articolazioni.
Neisseria meningitidis : è legata alla capacità del microrganismo di liberare endotossine.
Nel corso della crescita logaritmica la Neisseria sintetizza grosse componenti della membrana
esterna, che come sappiamo contiene LPS e proteine. Si formano così delle vescicole che
sono costituite da componenti della membrana esterna, si staccano dalla superficie e passano
in circolo, in modo tale che ci troveremo di fronte ad un’ enorme quantità di liposaccaridi, che
sono i pricipali responsabili della morte da batteri gram- ed in particolare da Neisseria
gonorrea.
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Altri microrganismi, in particolare i virus,
penetrando nei linfociti e nei monociti.
sono capaci di invadere il circolo ematico
Naturalmente il motivo per cui nelle forme setticemiche si determina quella interazione tra
microrganismo ed ospite, responsabile di quella sintomatologia grave che dalla SIRS porta alla
MODS, è legato al fatto che alcune componenti dei batteri funzionano da fattori di virulenza
interagendo con i mediatori dell’ ospite (sia umorali che cellulari). I componenti batterici capaci
di dare queste forme morbose così gravi, sono provenienti sia dai batteri gram+ che dai gramcome nel caso dell’ LPS, cioè quell’ endotossina che partendo dalla membrana esterna dei
batteri gram- si trasferisce sulla superficie cellulare formando su di essa un recinto idrofilo. Gli
effetti tossici dell’endotossina per interazione con l’ ospite sono soprattutto legati al lipide A,
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che rappresenta la parte endotossica dell’ LPS, ma esistono anche le porine, proteine che
attraversano a tutto spessore la membrana esterna, di solito trimeriche e con tre canali che
poi confluiscono in un unico canale svolgendo un’ attività biologica importante.
Per quanto riguarda i batteri Gram+, esiste quel grosso strato di peptidoglicano per cui in
seguito alla lisi dei gram+, si liberano componenti quali (peptidoglicano, acido lipoteicoico e
acido teicoico), che interferiscono con il sistema mediatore dell’ ospite e che sono responsabili
di morte. Per cui i batteri gram+ rappresentano i fattori maggiormente responsabili di questa
sintomatologia. Infatti, quei componenti batterici che indichiamo con il termine di moduline,
sono componenti di superficie del batterio che sono capaci di interagire con i sistemi mediatori
dell’ ospite. Anche le infezioni micotiche sono oggi in grande aumento dal momento che sono
aumentati i pazienti immunodepressi ed i pazienti sottoposti a trapianti, per cui sono
aumentate le infezioni micotiche, che sono un classico appannaggio dell’ ospite
immunocompromesso. Quindi, le moduline che interagiscono con il mediatore dell’ ospite
sono l’ LPS, i batteri gram- e in particolare il lipide A.
Le strutture microbiche che interagiscono con il sistema immune innato vengono
denominate PAMPS ( pathogen-associated molecular patterns)
Fattori Microbici più importanti sono:
LPS dei Gram ‐ (in particolare la componente lipidica A), Porine Mucopolisaccaride di superficie dei Gram + (capsula o glicocalice)
*Peptidoglicano, Acido lipoteicoico (appannaggio esclusivo dei gram+)
Ag virali e fungini (mannani),
Lipoarabinomannano dei micobatteri
La TSST-1 di S. aureus ( tra i componenti dei gram+ c’è anche la TSST-1che
sarebbe la tossina dello shock tossico nello S. aureus)
Tossine pirogene di S. pyogenes
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*Il peptidoglicano esiste anche nei Gram- dal momento che è l’ unico responsabile
della rigidità della parete, anche se nei Gram- è molto più sottile, per cui avrà un
tempo di concentrazione più basso.
Sepsi da bacilli Gram negativi
Fattori favorenti
-Farmaci immunosoppressivi e antimetabolici
-Abuso di chemioantibiotici a largo spettro
-Cateteri vescicali e venosi permanenti
-Tracheotomia, ventilatori meccanici
-Interventi chirurgici radicali
-Età avanzata
-Terapia endovenosa con soluzioni contaminate
-Migliorata sopravvivenza di pazienti a prognosi infausta
La sepsi da bacilli gram- è molto frequente negli ambienti ospedalieri. E’ la più grave,
poiché non si evidenzia la produzione di mediatori batterici o di fattori di virulenza nel
corso della crescita logaritmica del batterio e nel corso dell’ attività metabolica più
evidente della vita del batterio. Alcune molecole come le PF porine si liberano non solo
in seguito alle lisi batteriche come accade per i gram+, ma si liberano proprio nella fase
di crescita logaritmica, ciò significa che quando un microrganismo gram- invade il
circolo ematico e comincia a moltiplicarsi, immediatamente comincia a liberare un
componente che viene definito Endotoxin free (endotossina libera), che è associata
alle porine, per cui nella mediazione del processo sistemico intervengono sia LPS che
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porine sin dalla prima fase del processo infettivo. Infatti, è stato visto che inoculando in
un animale da esperimento un’ endotossina, si verificano una serie di azioni sistemiche
che poi corrispondono alle stesse verificatesi nell’ uomo.
Attività biologiche dell’ endotossina
BOX 24-2 Endotoxin-Mediated Toxicity
- Febbre
- Leucopenia seguita da leucocitosi
- Attivazione del complemento
- Trombocitopenia (diminuzione del numero delle piastrine)
- Coagulazione intravascolare disseminata
- Ridotta perfusione dei maggiori organi
- Shock
- Morte
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Spiegazione dello schema:
Oggi noi sappiamo che l’ endotossina è responsabile di tutti quei fenomeni biologici sopra
elencati, poiché attraverso il lipide A è capace di interagire con una serie di sistemi dell’ ospite,
sistemi mediatori sia umorali che cellulari. L’ endotossina infatti interagisce con il sistema
complementare che per essere attivato necessita di una via classica e di una alternativa.
L’ endotossina è capace di attivare entrambe le vie, poiché la via classica viene attivata a
partire dal C1q per un’ interazione diretta con il lipide A, ma la parte polisaccaridica attiva il C3
e quindi la via alternativa. Attivazione del complemento significa liberazione di una serie di
mediatori pro-infiammatori (C3a, C5a ed il trimero C5-6-7 ), di cui C3a e C5a inducono
vasodilatazione, ma anche chemiotassi, quindi c’è il richiamo di leucociti polimorfonucleati e
particolarmente chemiotattico è proprio il componente trimerico C5-6-7. In definitiva abbiamo
questo processo infiammatorio che è già moltiplicato da questa prima interazione con il
sistema complementare. L’endotossina interagisce anche con il fattore di Hageman che
interviene come mediatore di altre vie poichè interviene per favorire la coagulazione. Infatti, il
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fattore di Hageman attiva il plasminogeno trasformandolo in plasmina, enzima proteolitico
capace di digerire i coaguli di fibrina, in modo tale che la prima fase, cioè quella della
coagulazione, determina un’ attivazione del processo di coagulazione con formazione di
coaguli di fibrina e quindi di trombi. Quindi, l’ attivazione del fattore di Hageman è
un’ attivazione massiva dal momento che l’ LPS si libera in circolo in grosse quantità già
durante la fase di crescita logaritmica, configurando quel famoso quadro dell’ endotoxin free.
Questo è importante per giustificare quelle sepsi gravi, dato che alcuni batteri liberano quantità
enormi di liposaccaride in circolo associati alle porine, per cui abbiamo questo massivo
coinvolgimento di mediatori e quindi CID che blocca la perfusione di organi con conseguente
morte, poiché si crea una condizione di ipossia con disfunzione multiorganica che caratterizza
le sepsi gravi da parte dei gram- . Il fattore di Hageman induce anche ipotensione dal
momento che attiva il sistema delle chinine che producono una notevole vasodilatazione e
quindi ipotensione, che ancora una volta conduce ad una ridotta perfusione degli organi
provocando shock. L’ endotossina interviene anche con un’ interazione con i macrofagi,
cellule la cui attivazione porta alla liberazione di una notevole quantità di citochine proinfiammatorie (IL1, IL8, IL6), e non solo il TNF, ma anche l’ endotelio, quando interagisce
l’ LPS che si trova in circolo, è un mediatore poiché una volta attivato libera una serie di
citochine pro-infiammatorie. Accanto all’ LPS nei batteri gram- noi abbiamo anche l’ attività
biologica delle porine, che associate alle LPS e liberate in circolo, determinano il rilascio di
citochine.
Effetti biologici delle porine
-
Rilascio di citochine infiammatorie da linfomonociti
-
Rilascio di PAF (fattore attivante le piastrine) da PMN, cellule mesangiali e
HUVEC (cellule endoteliali)
-
Attivazione del complemento (attraverso la via alternativa)
-
Effetto procoagulante su trombina, fibrinogeno o su entrambi ( per cui si favorisce
la CID con trombi diffusi e morte)
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Ruolo dell’ endotelio nella sepsi
L’ endotelio ha un ruolo molto importante nell’ evoluzione sepsigena in quanto è
contemporaneamente bersaglio e produttore di mediatori (in particolare di citochine
pro-infiammatorie)
-Alcuni contribuiscono all’ amplificazione del danno e all’ evoluzione verso la sepsis
syndrome
-Altri hanno effetto di feed-back e possono essere in grado di ristabilire l’ omeostasi
Quindi, in questa interazione tra prodotti batterici e mediatori dell’ ospite, uno degli aspetti più
importanti è dimostrato proprio dal coinvolgimento dell’ endotelio, che si comporta anche da
bersaglio poiché le tossine e le porine determinano fattori tossici a livello dell’ endotelio. Infatti,
noi sappiamo che il primum movens affichè avvenga la coagulazione del sangue è
l’ alterazione dell’ endotelio, con rallentamento della circolazione ematica, rolling dei PMN sulla
superficie dell’ endotelio e liberazione di mediatori dall’ endotelio.
FISIOLOGIA DELLA SEPSI
Gli eventi iniziali della sequenza della sepsi, scatenati dalla risposta immunitaria
eccessiva del soggetto, sono caratterizzati dal danno diretto all’ endotelio.
Il danno all’ endotelio provoca:
-
Attivazione dei neutrofili (per rallentamento della circolazione)
-
Adesione degli stessi alle cellule dell’ endotelio (LPS e le porine attivano
l’ espressione di molecole di adesione sull’ endotelio, in modo tale che quando rallenta
la circolazione, si ha il rolling dei leucociti che aderiscono all’ endotelio tramite
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interazione con il recettore come fanno le ICAM e tutto ciò comporta che i neutrofili
passano nei tessuti attraverso l’ endotelio e raggiungono il focolaio infiammatorio.)
-
Produzione di citochine pro-infiammatorie come IL-1a, IL-1b e TNF che
inducono l’ espressione del Fattore Tissutale (TF) attivatore della coagulazione.
I mediatori infiammatori liberati in eccesso, determinano lesione tissutale ed un
conseguente sviluppo di diffuso danno ai capillari.
Patofisiologia della sepsi severa
Spiegazione dello schema:
L’endotelio produce anche un fattore tissutale oltre all’ IL6 che attiva il processo della
coagulazione. Infatti, nella sepsi l’IL6 quando raggiunge livelli di 1000 picogrammi/ml la
prognosi è infausta, ma il fattore tissutale viene liberato anche dai monociti, per cui la
liberazione del TF dall’ endotelio e dai monociti, attiva la parte della cascata della
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coagulazione attraverso i vari fattori che attivano la trombina, dando origine alla fibrina
e alla formazione di questi coaguli di fibrina che sono presenti anche per altri motivi,
poiché nel caso delle sepsi vengono inibiti dei fattori come:
-TAFI (inibitore della fibrinolisi attivabile dalla trombina)
-PAI1 (inibitore dell’ attivazione del plasminogeno)
Questi due fattori aumentano in corso di sepsi, per cui viene soppressa la fibrinolisi,
persistono questi coaguli, persistono questi trombi con CID, e con essa si riduce il
fibrinogeno e le piastrine che vengono utilizzate nella formazione dei trombi con
conseguente emorragia da consumo. Ciò, spiega una sindrome importante che si
realizza in corso di sepsi grave e consegue alla CID e alla emorragia da consumo, e che
osserviamo soprattutto in corso di meningococcemia e che sarebbe la S. di
Waterhouse- Friderichsen, che corrisponde ad una necrosi emorragica delle surrenali e
quindi ad una forma di ipotensione grave che porta allo shock e alla morte rapida.
Mediatori dell’ ospite, liberati in risposta allo stimolo
infettivo e implicati nella patogenesi della sepsi
-Metaboliti attivi del complemento
-Le chinine (indicano forte vasodilatazione)
-I fattori del sistema della coagulazione
-Citochine, TNF, PAF, IL-1, IL-6
-Enzimi e sostanze ossidanti (radicali liberi) prodotte dai PMN
-Prodotti del metabolismo dell’ acido arachidonico come PG, TX e leucotrieni
(che favoriscono l’ aggregazione dei PMN e piastrine e quindi la formazione di trombi)
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Spiegazione dello schema:
Questa è una diapositiva che praticamente condensa quanto abbiamo detto. Ci
evidenzia come nell’ infiammazione l’ endotossina interagisce con il complemento, con
aumento della permeabilità vascolare, conseguente chemiotassi ed infiammazione.
L’ LPS interagisce anche con il fattore di Hageman trasformando il fibrinogeno in fibrina,
quindi abbiamo CID, ma il fattore di Hageman attiva anche il plasminogeno dando
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fibrinolisi ed emorragie. Ancora il fattore di Hageman interviene nel sistema delle
chinine, portando alla formazione di bradichinina che induce vasodilatazione ed
ipotensione. L’ LPS interagisce con i mediatori cellulari (macrofagi, endotelio, piastrine,
PMN, fibroblasti, mastcellule), che liberano mediatori pro-infiammatori, molecole di
adesione, fattori della coagulazione e fattori di crescita. Tutto ciò comporta
un’ipotensione finale con depressione miocardica a livello dei vasi, (vasodilatazione,
aggregazione dei leucociti, di piastrine e danno endoteliale), a livello degli organi,
ipoperfusione ed alterazioni metaboliche, quindi acidosi metabolica, shock, SIRS e
MODS.
Nel corso della sepsi da gram+ si liberano dei fattori tossici come la TSST-1 dello S.
Aureus e le tossine pirogene da Streptococcus Pyogenes. Se ricordate la setticemia da
Streptococcus Pyogenes accade che queste tossine si comportano da superantigeni.
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Nel caso dell’ antigene questo viene processato nell’ APC, viene esposto sulla
superficie in associazione con le molecole MHC di classe seconda ed interagisce con i
TCR dei linfociti.
Nel caso del superantigene questo non viene fagocitato ed inglobato nell’ APC, ma si
lega direttamente sulla superficie dell’ APC interagendo con una parte con l’ MHC di
classe II, dall’ altra con la catena V del TCR. Cioè significa che mentre l’ antigene
riconosce uno specifico recettore presente su di un clone linfocitario e quindi stimola
esclusivamente quel clone linfocitario, nel caso del superantigene si lega alla parte
variabile del PCR in modo tale da attivare più cloni linfocitari, mentre nel caso
dell’ antigene si attiva una cellula, un clone di linfociti su 105-106. Quindi, anche su un
milione di cloni di linfociti il superantigene attiva il 20% dei linfociti, ciò significa che si
produrrà un’ enorme quantità di citochine che si troveranno in circolo.
Indagini microbiologiche
A questo punto parliamo della parte diagnostica. La sepsi per gravità della
sintomatologia che la caratterizza e per la rapidità con cui i soggetti vanno incontro a
morte, richiede una terapia il più velocemente possibile, quindi una diagnosi quanto più
rapida possibile, dal momento che la sepsi deve essere considerata una vera
emergenza medica. La diagnosi di sepsi si avvale di una diagnostica tradizionale e di
una innovativa. La diagnostica tradizionale si avvale soprattutto dell’ emocoltura, che è
una coltura del panno periferico ottenuto mediante prelievo venoso.
Emocoltura
L’emocoltura ha assunto negli ultimi anni un’ importanza crescente
prevalentemente per l’ aumentata incidenza di sepsi in pazienti
immunodepressi. L’efficacia ed il significato clinico dell’ emocoltura
dipendono da molteplici aspetti metodologici ed interpretativi. Nella fase
preanalitica le modalità di prelievo ed il numero dei campioni rappresentano
elementi di fondamentale importanza.
L’ emocoltura, come tutte le colture batteriche, è l’ unica indagine che consente di avere
il microrganismo in coltura e che consente di eseguire sul microrganismo test di
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sensibilità agli antibiotici. Quando si fa un prelievo possiamo rischiare una
contaminazione da parte di microrganismi cutanei, quindi potremmo trovarci di fronte
a delle emocolture falsamente positive, per cui per il prelievo è necessario essere attenti
a determinate situazioni.
Emocoltura
Prelievo
-pulizia meccanica della cute
-decontaminazione accurata con alcool iodato (poi bisogna allontanare anche lo
iodio con alcool non iodato poiché è tossico per i batteri)
-prelievo sterile, meglio, con Vacutainer
-scelta di un idoneo anticoagulante
-volume adeguato (nel soggetto a rischio, in caso di sepsi il numero di batteri presenti
nel sangue circolante dell’ adulto non è tanto elevato, ma intorno alle 100 unità formanti
colonie per ml, quindi, per fare un’ emocoltura dobbiamo fare un prelievo notevole
intorno ai 20 ml di sangue; nel bambino, in cui i microrganismi in circolo assumono una
carica notevole, in corso di sepsi possiamo effettuare un prelievo che varia da 1 e ½ a
max 5 ml di sangue.)
-numero di campionamenti (dipende dalla situazione clinica del soggetto, poiché
se il soggetto è in sepsi grave bisogna intervenire con una terapia empirica, ossia
ragionata, cioè che deve tenere conto della epidemiologia del reparto. Infatti, sappiamo
che esistono alcuni microrganismi che sono maggiormente presenti in certi reparti, ad
esempio in terapia intensiva abbiamo i cosiddetti microrganismi ALERT o microrganismi
“sentinella”, che sono microrganismi ambientali, ma estremamente resistenti come
Pseudomonas, Acinetobacter, Borgodelia Sebacea. Per cui è necessario intervenire
subito con la terapia senza aspettare i risultati del laboratorio, per cui, si fa un unico
prelievo prima della somministrazione dell’ antibiotico, che deve essere eseguito su
entrambe le braccia, poiché nel caso ci fosse un minimo di contaminazione , se lo
stesso germe lo riscontriamo su tutte e due i campioni, è più facile che sia quello
responsabile della sepsi, se lo troviamo su di uno solo è più facile che si tratti di una
contaminazione.)
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-tempi di campionamento (l’ importante è che il prelievo venga fatto prima
dell’ acme febbrile, dato che dall’ acme febbrile i microrganismi sono meno presenti,
poiché sono molto sensibili all’ aumento della febbre. Quindi bisogna farlo quando
comincia il brivido, poiché la batteriemia ha un picco prima dell’ acme febbrile.)
-notazione di eventuale trattamento antibiotico (se il paziente è già in trattamento
antibiotico, il prelievo lo facciamo alla fine del tempo di attività dell’ antibiotico, prima
della somministrazione della nuova dose di antibiotico, poiché in quel tempo l’ antibiotico
non dovrebbe essere più presente in circolo.
Emocoltura
Semina e incubazione (tradizionale)
-semina in terreni liquidi bifasici, in aerobiosi e in anaerobiosi
-scelta del terreno idoneo allo sviluppo di germi esigenti
-scelta di un terreno elettivo per ricerche mirate
-osservazione della coltura con sub-colture quotidiane per 7-10 gg
N.B. Ad eccezione della sepsi da catetere venoso che è di tipo continuo, di solito le
sepsi sono intermittenti, quindi, si preferisce fare almeno 3 campionamenti nel giro delle
24 ore per identificare il microrganismo.
Emocoltura
Metodi automatizzati
-rivelazione colorimetrica della crescita (Bact Alert) : va a verificare la
produzione di CO2 con un indicatore che cambia colore del prodotto di CO2 , questo ci
dice che è iniziata una crescita batterica che possiamo ricavare attraverso sistemi
computerizzati.
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-rivelazione della crescita per fluorescenza (Vital)
-metodo radiometrico (Bactet): consiste nell’ utilizzare una sorgente radioattiva, di
solito un carbonio 13, che quando viene utilizzato con glicerolo e glicogeno darà origine
ad eliminazione di CO2, che verrà subito valutata attraverso un apparecchio e poi
marcata.
“I metodi automatizzati sono sistemi che consentono di avere in tempi più brevi la
risposta poiché amplificano i segnali di crescita.”
Bact/Alert
Tecnologia di lettura
La tecnologia di lettura del Sistema Bact/Alert è basata su un metodo
colorimetrico sensibile alla produzione di CO2 (variazione del PH), che
determina il cambiamento di colore del sensore che viene rilevato ed analizzato
dallo strumento.
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Emocoltura
Vantaggi dei metodi automatizzati
-ridotto pericolo per l’ operatore
-terreni ricchi in grado di far crescere germi esigenti
-elevata sensibilità e specificità
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Emocoltura
Interpretazione
-contaminazione da
Propionibacterium)
batteri
cutanei
(S.
epidermidis,
Corinebatteri,
-carica microbica (se è bassa è più facile che si tratti di una contaminazione; ci sono
microrganismi come lo S. epidermidis che può essere responsabile di sepsi sui cateteri
venosi, quindi trovarlo non è una situazione di contaminazione, per cui bisogna stare
attenti!)
-ripetuta positività (quando è possibile facciamo 3 prelievi nelle 24 ore, se le
positività si ripetono è più facile che si tratti di sepsi e non di contaminazione.)
Emocoltura
Interpretazione risultati: come identificare i falsi
positivi (aspetti microbiologici)
-Positività per flora cutanea
-Positività per flora polimicrobica
-Positività tardiva (cioè il microorganismo cresce molto lentamente)
Emocoltura
Interpretazione risultati : falsi negativi
-Terapia
antimicrobica (non viene segnalata al laboratorio e così i germi non
crescono e l’ emocoltura risulta negativa)
-Germi “difficili”
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-Germi con esigenze colturali diverse (bisogna stare attenti nell’ utilizzare dei
terreni che vadano bene a tutti i microrganismi)
Micobatteri,
Legionelle,
Forme L,Virus.
Coxiella
burneti,
Clamidie,
(Miceti),
Il tempo di incubazione dipende dai microorganismi!
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Oggi abbiamo la possibilità di ricorrere ad un metodo di indagine molecolare
che fa parte delle tecniche innovative. Si tratta di una reazione di
polimerizzazione a catena, che attraverso l’ amplificazione del DNA e quindi
del genoma dei batteri, di virus, di miceti, consente di fare una diagnosi rapida e
nel giro di 6 ore riusciamo ad identificare i 25 più importanti funghi e batteri
causa di sepsi. Questo sistema rispetto all’ emocoltura consente di evidenziare il
DNA batterico libero, nel senso che, se il microrganismo si è lisato non in
coltura non lo troviamo più, ma troviamo il DNA di questo microrganismo in
circolo amplificando il DNA. Con questo metodo possiamo ricercare batteri e
funghi vitali, ma questo lo fa anche l’ emocoltura, batteri e funghi non vitali,
che riusciamo ad identificare poiché ci riferiamo al DNA, ancora batteri e
funghi fagocitati, cosa che fa sia il Septifast e sia l’ emocoltura, e in questo
caso dobbiamo sottoporre il campione a lisi prima di fare il Septifast o prima di
inocularlo nel terreno di coltura. Ovviamente l’ identificazione con PCR è
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veloce, bastano 6 ore, con la coltura ci vogliono almeno 24 ore, ed in caso di
particolari microrganismi ci vogliono più giorni, addirittura si devono eseguire
varie subcolture e prima di dare una risposta negativa dobbiamo aspettare
almeno 10 giorni.
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