Alterazioni del differenziamento sessuale: vie metaboliche e genetiche

UNIVERSITA’ DEGLI STUDI La Sapienza di Roma
FACOLTA’ DI MEDICINA E CHIRURGIA I
Dipartimento di Pediatria
UOC Terapia Intensiva Neonatale
UOC Pediatria d’Urgenza e Terapia Intensiva Pediatrica
-------------------------------------------------------------------------------------------------Master Universitario di II livello in
Terapia Intensiva Neonatale e Pediatrica
ALTERAZIONI DEL DIFFERENZIAMENTO
SESSUALE:VIE METABOLICHE E
GENETICHE. CASI CLINICI PARADIGMATICI
Relatore:
Chiar.mo Prof. Corrado MORETTI
Candidato
Dott.ssa Maria Gabriella BURATTINI
La determinazione sessuale, che dipende dall’assetto cromosomico dell’embrione,
viene stabilito da molteplici eventi molecolari che dirigono lo sviluppo delle cellule
germinali, la loro migrazione verso la plica urogenitale e la formazione di testicoli
(in presenza del cromosoma Y) o di ovaie (in presenza del cromosomaXX)
La determinazione sessuale pone le basi per la differenziazione sessuale e per
la risposta sesso-specifica dei tessuti agli ormoni prodotti dalle gonadi che si
sono differenziate.
Sono stati scoperti numerosi geni che contribuiscono sia al processo precoce
della determinazione e differenziazione sessuale sia al processo tardivo.
… Un po’ di storia
I cromosomi sessuali dei mammiferi si sono evoluti da una
coppia di OMOLOGHI ANCESTRALI MONOMORFI per
riduzione progressiva di uno degli omologhi che avrebbe poi
dato origine al CROMOSOMA Y
Molti dei geni inizialmente
presenti sul cromosoma Y
sono stati trasferiti sul
cromosoma X durante il
processo evolutivo che ha
reso eteromorfa la coppia
dei cromosomi sessuali
DETERMINAZIONE
DEL SESSO MASCHILE
indispensabile
Gene SRY
(Sex Determining Region del braccio corto cromosoma Y)
L’espressione di SRY deve raggiungere un
determinato livello soglia in un periodo di
tempo ben definito, nei precursori delle
cellule di sostegno,
altrimenti in tali
cellule si avvia la formazione delle ovaie.
la sua assenza determina la
differenziazione in senso femminile
XY
XX
TESTICOLO
SRY (TDF)
OVAIO
SRY: meccanismo d’azione
• Sry codifica per una proteina che presenta un
dominio di legame con il DNA di circa 70
amminoacidi.
• Questo legame è caratteristico delle proteine High
Mobility Group e perciò chiamato HMG box.
• Si pensa che la proteina si leghi alle regioni
regolatorie di altri geni che intervengono nel
differenziamento delle gonadi, a valle di Sry, e nei
confronti dei quali Sry svolgerebbe dunque la
funzione di regolatore trascrizionale.
GENI DELLA DIFFERENZIAZIONE
SESSUALE
A valle della cascata enzimatica guidata da SRY
esistono altri fattori quali
SOX 9, SOX 8, DAX1, FGF9 importanti nella
differenziazione e nella funzione delle cellule del
Sertoli.
Sox 9 agisce precocemente nella via di
determinazione del sesso in senso maschile.
Altri geni sono stati individuati sul cromosoma Y che controllano aspetti
diversi dello sviluppo sessuale:
• AZF(azoospermia factor)
• GCY(growth control Y)
• GBY (gonadoblastoma)
maturazione testicolare e spermatogenesi
crescita staturale non mediata da ormoni
oncogene nella disgenesia gonadica
… in letteratura
La HMG box di Sry è altamente conservata in tutti i mammiferi in cui è stata
sequenziata.
Sono state descritte molte mutazioni della HMG box della proteina
SRY umana, in femmine XY (reversione del sesso).
Nessun polimorfismo è stato trovato nel dominio HMG di maschi
normali.
La sequenza della HMG box, quindi, è
determinante per lo sviluppo del sesso maschile,
in quanto ogni sua variazione produce
alterazioni della proteina le quali, inficiandone la
funzione, risultano in reversione del sesso.
GONADE BIPOTENTE
TESTICOLO
(compare intorno alla V settimana)
OVAIO
 CELLULE GERMINATIVE (sacco vitellino → creste)
⇒ spermatogoni
⇒ oociti
 CELLULE MESENCHIMALI
 CELLULE MESODERMICHE
⇒ cell. Leydig
⇒ cell. Sertoli
⇒ cell. Teca e stroma
⇒ cell. Granulosa
Stadio bipotenziale
Alla sesta settimana gli organi
riproduttivi hanno la potenzialità di
svilupparsi in strutture maschili o
femminili
La proteina SRY indirizza la gonade a
trasformarsi nei testicoli che producono
testesterone e MIFche provoca la
degenerazione del dotto di Muller
L’assenza di MIFpermette alla gonade di
trasformarsi nelle strutture femminili.
Il dotto di Wollf degenera
Nel maschio
Cresta genitale
WT1 – SF1
WT1 – SF1
Gonade bipotenziale
MASCHIO
FEMMINA
SRY
SOX9
FOXL2
SRY – SOX9
Testicolo
INSL3/LGR8
Discesa
nello scroto
DAX1
WNT4
Ovaio
Nelle femmine non vi sono geni
e fattori essenziali per la
differenziazione del fenotipo F
durante lo sviluppo fetale e
prepuberale.
La iperespressione di
alcuni geni, quale DAX1
e WNT4, ha un effetto
anti-testicolare
sopprimendo l’effetto di
SRY
e
SOX9
e
determinando lo sviluppo
di una femmina XY sexreversal.
DIFFERENZIAZIONE
SECONDARIA
MIF
Dotti di Muller:
 tube
T
Dotti di Wolff:
 vasi deferenti
 epididimo
 vescicole seminali
 utero
 III sup. vagina
Classificazione delle
ambiguità sessuali
Disturbi della differenziazione genitale
• Pseudoermafroditismo maschile
Errori congeniti della biosintesi del testosterone
Deficit 5-α-reduttasi
Resistenza periferica agli androgeni
• Pseudoermafroditismo femminile
Iperplasia surrenalica congenita
Assunzione o produzione materna (tumori) ormoni a
eff.virilizzante
IERI
OGGI
DSD
Intersessualita
Pseudoermafroditismo maschile
Ridotta virilizzazione e
mascolinizzazione del maschio XY
46, XY DSD
Pseudoermafroditismo femminile
Eccessiva virilizzazione e
mascolinizzazione della femmina XX
46, XX DSD
Ermafroditismo vero
DSD ovotesticolare
Maschio XX o XX sex reversal
DSD testicolare 46,XX
Femmine XY sex
reversal
Disgenesia gonadica
completa 46,XY
DSD dei Cromosomi sessuali
46,XY DSD
46,XX DSD
45,X(sindrome di Turner e varianti)
Disordini nello sviluppo del testicolo:
(1) disgenesia gonadica completa
(sindrome di Swyer); (2) disgenesia
gonadica parziale; (3) regressione
gonadale; (4) DSD ovotestis
Disordini nello sviluppo dell’ovaio:
(1)DSD ovotestis; (2)DSD
testicolare(es.SRY+,duplicazioni di
SOX9); (3)disgenesia gonadica.
47,XXY (sindrome di Klinefelter e
varianti)
Disordini nella sintesi o nell’azione
degli androgeni:
(1) Difetti nella sintesi degli
androgeni (es. 17-OH steroido
deidrogenasi, 5αRD2, mutazioni
StAR);
(2) (2) Difetti nell’azione degli
androgeni (es. CAIS, PAIS);
(3) Difetti del recettore dell’ormone
luteinizzante (es. ipoplasia-aplasia
delle cellule di Leydig);
(1) (4) Disordini dell’ormone
antimuleriano e del recettore
antimuleriano (sindrome da
persistenza dei dotti di Müller)
45,X/46,XY (MGD, DSD ovotestis)
Eccesso di androgeni:
(1) fetali (es deficit di 21idrossilasi;
(2) fetoplacentari (deficit di
aromatasi ,POR[P450
ossidoreduttasi])e
(3) materni (luteoma,
farmaci ecc.)
Altri (es.estrofia della cloaca,atrofia
vaginale,MURCS[anomalie dei
dotti di Muller,dei reni,delle
vertebre cervicotoraciche],altre
sindromi.
46, XY DSD
 DIFETTO SINTESI TESTOSTERONE
 INSENSIBILITA’ PERIFERICA AGLI
ANDROGENI
 DEFICIT 5aR
46, XX DSD
 IPERPLASIA SURRENALICA CONGENITA
 FARMACI VIRILIZZANTI ASSUNTI DALLA
MADRE
(medrossiprogesterone, danazolo)
 TUMORI VIRILIZZANTI
– MATERNI O FETALI (tumori ovarici, surrenalici)
DSD 46,XX da eccesso di
androgeni
L’esposizione in utero agli androgeni determina
dopo la 12a settimana di gestazione
esclusivamente ipertrofia clitoridea
nelle fasi più precoci della differenziazione
persistenza del seno urogenitale e
fusione labioscrotale
se sufficientemente precoce, la fusione
delle labbra permette la formazione di
uretra peniena
Grumbach MM & Conte FA 1992
 46, XX DSD
Genitali Interni Femminili
Genitali Esterni:
- Clitoromegalia isolata
- Completa fusione labioscrotale
 46, XY DSD
Genitali Interni Maschili
Genitali Esterni:
-Aspetto completamente femminile
(Sindrome Morris o Femminilizzazione
Testicolare Completa)
- Ipospadia
QUADRI
CLINICI
… LA CLINICA
… Amoebas at start were not complex: they tore
themselves and started sex
(Arthur Guiterman)
DIAGNOSI
 Anamnesi familiare
 Esame obiettivo
 Esami di laboratorio e strumentali:
- cariotipo
- elettroliti
- dosaggi ormonali: 17-OHP, T, DHT,DHEAS,Androstenedione, ACTH
- ecopelvi
- genitografia o laparoscopia
colesterolo
1
Δ5 pregnenolone
2
Δ4 progesterone
3
3
17-OH
pregnenolone
4
11 desossicorticosterone
DOC
6
corticosterone
(composto B)
7
18 idrossicorticosterone
8
5
2
2
17-OH
progesterone
5
Δ4androste
nedione
4
11 desossicotisolo
(composto S)
10
estrone
3
9
testosterone
10
6
17-β
estradiolo
cortisolo
1: 20,22 desmolasi
2: 3-β ol-deidrogenasi
tutti
3: 17-α idrossilasi (gene unico codifica enzima anche con attività n. 5:
pazienti con uno od entrambi i difetti)
aldosterone
DHEA-S
DHEA
glicocorticoidi e sessuali
4: 21 idrossilasi
6: 11- β idrossilasi
glico-mineralcorticoidi
7: 18 idrossilasi
8: 18 deidrogenasi
mineralcorticoidi
5: 17,20 desmolasi
9: 17-βOH steroido-deidrogenasi
10: aromatasi
sessuali
SINTOMATOLOGIA delle DIFFERENTI
FORME di DEFICIT ENZIMI SURRENALI
20, 22 desmolasi
3-β
idrossisteroidodeidrogenasi
17-α idrossilasi
21 idrossilasi
Blocco sintesi glico-mineralcorticoidi (accumulo 17-α OHP)
M: genitali esterni normali F: virilizzazione genitali esterni di vario grado
Entrambi i sessi:
possibile perdita di sali dopo il 4°-5° g di vita a sintomatologia variabile
possibile ipertensione
11-β idrossilasi
17-20 desmolasi
17-β OHsteroido-deidrogenasi
i
DEFICIT 21
IDROSSILASI
…alla
nascita
• nel sesso femminile:
ambiguità genitali esterni di grado variabile fino
all’aspetto di maschio con anorchia
Esame strumentale consigliato: ecografia pelvica
• nel sesso maschile:
assenza di sintomi
in entrambi i sessi
(potenzialmente letale):
oltre ai sintomi su descritti vomito e
dimagramento tardivi
(a partire dal 5°-6° giorno di vita)
DIAGNOSI GENETICA
CYP21: gene funzionale
CYP21P: pseudogene
SEDE: cromosoma 6p21.3
DIAGNOSI GENETICA
LOCUS CYP21 (6p21.3)
CYP21: gene funzionale
CYP21P: pseudogene
CYP21
CYP21P
CYP21
CYP21P
Gene e pseudogene, entrambi di 10 esoni, presentano una sequenza nucleotidica
omologa al 98% per la parte esonica e al 96% per la parte intronica.
NORMALE
+
ACTH
+ PREANDROGENI
+
CORTISOLO
+ ACTH
DEFICIT 21-OH
CORTISOLO
+
Rare
 Deficit 11 beta idrossilasi
 Deficit 3 beta idrossisteroido deidrogenasi
 5 alfa reduttasi
T
5 α REDUTTASI
DHT
Pene ⇐
TUBERCOLO GENITALE
⇒ Clitoride
Scroto ⇐
PLICHE LABIO SCROTALI
⇒ Grandi labbra
Uretra ⇐
PLICA URETRALE
⇒ Piccole labbra
FENOTIPO
MASCHILE
FENOTIPO
FEMMINILE
CASI CLINICI
… Amoebas at start were not complex: they tore
themselves and started sex
(Arthur Guiterman)
NAOMI
EG: 38 settimane, SGA
TC per diagnosi prenatale (24a sett.) di malformazione
cardiaca e dilatazione borderline IV ventricolo
Anamnesi OSTETRICA:
- Infezione materna da toxoplasma nel I trimestre
- Cariotipo materno: 46 XX t (2;9) (p13; p13)
- Cariotipo fetale (LA): 46 XY, -9, +der (9) t(2;9) (p13;
p13)
APGAR 5-7: ventilazione con AMBU
Esame obiettivo:
 cianosi
 tachipnea
 soffio 3/VI
 FENOTIPO FEMMINILE
 STIGMATE DISMORFICHE
(impianto basso delle orecchie, clinodattilia V )
⇒ Necessità di intubazione e somministrazione di
Surfattante dopo 2 ore dalla nascita
ESAMI DI LABORATORIO
 CARIOTIPO
46 XY, -9, +der (9) t(2;9) (p13; p13)
 TESTOSTERONE
66.4 ng/dl (v.n . O<20
 Androstenedione
nella norma
 DHEA
+
nella norma
 17-OH-P
nella norma
hCG test: NON INCREMENTO DEI LIVELLI DI T E DHT
 Studio SRY e cromosoma 9
O 100+500)
IPOTESI DIAGNOSTICHE
Fenotipo genitale femminile
con derivati mulleriani presenti
MUTAZIONE GENE SRY
MUTAZIONI DI GENI COINVOLTI
DIFFERENZIAZIONE TESTICOLARE
SU CROMOSOMA 9 ?
DELEZIONE 9p24 → regola lo sviluppo del testicolo ?
DELEZIONE 10q26-q ter → reversione sessuale ?
NELLA
DESCRIZIONE DI MASCHI XX,
ERMAFRODITI…IN LETTERATURA
FEMMINE
Non riferiti ad alterazioni del cromosoma 9
 Berger et al, 1970
 Kasdan et al, 1973
 Skordis et al, 1987
 De la Chapelle et al, 1987
 Kuhnle et al, 1993
Riferiti ad alterazioni del cromosoma 9
 Affara et al, 1989
 Hoo et al, 1989
 Bennet et al, 1993
 Ion et al, 1998
 Fleiter et al, 1998
 Guioli et al, 1998
 Veiol et al, 1998
XY
ED
Alessandro
• M.A. nato a termine, da parto eutocico, alla nascita presentava ipotonia
generalizzata e rime palbebrali lievemente rivolte verso l’alto: sospettata
sindrome di Down.
• All’esame obiettivo, i genitali esterni
venivano descritti come maschili
normali.
• E’ stato quindi eseguito un
• Gli esami strumentali
(Ecorenale ed Ecoencefalo)
sono risultati nella norma.
cariotipo di tipo femminile:
46,XX.
• E’ stato ricontrollato il corredo cromosomico e confermata la
presenza di un cariotipo femminile normale.
E’ stata eseguita quindi la ricerca di
sequenze Y specifiche: gene AMEL ed
amplificazione SRY
Amplificazione di AMEL e SRY
SRY
AMEL
XY
XX
556/07
XY
M
556/07
M
Analisi delle microdelezioni del cromosoma Y. .
Yp
ZFY
SRY
sY254
Yq sY86
sY127
Yp
Yq
ZFY
SRY
sY84
sY134
sY255
XX
XY
556/07
XX= femmina controllo
XY= maschio controllo
FISH con sonda specifica di SRY (segnale rosso) che evidenzia il trasferimento del
gene sull'estremità distale del braccio corto di un cromosoma X.
Lucia
 E. L. nata a termine da parto cesareo, presentava alla
nascita: genitali esterni
dismorfismi facciali
ambigui
ed
atresia
anale,
• Esami strumentali: Eco encefalo, reni e cuore nella
norma, RMN non capace d’ individuare a livello
perineale i meati
di uretra, vagina e canale anale
• Intervento chirurgico: meato comune urinario-digestivo
• Cariotipo femminile normale
• Analisi molecolare del DNA negativa per geni cromosoma Y
Sospetto clinico di SAG (virilizzazione genitali esterni) →
dosaggio
17 OH-progesterone
Esami di laboratorio
 Dosaggio 17OH-progesterone elevato
 Altri ormoni surrenalici nella norma
Ricerca gene CYP 21 (specifico SAG):
NEGATIVA
+
Drop-out
CASO non risolto
PUNTI OSCURI
 Rimangono ancora oggi senza una spiegazione a
livello molecolare la maggior parte dei casi di
inversione del sesso XY, di inversione XX SRY –
negativa e di ermafroditismo.
• E’ necessario identificare nuovi geni o mutazioni
fuori delle regioni codificanti, dei geni conosciuti.
• I progressi di questi ultimi anni lasciano solo
intravedere la complessità dello sviluppo
dell’apparato riproduttivo.
• La comprensione del meccanismo d’azione dei geni
che governano il differenziamento e lo sviluppo
embrionale resta forse la sfida più affascinante della
genetica molecolare.
Prospettive future
La sfida è trovare:
 i membri specifici di ogni famiglia che
sono unici per ogni sistema particolare
 i geni target tessutali specifici che sono
regolati tramite questa rete comune
GRAZIE
PER L’ATTENZIONE