Le principali strategie di regolazione

Le principali strategie di
regolazione dell’espressione
genica nei procarioti
Regolazione metabolica
Nel genoma di un microorganismo sono presenti migliaia di geni
(3000--6000).
(3000
Alcuni geni vengono espressi continuamente (geni costitutivi);
altri solo quando è necessario (geni regolati).


ENZIMI COSTITUTIVI (metabolismo del glucosio)
glucosio)
ENZIMI INDUCIBILI (prodotti in presenza del substrato
es. β–galattosidasi nel metabolismo del lattosio)
Regolazione metabolica
Gli organismi sono in grado di regolare l’espressione dei propri geni
in modo che le proteine, e le altre molecole, vengano sintetizzate
nella quantità esatta e nel momento esatto del ciclo cellulare.
I MECCANISMI DI REGOLAZIONE
Consentono alla cellula di produrre proteine
(enzimi) solo quando servono
ECONOMIA CELLULARE
Meccanismi utilizzati nella regolazione
Nella cellula ci sono due strategie principali di regolazione:
Controllo dell’attività di un enzima, dopo che la proteina è stata sintetizzata (regolazione
post-traduzionale)
Controllo della quantità sintetizzata di enzima, variando la quantità di mRNA oppure di
proteina prodotti (regolazione della trascrizione e regolazione della traduzione)
Controllo dell’attività di un enzima
Inibizione dovuta a cambiamenti nell’enzima di tipo:


covalente (adenilazione, processamento delle proteine)
non covalente (inibizione da feedback o retroazione ;
isoenzimi)
Inibizione da feedback dell’attività enzimatica
Meccanismo tipico della regolazione di intere
vie biosintetiche che coinvolgono diversi
passaggi enzimatici.
Il prodotto finale (es. amminoacido, nucleotide, etc.) è
in grado di retroagire sul primo passaggio
nella via biosintetica e di regolare la propria
biosintesi (autoregolazione).
Il prodotto finale inibendo il primo enzima della via
inibisce tutta la via biosintetica in quanto non vengono più
generati gli intermedi necessari come substrato per gli altri
enzimi coinvolti nel processo.
L’inibizione da feedback E’ REVERSIBILE:
la sintesi riprende quando il prodotto finale si esaurisce
Allosteria
L’inibizione da feedback è resa possibile
da una proprietà dell’enzima definita
ALLOSTERIA.
Un enzima allosterico possiede un sito
attivo che lega il substrato e un sito
allosterico dove si lega in modo reversibile
l’inibitore.
Quando un inibitore si lega al sito
allosterico, la conformazione dell’enzima
cambia ed il substrato non riesce più a
legarsi efficientemente al sito attivo.
Quando la concentrazione di inibitore
diminuisce, si dissocia dal sito allosterico
ed il sito attivo ritorna nella sua forma
catalitica.
Inibizione da feedback
in una via biosintetica ramificata
N-acetil glutamato
sintetasi
g-glutamil
chinasi
Gli enzimi allosterici sono molto importanti nelle vie biosintetiche ramificate.
Prolina e arginina sono sintetizzate a partire dall’acido glutamico.
Questi due aminoacidi possono controllare il primo enzima specifico (evidenziati in rosso) per
la propria sintesi senza interferire con gli altri, in modo che, ad esempio l’eccesso di prolina
non provochi nell’organismo una carenza di arginina.
Isoenzimi ed inibizione da feedback
3-deossi-D-arabinoeptulosonato 7-fosfato
ISOENZIMI:
Proteine diverse
che catalizzano la
stessa reazione
ma soggette a
sistemi di
regolazione
indipendenti
SINTESI AMINOACIDI AROMATICI IN E. COLI
In E. coli 3 diversi isoenzimi con attività di DAHP sintetasi catalizzano la prima reazione della
via biosintetica. Ognuno di questi enzimi è specificamente retroinibito da uno dei tre aminoacidi
aromatici. In questo caso è richiesto un eccesso di tutti e tre i prodotti di reazione per spegnere
completamente la sintesi di DAHP
Modificazioni covalenti degli enzimi
I più comuni meccanismi di modificazioni enzimatica covalenti:



ADENILAZIONE: legame di un nucleotide adenosinmonofosfato (AMP
(AMP)) o
adenosindifosfato (ADP
(ADP))
FOSFORILAZIONE: legame di un gruppo fosfato (PO
(PO42-)
METILAZIONE: legame di un gruppo metilico (CH
(CH3)
Sono processi rapidamente reversibili
Il legame del gruppo modificante provoca un cambiamento conformazionale
della proteina e può alterarne profondamente l’attività catalitica.
La rimozione del gruppo modificante ripristina l’enzima nel suo stato attivo.
Regolazione della glutamina sintetasi
La glutamina sintetasi (GS) è un enzima che svolge un ruolo chiave nel
metabolismo dell’azoto nella cellula.
L’attività della GS può essere controllata mediante:

Inibizione da feedback concertata: ad opera di 9 composti
diversi (aa, prodotti del metabolismo nucleotidico). L’attività
enzimatica si riduce proporzionalmente al numero di inibitori
presenti: la presenza di tutti e nove gli inibitori determina
l’inibizione completa

Adenilazione: modificazione covalente
La glutamina sintetasi e l’adenilazione
PPi
ATP
GS
GS-AMP
(1-12)
Glutamina
AMP
ADP
Pi
Il controllo della GS mediante modificazione covalente è determinato dalla
concentrazione di glutamina e di un precursore della glutamina
glutamina,, l’a
l’a-chetoglutarato
chetoglutarato,, un
intermedio del ciclo dell’acido citrico.
Quando il livello di glutamina nella cellula diminuisce
diminuisce,, l’enzima che aggiunge e rimuove i
gruppi AMP (enzima PII) viene modificato covalentemente e promuove la
deadenilazione della GS, e di conseguenza, un aumento della sua attività.
attività.
Quando la concentrazione intracellulare di glutamina aumenta, la GS viene
fortemente adenilata e la sua attività diminuisce.
La glutamina sintetasi e l’adenilazione
l’adenilazione
Ogni molecola di GS contiene 12 subunità identiche
identiche,, e ognuna di queste può essere
adenilata..
adenilata
Quando l’enzima è completamente adenilato
adenilato(contiene
(contiene 12 gruppi AMP), è totalmente
inattivo, quando è parzialmente adenilato
adenilato,, è parzialmente attivo.
La glutamina sintetasi e l’adenilazione
l’adenilazione
I livelli di attività della GS possono essere considerati per la
cellula una specie di barometro ad azoto:
N
GS
Livelli di azoto
Attività glutamina sintetasi
E VICEVERSA
Splicing delle proteine
Anche nei procarioti esistono alcuni rari geni con introni.
Recentemente sono stati individuati numerosi casi in cui l’informazione “extra” viene
rimossa a livello della proteina e non dell’RNA.
Il processo è stato definito “splicing delle proteine”, e la parte proteica interna che
viene rimossa è stata chiamata inteina.
Nel processamento della subunità A della DNA girasi di M. leprae,
codificata dal gene gyrA, le sequenze fiancheggianti del polipeptide GyrA, chiamate esteine,
vengono riunite per formare la forma attiva della proteina, mentre le inteine vengono scartate.
Le inteine sono proteasi specifiche self-splicing (autoprocessanti).
RUOLO INTEINE?
La regolazione della trascrizione

Controllo positivo: (operone maltosio)
L’elemento di controllo, una proteina regolatrice, promuove il
legame dell’RNA polimerasi determinando un aumento
della sintesi di mRNA

Controllo negativo: repressione (operone arginina)
ed induzione (operone
(operone lattosio)
L’elemento di controllo, il repressore, inibisce la sintesi
dell’mRNA
Le proteine che legano il DNA
Le interazioni tra proteine ed acidi nuclei sono
essenziali per la replicazione, la
trascrizione, la traduzione, nonché per la
regolazione di tali processi.
1.
2.
INTERAZIONI ASPECIFICHE
INTERAZIONI SEQUENZASEQUENZASPECIFICA
Le sequenze ripetute invertite costituiscono
spesso siti specifici di legame per le proteine.
Le proteine che interagiscono con il DNA
sono spesso omodimeri, composte da due
catene polipetidiche identiche. Su ogni catena
polipeptidica c’è un dominio di legame al
DNA che si inserisce nel solco maggiore e
lungo l’impalcatura di fosfato e un dominio
di interazione proteina-proteina che tiene
insieme le due catene del dimero.
Sequenza nucleotitica della regione operatore
dell’operone lattosio legata dal repressore lac
Struttura delle proteine che legano il DNA
Classi di domini proteici di fondamentale importanza per
la formazione del corretto legame con il DNA:



Helix-turn
Helixturn--helix (elica(elica-giro
giro--elica)
Zinc finger (dito di zinco)
Leucine zipper (cerniera di leucine)
Struttura helixhelix-turn
turn--helix
Il motivo strutturale helix
helix--turn
turn--helix
possiede:

Un’ elica di riconoscimento (aelica) che interagisce con il DNA

Una breve sequenza di tre aa
aa,, il

primo dei quali è generalmente una
glicina con la funzione di “girare la
proteina”, ovvero di curvarla a gomito
Un’elica stabilizzante,
stabilizzante, che stabilizza
la prima interagendo con essa
idrofobicamente e partecipando alla
formazione del dimero.
Il riconoscimento di sequenze specifiche nel DNA avviene tramite interazioni non covalenti
che comportano la formazione di legami idrogeno ed interazioni di van der Waals.
Nei Batteri ci sono diverse proteine con questo motivo:
tra cui molti repressori (sistemi lac e trp di E. coli; repressore del batteriofago l)
Oltre 250 proteine con questo motivo si legano al DNA per regolare la trascrizione in E. coli.
Modello delle substrutture proteiche che si trovano
nelle proteine eucariotiche che legano il DNA
Nel motivo zinc finger tra gli aa che
legano lo ione Zn2+ vi sono
sempre almeno due residui di
cisteina (C), mentre gli altri residui
sono generalmente istidine (H).
Nel motivo leucine zipper i residui
di leucina sono regolarmente
ripetuti ogni sette aa formando una
struttura simile ad una cerniera
lampo. La cerniera di leucine serve
a tenere unite due eliche di
riconoscimento che interagiscono
con il DNA
Il controllo negativo della trascrizione
Nei batteri sono noti diversi meccanismi per il
controllo della sintesi di un enzima e tutti sono
ampiamente influenzati dall’ambiente nel quale
l’organismo cresce ed in particolare dalla presenza o
assenza di piccole molecole specifiche (come quelle che
legano il DNA) per controllare la trascrizione o più
raramente la traduzione.
La repressione e l’induzione rappresentano le forme
più semplici di regolazione che controllano
l’espressione genica a livello della trascrizione.
Repressione dell’attività enzimatica
La repressione enzimatica è un
fenomeno ampiamente diffuso nei batteri e
viene utilizzato nel controllo della sintesi di
vari enzimi coinvolti nella biosintesi di
aminoacidi, purine e pirimidine.
In quasi tutti i casi è il prodotto finale di una
particolare via biosintetica a reprimere gli
enzimi della stessa.
Si può ovviamente intuire quanto sia
importante questo processo per il
microrganismo, dato che gli permette di
non sprecare energia sintetizzando
enzimi non necessari.
Gli enzimi coinvolti nella sintesi dell’ arginina sono sintetizzati soltanto se l’arginina è
assente nel mezzo di crescita; l’aggiunta di arginina nel mezzo reprime la loro sintesi.
E’da notare, come questo sia un effetto specifico, in quanto la sintesi di tutti gli altri enzimi continua
regolarmente.
Induzione dell’attività enzimatica
Un fenomeno complementare alla repressione è l’induzione di un enzima,
enzima, ovvero la
sintesi di un particolare enzima solo quando è presente il suo substrato.
Gli enzimi coinvolti nel catabolismo del carbonio
o di altre fonti di energia sono spesso
inducibili.
Tipico esempio è dato dall’enzima
b -galattosidasi
galattosidasi,, coinvolto nella utilizzazione
del lattosio, che non viene sintetizzato se
lo zucchero è assente nel mezzo, mentre
la sintesi inizia non appena al terreno
viene aggiunto lattosio.
Anche in questo caso si può facilmente
comprendere il valore di tale
meccanismo, dal momento che esso
permette all’organismo di non
sintetizzare un enzima fino a quando non
gli sia necessario.
L’induttore ed il corepressore
EFFETTORI
Induttore: sostanza che dà inizio all’induzione di un enzima
Corepressore:: sostanza che reprime la sintesi di un enzima
Corepressore
Gli induttori e i corepressori in genere agiscono in modo indiretto,
indiretto,
combinandosi con specifiche proteine di regolazione che a loro volta
influenzano la sintesi di mRNA
mRNA..
Non tutti gli effettori sono substrato o prodotti finali degli specifici enzimi
regolati.
Alcuni analoghi di queste sostanze sono in grado di provocare l’induzione o la
repressione di un enzima senza esserne il substrato.
 L’
L’isopropiltiogalattoside
isopropiltiogalattoside (IPTG), per esempio, è un induttore della bgalattosidasi,, pur non essendo idrolizzato dall’enzima stesso.
galattosidasi
Regolazione dell’operone arginina
Nel caso di un enzima reprimibile, il corepressore (per esempio l’arginina) si lega alla proteina
repressore specifica (il repressore dell’arginina). Il repressore è una proteina allosterica la cui
conformazione può venire modificata in seguito al legame con il corepressore.
Una volta modificato, il repressore può legarsi a una regione specifica di DNA vicina al promotore
del gene stesso, la regione operatore che deve il suo nome all’operone, gruppo di geni la cui
espressione è sotto il controllo di un singolo promotore. Se il repressore si lega all’operatore,
la sintesi di mRNA è bloccata perché l’RNA polimerasi non si può legare o non può procedere
nella trascrizione e tutte le proteine codificate da quell’mRNA policistronico saranno represse.
Regolazione dell’operone lattosio
Anche l’induzione di un enzima può
essere controllata da un repressore;
in questo caso il repressore è
attivo in assenza dell’induttore e
capace quindi di bloccare la
sintesi di mRNA
mRNA..
Quando invece si aggiunge l’induttore,
questo si lega al repressore
inattivandolo, rimuovendo il
blocco trascrizionale e
permettendo la sintesi dell’mRNA
dell’mRNA..
Nel caso dell’operone lac, il repressore è
costituito dal repressore lac e l’induttore
dall’allolattosio
Dal momento che il ruolo dei
repressori è inibitorio
(reprimono la sintesi
dell’mRNA
dell’
mRNA),
), il tipo di
regolazione che li coinvolge
viene spesso definito
controllo negativo.
negativo.
Regolazione dell’operone maltosio


In assenza di induttore (maltosio)


In presenza di induttore (maltosio)
I geni necessari per l’utilizzazione del maltosio sono dispersi
in diversi operoni, ognuno dei quali possiede un sito di legame
dell’attivatore.

Quando diversi operoni si trovano sotto il controllo primario
della stessa proteina costituiscono un regulone.
Il catabolismo del maltosio in E.
coli è un tipico esempio di
sistema sottoposto a regolazione
positiva..
positiva
Gli enzimi necessari
all’utilizzazione del maltosio in E.
coli sono sintetizzati solo dopo
l’aggiunta di maltosio al mezzo.
La sintesi di questi enzimi è
controllata a livello trascrizionale
da una proteina attivatrice che
non può legarsi al DNA se prima
non si è legata al maltosio, il suo
induttore.
Il legame dell’attivatore al
DNA induce un cambiamento
della sua struttura e permette
alla RNA polimerasi di iniziare
la trascrizione.
trascrizione.
La sequenza specifica che serve
da sito di legame per l’attivatore si
chiama sito di legame
dell’attivatore.
Il controllo positivo
La proteina attivatrice può anche
interagire direttamente con l’RNA
polimerasi,
sia quando il sito di legame
dell’attivatore è vicino al
promotore,
sia quando è lontano, situazione
che richiede la formazione di
un’ansa per poter stabilire i contatti
necessari.
La proteina attivatrice, una volta legatasi al DNA, aiuta l’RNA polimerasi sia
a riconoscere il promotore sia ad iniziare la trascrizione.
Ad esempio, l’attivatore può indurre un cambiamento nella struttura del DNA, in
genere una curvatura, permettendo così all’RNA polimerasi di stabilire contatti
precisi con il promotore per iniziare la trascrizione.
La regolazione globale

Spesso, in risposta ad una variazione ambientale, un
organismo ha bisogno di regolare simultaneamente geni
diversi.
I meccanismi di regolazione che rispondono a
segnali ambientali sono definiti
sistemi di controllo globale.
globale.

Nell’ambiente in cui crescono le cellule batteriche, infatti,
possono essere presenti diverse fonti di carbonio utilizzabili e
sarebbe uno spreco indurre, gli enzimi per il catabolismo del
lattosio o del maltosio quando le cellule stanno utilizzando una
fonte di carbonio più facilmente metabolizzabile.
La repressione da catabolita
Il problema viene risolto da uno dei sistemi di
regolazione globale definito
repressione da catabolita.
catabolita.

Nella repressione da catabolita la sintesi di numerosi enzimi
viene inibita quando le cellule crescono in un terreno che
contiene una fonte di energia ottimale come il glucosio.

La repressione da catabolita è stata anche definita effetto
glucosio,, perché questa è stata la prima sostanza per la quale si è
glucosio
dimostrato il fenomeno; anche se è noto che diverse fonti di
carbonio determinano questo tipo di repressione.
Crescita diauxica
in presenza di una miscela di glucosio e lattosio
Una conseguenza della repressione da catabolita è la crescita diauxica che si osserva quando
due fonti di energia sono presenti contemporaneamente nel mezzo.
La repressione da catabolita permette alle cellule di utilizzare
subito la migliore fonte di carbonio, infatti, i batteri crescono
più rapidamente in presenza di glucosio.
Nella cresita diauxica,
diauxica, l’organismo cresce
prima utilizzando una fonte di energia (ad
esempio il glucosio), e segue poi un lungo
intervallo di tempo prima che la crescita
ricominci utilizzando la seconda fonte (ad
esempio lattosio).
Quando un microrganismo cresce in presenza
di una miscela di glucosio e lattosio, finchè
il glucosio è presente nel mezzo, la b galattosidasi,, codificata dal gene lacZ
galattosidasi
dell’operone lattosio e responsabile della
utilizzazione di questo zucchero, non
viene sintetizzata ed il microrganismo
utilizza solo il glucosio lasciando intatto il
lattosio.
Quando il glucosio è esaurito, la repressione
da catabolita finisce e dopo un certo
intervallo si osserva sintesi di bgalattosidasi e inizia la crescita basata sul
lattosio come fonte di carbonio.
La repressione da catabolita

La repressione da catabolita si basa sul controllo della trascrizione mediato da un
attivatore ed è quindi un tipo di controllo positivo.

Nel caso di enzimi reprimibili da parte del catabolita, il legame della RNA polimerasi al
DNA avviene solo quando si è legata un’altra proteina, chiamata attivatore proteico
del catabolita (CAP), che a sua volta può legarsi al DNA solo se prima si è legato
l’AMP ciclico, un elemento chiave in numerosi sistemi controllo.

L’entrata del glucosio nella cellula inibisce la sintesi dell’AMP ciclico e stimola il suo
trasporto al di fuori della cellula con riduzione della sua concentrazione intracellulare ed
inibizione del legame della RNA polimerasi ai promotori sensibili a questo tipo di
controllo.
La repressione da catabolita, quindi, è in realtà dovuta alla mancanza di AMP
ciclico nella cellula e può essere superata aggiungendo tale composto al terreno.
terreno.

La repressione da catabolita
Nonostante questo tipo di regolazione possa sembrare un semplice sistema di
controllo positivo, ognuno degli operoni controllati da CAP è anche soggetto a
regolazione da parte dei suoi regolatori specifici.
 Poiché la repressione da catabolita modula l’espressione di sistemi di
regolazione non correlati essa rappresenta uno dei principali esempi di
regolazione globale.
 Finchè è presente glucosio viene impedita l’espressione di tutti gli altri
operoni catabolici soggetti a questo elemento di controllo globale.

Affinché la trascrizione possa avvenire, devono essere rispettate due condizioni:
1. il ivello di AMP ciclico deve essere abbastanza elevato, in modo da
permettere alla proteina CAP di legarsi al sito di legame specifico
(controllo positivo);
2. deve essere presente un induttore, come il lattosio, in modo che il
repressore del lattosio non blocchi la trascrizione legandosi all’operatore
(controllo negativo).
Regolazione dell’operone lattosio
Il primo gene strutturale di questo operone , lacZ, codifica l’enzima b-galattosidasi che degrada
il lattosio. L’operone contiene altri due geni (lacY e lacA) coinvolti nel metabolismo del lattosio.
In figura è mostrata la regione regolatrice dell’operone. I due siti dell’operatore (dove si lega il
repressore lac) sono sequenze ripetute invertite. Sequenze ripetute invertite si ritrovano anche nel
sito di legame di CAP. E’ indicata la posizione delle sequenze -35 e la Pribnow box che fanno
parte del promotore. Viene indicata anche la posizione di due sequenze cruciali dell’mRNA
(Shine-Dalgarno ed il codone d’inizio).
L’attenuazione dell’operone triptofano in E. coli
Questo operone è soggetto in realtà a diversi tipi di regolazione: il primo enzima della via,
l’antranilato sintetasi è infatti, sottoposto all’inibizione da feedback da parte del triptofano,
triptofano, ed
inoltre la trascrizione dell’operone è sotto il controllo del repressore del triptofano.
triptofano.
L’operone triptofano contiene i geni strutturali
per cinque proteine della via biosintetica del
triptofano, oltre al promotore e alle sequenze
regolatrici localizzate all’inizio dell’operone.
Oltre al promotore P e all’operatore O c’è
una sequenza leader L che codifica un
polipeptide contenente residui di
triptofano ripetuti in tandem vicino
alla sua estremità terminale e operante
come attenuatore.
Se nella cellula è il triptofano è
abbondante, il peptide leader verrà
sintetizzato, determinando la
terminazione della trascrizione del
restante operone trp, che
comprende i geni strutturali per gli
enzimi biosintetici;
se invece il triptofano è scarso, il
peptide leader, che è ricco in
triptofano, non sarà prodotto, e la
trascrizione della restante parte
dell’operone potrà aver luogo.
L’attenuazione dell’operone triptofano
Per spiegare questo fenomeno bisogna tener conto che nelle cellule procariotiche i processi di traduzione e
trascrizione avvengono simultaneamente: mentre la trascrizione di regioni a valle è ancora in corso, è già iniziata
la traduzione delle regioni trascritte.
L’attenuazione ha luogo perché una parte dell’mRNA neosintetizzato si ripiega a formare
un’ansa a doppia elica, grazie alla presenza di sequenze complementari, seguita da una
sequenza di uracili che segnalano alla RNA polimerasi di cessare l’attività trascrizionale.
Se il triptofano è presente in abbondanza, il ribosoma potrà tradurre l’intero peptide leader
(codificato dalle regioni 1 e 2), e così la regione 2 non potrà appaiarsi con la regione 3. Le regioni
3 e 4 si appaieranno a formare una struttura ansaansa-stelo, che costituirà un sito di pausa della
trascrizione. Poi trovandosi a valle di questa sequenza un tratto ricco in uracile, si avrà la
terminazione.
L’attenuazione dell’operone triptofano


Se invece il triptofano è scarso, il
ribosoma rallenterà in
corrispondenza del codone
triptofano; la sosta del ribosoma in
questa posizione permetterà la
formazione di una struttura ansaansastelo alternativa (regione 22-regione
3) che non rappresenta un segnale di
terminazione e previene
efficacemente la formazione del vero
terminatore.
L’RNA polimerasi oltrepasserà il sito
di terminazione che non si è
correttamente ripiegato e inizierà la
trascrizione dei geni strutturali del
triptofano
I sistemi di regolazione a due componenti
Molti dei sistemi di regolazione tramite i quali
i batteri sono in grado di rilevare i segnali
ambientali e fornire una risposta sono
costituiti da due componeneti. Un sistema
classico a due componenti è costituito da:
1. Una proteina sensore (chinasi
sensore), locaizzata nelle membrana
cellulare e in grado di autofosforiularsi in
risposta a un segnale ambienetale
2. Una proteina regolatrice della
risposta, generalmente una proteina di
legame al DNA che regola la trascrizione
in modo + o – a seconda del sistema
La regolazione della chemiotassi
Il grado di metilazione delle proteine MCP controlla la loro capacità di rispondere ad una
sostanza chimica e determina il processo dell’ADATTAMENTO.