IMAGEN Influenza virus A and B [IT]

IMAGEN INFLUENZA
VIRUS A AND B
IT
K610511-2
50
Test di immunoflorescenza diretto per la determinazione del virus
dell’Influenza A e B.
1.
USO PREVISTO
IMAGEN™ Influenza virus A e B test è un test di immunofluorescenza
qualitativo diretto per la determinazione e la differenziazione del
virus dell’influenza A e B in campioni clinici o per la conferma e la
differenziazione del virus dell’influenza A e B in colture cellulari.
2.
SOMMARIO
I virus influenzali A e B appartengono al genere Influenza virus
classificato all’interno della famiglia degli Orthomyxoviridae1.
Il ceppo virale dell’influenza A infetta diverse specie animali,
compreso l’uomo, il cavallo, il maiale, i mammiferi marini e gli
uccelli, mentre il ceppo virale dell’influenza B sembra infettare
solo l’uomo2.
Nell’uomo le infezioni da virus influenzale A e B possono essere
causa di malattie respiratorie acute e occasionalmente gravi in
individui immunocompetenti e immunocompromessi. Le infezioni
del virus influenzale A e B si manifestano in epidemie annuali,
spesso con esordio rapido dell’infezione. Queste epidemie
possono manifestarsi come piccole epidemie o come epidemie
a livello mondiale in base al ceppo prevalente3. Periodicamente,
come risultato dell’evoluzione del virus dell’influenza A, le
epidemie della malattia possono avere un impatto significativo
sulla salute mondiale2,4.
La trasmissione delle infezioni da virus influenzale avvengono
attraverso inalazione di goccioline di secrezioni delle vie
respiratorie cariche di virus di portatori sintomatici od asintomatici.
Le condizioni ambientali, come il sovraffollamento, aumentano
la trasmissibilità dell’infezione. La replicazione virale avviene
nelle cellule cigliate dell’epitelio colonnare delle vie respiratorie
superiori e inferiori, con conseguente necrosi e cedimento delle
cellule. Il periodo di massima virulenza si manifesta da 1 giorno
prima a 3-4 giorni dopo l’esordio della malattia.
Durante l’evoluzione dell’epidemia influenzale, il ceppo virale
principale può essere associato al 15-50% delle infezioni delle vie
respiratorie negli adulti e nei bambini. La tipologia della malattia
respiratoria può variare da lieve malattia delle vie respiratorie
superiori a polmonite severa3. La polmonite acuta a causa dei
virus influenzali A o B può essere fatale, in particolare se associata
a infezioni microbiche concomitanti o secondarie in pazienti
anziani o immunocompromessi.
I virus dell’influenza sono stati associati con epidemie nosocomiali
di infezioni delle vie respiratorie in reparti pediatrici e geriatrici,
con conseguente ricovero prolungato e aumento della morbilità
e della mortalità.
Una rapida diagnosi di laboratorio dei virus influenzali A e B riveste
un ruolo importante nella gestione dei pazienti, influenzando
l’impiego di terapie antivirali e consentendo la gestione e
il controllo effettivi delle epidemie3,5. I metodi diagnostici
comprendono la determinazione diretta del virus o delle proteine
virali in campioni clinici (p.e. aspirati rinofaringei), l’isolamento
del virus vivo nelle colture cellulari monostrato inoculate con
secrezioni provenienti dalle vie respiratorie e determinazione
delle immunoglobuline specifiche del virus dell’influenza.
L’isolamento dei virus influenzali da campioni di materiale delle
vie respiratorie può essere effettuato in linee cellulari, come le
cellule renali di scimmie rhesus o renali canine Madin-Darby
(MDCK), impiegando tecniche come l’emoassorbimento o
l’emoagglutinazione per l’identificazione dellapresenza del ceppo
virale. Sono state utilizzate diverse tecniche per confermare
l’identificazione degli isolati del virus influenzale, ad es. inibizione
dell’emoassorbimento, inibizione dell’emoagglutinazione, test di
neutralizzazione, microscopia elettronica o immunofluorescenza
indiretta. Queste tecniche sono laboriose, lunghe e richiedono un
livello di competenza tecnica che potrebbe non essere disponibile
in tutti i laboratori.
I test di immunofluorescenza diretta che utilizzano anticorpi
monoclonali specifici offrono un metodo rapido e sensibile per
la determinazione dei virus influenzali A e B in campioni clinici,
come aspirati rinofaringei, o per la conferma del virus influenzale
isolato in colture cellulari monostrato6. IMAGEN Influenza
virus A e B è un test di immunofluorescenza diretto per la
determinazione e l’identificazione dei ceppi dei virus influenzali A
e B in campioni clinici o in colture cellulari. Il test utilizza anticorpi
monoclonali specie-specifici per la determinazione dell’epitopo
delle glicoproteine del virus influenzale e delle proteine di fusione
specifiche del virus dell’influenza di tipo A o di tipo B.
3.
PRINCIPIO DEL TEST
IMAGEN Influenza virus A e B test contiene anticorpi monoclonali
coniugati con isotiocianato di fluoresceina (FITC) specifici per il
virus dell’influenza A o B. Questi vengono utilizzati in una tecnica
di immunofluorescenza diretta mono-passaggio. I campioni
vengono incubati con il reagente a base di anticorpo FITCconiugato per 15 minuti, successivamente l’eccesso di reagente
viene dilavato con soluzione fisiologica in tampone fosfato (PBS).
Le zone colorate vengono montate e visualizzate al microscopio,
utilizzando illuminazione epifluorescente. Se è presente il virus
dell’influenza A o B, utilizzando il rispettivo reagente, verrà
visualizzata una caratteristica fluorescenza verde-mela nel
citoplasma e nel nucleo delle cellule, che contrasterà con la
colorazione di fondo rossa delle cellule non infette.
Gli anticorpi monoclonali utilizzati in questo test sono stati
prodotti dal Department of Health and Human Services, Public
Health Service, Centers for Disease Control, Atlanta, Georgia,
U.S.A.
L’immunogeno usato per ottenere gli anticorpi anti-influenza
A comprendeva i ceppi A / Puerto Rico / 8 / 34 (H1N1) e A /
Bangkok /1 / 79 (H3N2). L’immunogeno usato per ottenere gli
anticorpi anti-influenza B comprendeva i ceppi B / Lee / 40 e B /
Singapore/-222 / 79.
4.
DEFINIZIONI
I seguenti simboli sono stati utilizzati nelle informazioni del
prodotto.
Codice del prodotto e numero di catalogo
Consultare le istruzioni per l’uso
N
6.
REAGENTI AGGIUNTIVI
6.1. REAGENTI
Acetone fresco (per il fissaggio).
Utilizzare entro
Codice del lotto
Soluzione fisiologica in tampone fosfato (PBS) pH 7,5 per il
lavaggio dei campioni colorati e per la preparazione dei campioni.
Limiti di temperatura per la conservazione
5.
REAGENTI FORNITI
50 - Ogni kit contiene materiale sufficiente per 50 preparati
di coltura cellulare. - La conservabilità del kit è quella indicata
sull’etichetta della confezione esterna.
5.1.
IMAGEN INFLUENZA VIRUS A E B REAGENTS
Un opuscolo di istruzioni per l’uso.
2 x 2 vetrini di controllo positivi con pozzetto
contenenti cellule renali di scimmia verde
africana (Vero) fissate in acetone, infettate con
virus dell’influenza A o B in zone separate del
pozzetto.
Un flacone di:
3mL di liquido di montaggio. Il liquido
di montag gio contiene un inibitore
fotosbiancante in soluzione di glicerolo
(pH 10,0).
1,4mL di IMAGEN Influenza A virus test
reagent. Il reagente contiene anticorpi
monoclonali murini purificati, specifici per
il virus dell’influenza A, FITC-coniugati. Gli
anticorpi monoclonali sono diretti contro
la proteina matrice e le nucleoproteine
dell’influenza A.
1,4mL di IMAGEN Influenza B virus test
reagent. Il reagente contiene anticorpi
monoclonali murini purificati, specifici per
il virus dell’influenza B, FITC-coniugati. Gli
anticorpi monoclonali sono diretti contro la
nucleoproteinae a proteina emoagglutinina
dell’influenza B.
5.2. PREPARAZIONE, CONSERVAZIONE E RIUTILIZZO DEI
COMPONENTI DEL KIT
Al fine di garantire una performance ottimale del kit, è importante
che i componenti del kit non utilizzati vengano conservati secondo
le modalità indicate qui di seguito.
5.3. VETRINI DI CONTROLLO POSITIVO I vetrini di controllo positivo vengono forniti individualmente
in sacchetti di pellicola metallizzata sigillati, contenenti azoto.
Conservare i vetrini non utilizzati a 2-8°C. La confezione contenente
il vetrino deve essere esposta a temperatura ambiente (15-30°C)
per 5 minuti prima di essere aperta.
Colorare il vetrino subito dopo l’apertura.
5.4. LIQUIDO DI MONTAGGIO Pronto all’uso. Conservare a 2-8°C. Il liquido di montaggio deve
essere esposto a temperatura ambiente (15-30°C) per 5 minuti
prima dell’uso.
Contenuto sufficiente per <N> test
5.5.
Fabbricante
Pronto all’uso. Conservare Reagent A e B non utilizzati a 2-8°C.
I reagenti devono essere conservati al buio a 2-8°C ed esposti a
temperatura ambiente (15-30°C) per 5 minuti prima dell’uso.
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
IMAGEN™ INFLUENZA A E B REAGENTS -
/
6.2. ACCESSORI
I seguenti prodotti sono stati studiati per essere utilizzati
con IMAGEN Influenza Virus A e B. Per ulteriori informazioni,
contattare la filiale o il distributore Oxoid competenti.
Generalità
Vetrini per microscopia in vetro, ricoperti di teflon, con pozzetto
singolo da 6mm di diametro (100 vetrini per confezione)
disponibili presso la filiale o il distributore Oxoid competenti,
(codice n. S611430-6).
IMAGEN Influenza Positive Control Slide (codice n. - S611230-2).
7.
ATTREZZATURA
E’ necessaria la seguente attrezzatura:
pipette di precisione e puntali monouso per la dispensazione di
25µL
Bagno di lavaggio
Coverslip per la copertura del pozzetto di 6mm di diametro
Olio per immersione non fluorescente
Microscopio epifluorescente con sistema di filtraggio per FITC
(max. lunghezza d’onda eccitazione 490nm, emissione media
lunghezza d’onda 520nm) ed ingrandimento x200 x500
Incubatrice a 37°C
Centrifuga a bassa velocità
Per campioni diretti
Estrattore di muco (solo per campioni rinofaringei)
Per la conferma della coltura
Tamponi sterili, mezzo di trasporto virale (VTM) e contenitore
adatto alla raccolta, al trasporto e alla coltura dei virus influenzali
Linee cellulari raccomandate per la coltura e l’isolamento di virus
influenzali
8.
PRECAUZIONI
- Per uso diagnostico in vitro. Chiunque effettui analisi con
questo prodotto deve essere qualificato al suo uso ed esperto
nelle procedure di laboratorio.
8.1. PRECAUZIONI DI SICUREZZA
8.1.1
IMAGEN Influenza A e B reagents contengono 15mmol/L
di azide sodica, prodotto tossico. L’azide sodica può
reagire con le tubature in piombo e in rame, formando
azidi metalliche esplosive. Smaltire sempre i materiali
contenenti azide sodica, sciacquando abbondantemente
con acqua.
8.1.2
I virus dell’Influenza A e B presenti sul vetrino di controllo
positivo sono stati trattati con metodi di fissazione, in
modo che non includano microrganismi vivi rilevabili.
Tuttavia, il vetrino dovrebbe essere maneggiato e
smaltito come potenzialmente infetto.
8.1.3
Se, sulla base degli attuali criteri clinici ed epidemiologici
di screening raccomandati dalle autorità sanitarie,
si sospettasse un’infezione dovuta a un nuovo virus
dell’influenza A, andrebbero raccolti campioni biologici
seguendo le precauzioni appropriate di controllo delle
infezioni per i nuovi virus influenzali virulenti, che
verrebbero poi inviati ai laboratori centrali di riferimento
per i test. In questi casi, la coltura virale non deve
essere condotta in assenza di un dispositivo di sicurezza
biologica di livello 3 o superiore per la ricezione e la
coltura dei campioni.
8.1.4
Il reagente contiene il colorante Evans blu che può
essere cancerogeno, evitare pertanto il contatto con la
pelle.
8.1.5
Osservare la massima attenzione nell’uso del liquido di
montaggio, in quanto può provocare irritazione della
pelle. In caso di contatto, la cute deve essere sciacquata
abbondantemente con acqua.
8.1.6
Non mangiare, bere, fumare, conservare o preparare
alimenti o utilizzare cosmetici nell’area di lavoro
designata.
8.1.7
Non pipettare i materiali con la bocca.
8.1.8
Prima di maneggiare campioni clinici e cellule infette,
indossare guanti monouso e lavare sempre le mani dopo
aver trattato materiali infettivi.
8.1.9
Lo smaltimento di tutti i campioni clinici deve avvenire
nell’osservanza della legislazione locale.
8.1.10 Le schede con i dati sulla sicurezza sono disponibili su
richiesta degli utenti professionisti.
8.2. PRECAUZIONI TECNICHE
8.2.1
Non utilizzare i componenti dopo la data di scadenza
stampata sulle etichette. Non miscelare o scambiare fra
di loro diverse partite/lotti di reagenti.
8.2.2
I reagenti vengono forniti in concentrazioni di lavoro
fisse. La performance del test sarà influenzata in modo
negativo dall’uso di reagenti modificati o conservati in
condizioni diverse da quelle descritte alla sezione 5.
8.2.3
Preparare esclusivamente il quantitativo di soluzione
fisiologica in tampone fosfato (PBS) necessario all’uso
giornaliero.
8.2.4
Il lavaggio in PBS è necessario. L’uso di soluzioni di
lavaggio diverse da acqua di rubinetto o acqua distillata
può compromettere i risultati dei test.
8.2.5
Evitare la contaminazione microbica dei reagenti.
8.2.6
Non congelare il reagente.
9.
PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI7,8
Il prelievo e la preparazione dei campioni è di importanza
fondamentale nella diagnosi delle infezioni da virus respiratori
mediante immunofluorescenza diretta e tecniche di coltura
cellulare. I campioni devono essere raccolti dal sito dell’infezione
durante il periodo di massima virulenza, in modo da contenere il
più possibile materiale infetto e devono essere preparati in modo
da preservare intatte le cellule esenti da muco aderente ecc., per
l’esame microscopico diretto dei campioni, o per preservare la
vitalità dei virus nei campioni da sottoporre a coltura.
9.1. CAMPIONI CLINICI
9.1.1 Aspirati/secreti rinofaringei
Prelievo
Raccogliere i campioni dalla zona rinofaringea in un estrattore di
muco attraverso un tubetto di aspirazione da 8mm di diametro.
Conservare l’estrattore e il tubetto a 2-8°C e inviarli in laboratorio
il prima possibile.
Separazione cellulare
Se necessario aggiungere 2mL di soluzione fisiologica in tampone
fosfato (PBS) al campione prima di centrifugarlo, per ridurre
la viscosità e per diluire il muco. Centrifugare l’estrattore di
muco a temperatura ambiente (15-30°C) per 30 minuti a 380g.
Rimuovere il surnatante che può essere utilizzato per la coltura
cellulare. Risospendere il deposito cellulare in 2mL di PBS e
pipettare delicatamente su e giù le cellule con una pipetta a foro
largo o agitare delicatamente su vortex fino a frantumare il muco,
evidenziando il materiale cellulare. Non pipettare/agitare su
vortex con forza per evitare danni alle cellule. Una volta ottenuta
una sospensione cellulare omogenea, aggiungere ulteriore PBS se
necessario, pipettare o agitare su vortex dopo aver aggiunto altra
soluzione PBS e lavare ancora le cellule. Rimuovere ed eliminare
le macchie di muco ancora visibili. Il muco in eccesso deve essere
rimosso in quanto impedirebbe la penetrazione adeguata del
reagente, con conseguente fluorescenza non specifica.
Se tutte le secrezioni restano nel tubetto di aspirazione, senza
raggiungere l’estrattore di muco, dilavare le secrezioni dal tubetto
con PBS. L’operazione risulta più efficace inserendo una pipetta
pasteur nel lato terminale del tubetto inserito sull’estrattore.
Inserire la quantità di liquido adeguata nel tubetto ed espellerla
ripetutamente fino a che tutte le secrezioni aderenti alle pareti del
tubetto non saranno staccate. Pipettare su e giù la sospensione
fino a che il muco non sarà frantumato adeguatamente.
Preparazione dei vetrini
Dopo aver effettuato il processo di separazione cellulare,
centrifugare la sospensione cellulare ottenuta a temperatura
ambiente (15 30°C) per 10 minuti a 380g ed eliminare il surnatante.
Risospendere il deposito cellulare in un quantitativo sufficiente di
PBS per diluire il muco rimanente, mantenendo allo stesso tempo
un’alta densità cellulare. Applicare 25µL del deposito delle cellule
risospese sulle zone dei pozzetti del vetrino.
Lasciare asciugare completamente il campione all’aria a
temperatura ambiente (15-30°C) e fissarlo in acetone fresco a
temperatura ambiente (15-30°C) per 10 minuti. Se il campione
non si colora immediatamente, conservarlo a -70°C, se
necessario. I vetrini conservati dovranno essere analizzati entro
due settimane dalla preparazione, in quanto una conservazione
prolungata potrebbe essere causa di deterioramento.
9.2. COLTURA CELLULARE
Inoculazione di colture cellulari
I campioni raccolti per la diagnosi delle infezioni da virus
influenzale devono essere inoculati nelle linee cellulari utilizzate
abitualmente in laboratorio in base a metodi di laboratorio
consolidati. Le colture cellulari devono essere esaminate
regolarmente in relazione alla comparsa dell’effetto citopatico
(CPE) e i test di emoassorbimento dovrebbero essere effettuati
a intervalli regolari. Ogni coltura positiva all’emoassorbimento
o colture cellulari evidenzianti CPE possono essere raccolte e
analizzate in relazione alla presenza del virus influenzale A o B.
Preparazione dei vetrini
Inserire raschiando la lamina cellulare nel terreno di coltura
liquido utilizzando una pipetta sterile. Lasciare depositare
le cellule centrifugando a 200g per 10 minuti a temperatura
ambiente (15-30°C) e rimuovere il surnatante.
Lavare le cellule risospendendo il deposito cellulare in (PBS)
e ripetere la centrifugazione. Rimuovere il surnatante e
risospendere il deposito cellulare in un piccolo volume di PBS
fresca per mantenere un’elevata densità cellulare.
Applicare aliquote di 25µL della sospensione cellulare ai singoli
pozzetti dei vetrini. Lasciare asciugare all’aria e fissare in acetone
fresco a temperatura ambiente (15-30°C) per 10 minuti. Se il
campione non si colora immediatamente, conservarlo a 4°C per
una notte o a -70°C fino all’utilizzo. I vetrini conservati devono
essere analizzati entro 2 settimane dalla preparazione, in quanto
una conservazione prolungata potrebbe deteriorarli.
cellule intatte, non infettate, del tipo utilizzato per la coltura
e l’isolamento del virus influenzale. Le cellule devono essere
preparate e fissate come descritto nella sezione 9.2 e colorate
come descritto nella sezione 10.
10.
PROCEDURA DEL TEST
FARE RIFERIMENTO ALLA SEZIONE 8.2 PRECAUZIONI TECNICHE
PRIMA DI EFFETTUARE LA PROCEDURA DI TEST.
11.2. CAMPIONI CLINICI
11.2.1 Aspetto delle cellule infettate da virus influenzale
10.1. AGGIUNTA DEL REAGENTE
Aggiungere 25µL di Reagent A in una zona della preparazione
di cellule fissate in un pozzetto da 6mm e 25µL di Reagent B
in un’altra zona della preparazione di cellule fissate in un altro
pozzetto da 6mm sul vetrino (vedi sezione 6) o nei rispettivi
pozzetti del vetrino di controllo positivo. Accertare che i reaganti
coprano tutta l’area del pozzetto. Reattivo A deve essere utilizzato
su un bene positve e reagente B deve essere utilizzato su B
positivo pure.
10.2. PRIMA INCUBAZIONE
Incubare i vetrini con il reagente in una camera di umidificazione
per 15 minuti a 37°C. Non lasciare asciugare il reagente sul
campione, in quanto ciò potrebbe risultare in una colorazione
non specifica.
10.3. LAVAGGIO DEL VETRINO
Dilavare l’eccesso di reagente con soluzione fisiologica in tampone
fosfato (PBS) e lavare delicatamente il vetrino per 5 minuti in
bagno di agitazione contenente PBS. Drenare la PBS e lasciare
asciugare il vetrino a temperatura ambiente (15-30°C).
10.4. AGGIUNTA DI LIQUIDO DI MONTAGGIO
Aggiungere una goccia di liquido di montaggio al centro di ogni
pozzetto e posizionare un coprivetrino sul liquido di montaggio e
sul campione, verificando che non vi siano bolle d’aria.
10.5. LETTURA DEL VETRINO
Esaminare tutta la zona del pozzetto contenente il campione
colorato, utilizzando un microscopio epifluorescente. La
fluorescenza, come descritto alla sezione 11, deve essere visibile
a ingrandimento x200 x500. (I vetrini che evidenziano i risultati
migliori dovranno essere esaminati subito dopo la colorazione,
ma possono essere conservati a 2 8°C al buio per max. 24 ore).
11.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI DEI TEST
11.1. CONTROLLI
11.1.1 Vetrini di controllo positivi
Il vetrino di controllo positivo, colorato e visualizzato come
descritto alla sezione 10, deve evidenziare cellule con
fluorescenza nucleare, intracellulare e/o citoplasmatica
verde mela, contrastante con il fondo rosso del materiale di
controcolorazione. Queste cellule sono leggermente più grandi
delle cellule delle vie respiratorie ma devono evidenziare
fluorescenza nucleare e/o citoplasmatica simile se infettate con
virus influenzale. I vetrini di controllo positivo devono essere
utilizzati per verificare che la procedura di colorazione sia stata
effettuata in modo soddisfacente.
Questi vetrini vengono preparati da ceppi di virus influenzale
in colture cellulari monostrato e costituiranno esclusivamente
un controllo adeguato per la procedura di analisi, ma non per
il processo di trattamento dei campioni. Le procedure per il
trattamento dei campioni devono essere controllate utilizzando
un campione clinico.
11.1.2 Controllo negativo
Se è necessario un controllo negativo, si consiglia di utilizzare
Le cellule epiteliali delle vie respiratorie infettate da virus
influenzale devono evidenziare fluorescenza granulare
intracellulare, nucleare e/o citoplasmatica di colore verde mela.
Le cellule non infettate si colorano di rosso con controcolorante
Evans blu.
11.2.2 Interpretazione
La diagnosi è positiva se una o più cellule del campione fissato
e colorato evidenziano la fluorescenza specifica descritta alla
sezione 11.2.1, utilizzando Influenza A or Influenza B virus reagent.
La diagnosi è negativa se i campioni fissati e colorati non
evidenziano fluorescenza a contatto con il reagente.
Per i campioni di aspirato rinofaringeo colorati direttamente,
devono essere osservate almeno 20 cellule epiteliali delle vie
respiratorie non infette, prima che possa essere riportato un
risultato negativo. Vedi sezione 11.2.3 se sono presenti cellule
insufficienti.
Per i campioni prelevati da altre localizzazioni (p.e. escreato)
devono essere osservate almeno 50 cellule dell’epitelio
respiratorio non infette, prima che possa essere riportato un
risultato negativo.
11.2.3 Cellule insufficienti
Se le cellule presenti sul vetrino non sono sufficienti, il resto del
campione clinico dovrà essere centrifugato a 380g per 10 minuti
a temperatura ambiente (15-30°C). Risospendere le cellule in un
volume minore di PBS prima di ridistribuirle (25µL) nelle zone dei
pozzetti. In alternativa occorre ripetere il campione clinico.
11.3. CONFERMA DELLA COLTURA CELLULARE
11.3.1 Aspetto delle cellule infettate da virus influenzale
Le cellule infettate evidenzieranno fluorescenza intracellulare,
nucleare e/o citoplasmatica color verde-mela e dovranno essere
registrate come positive per il virus influenzale.
Le cellule non infette verranno controcolorate di rosso con
controcolorante Evans blu e dovranno essere registrate come
negative per il virus influenzale.
11.3.2 Interpretazione dei risultati
La diagnosi è positiva se una o più cellule del campione fissato
e colorato evidenziano la fluorescenza specifica descritta alla
sezione 11.3.1, utilizzando IMAGEN™ Influenza A o Influenza B
reagent.
Si devono osservare almeno 50 cellule non infettate della coltura
cellulare da sottoporre al test nel pozzetto del vetrino prima che
possa essere riportato un risultato negativo. Vedi sezione 11.2.3
se le cellule presenti non sono sufficienti.
11.3.3 Cellule insufficienti
Se le cellule presenti sul vetrino non sono sufficienti, il resto del
campione clinico dovrà essere centrifugato a 200g per 10 minuti
a temperatura ambiente (15-30°C). Risospendere le cellule in un
volume minore di PBS prima di ridistribuirle (25µL) nelle zone dei
pozzetti. In alternativa occorre ripetere il campione clinico.
12.
LIMITI DI PERFORMANCE
12.1. Utilizzare esclusivamente il liquido di montaggio fornito.
12.2. L’aspetto visivo dell’immagine fluorescente ottenuta può
variare a causa del tipo di microscopio e della sorgente
luminosa utilizzati.
12.3. Si raccomanda di utilizzare 25µL di reagente per coprire la
zona del pozzetto da 6mm. Un volume minore potrebbe
non essere sufficiente per coprire la zona del campione e
potrebbe ridurre la sensibilità.
12.4. I reagenti vengono forniti in concentrazioni di lavoro
fisse. La performance del test può essere influenzata dalla
modifica dei reagenti o se questi non vengono conservati
alle condizioni raccomandate.
12.5. La mancata determinazione del virus influenzale può
essere attribuita a prelievo inadeguato, a campionatura
e/o trattamento inadeguato del campione, coltura
cellulare inadeguata ecc. Un risultato negativo non
esclude la possibilità di un’infezione da virus influenzale.
12.6. IMAGEN Influenza virus A e B test rileva gli antigeni tipospecifici dell’influenza A e B. Non può essere utilizzato per
l’identificazione dei sottotipi di influenza A e B.
12.7. La presenza del virus influenzale nelle secrezioni
rinofarinegee non esclude necessariamente la
possibilità di una concomitante infezione da altri germi
patogeni. I risultati dei test devono essere interpretati
congiuntamente alle informazioni disponibili sugli studi
epidemiologici, nel contesto della valutazione clinica del
paziente e di altre procedure diagnostiche.
12.8. A volte in test immunochimici si osserva colorazione non
specifica derivante dal legame fra le regioni anticorpali
Fc e l’antigene della proteina A della parete cellulare di
alcuni ceppi di Staphylococcus aureus9. IMAGEN Influenza
virus A e B test reagents sono stati modificati in modo che
non si leghino alla proteina A del ceppo Cowan 1 dello
Staphylococcus aureus.
12.9. I risultati dei test devono essere interpretati
congiuntamente alle informazioni disponibili sugli studi
epidemiologici, nel contesto della valutazione clinica del
paziente e di altre procedure diagnostiche.
12.10. Gli individui cui è stato somministrato il vaccino antiinfluenza A per via nasale possono esibire risultati positivi
ai test fino a 3 giorni dopo la vaccinazione.
13.
VALORI PREVISTI
Nelle zone temperate, le epidemie di influenza causate dal tipo A
o B si manifestano nel tardo autunno e all’inizio della primavera,
mentre nelle zone tropicali non è interessata una stagione in
particolare.
In genere, le quote di infezione del virus dell’influenza A nei
bambini non immunizzati e negli adulti è simile e le manifestazioni
cliniche dell’infezione evidenziano una correlazione inversa
all’età10,11,12. Durante le epidemie di virus dell’influenza B la quota
più rilevante di casi viene riferita in bambini in età scolare13,14.
Nel corso di un inverno, in cui il virus influenzale prevalente
corrisponde a un ceppo in circolazione da diversi anni, con
conseguente immunizzazione di gran parte della popolazione,
ai virus influenzali può essere attribuita la causa di ca. il 15%
delle infezioni delle vie respiratorie. Se un nuovo ceppo di virus
influenzale viene introdotto in una comunità e un gran numero
degli individui esposti non è immune, il ceppo influenzale può
causare il 50% di tutte le infezioni respiratorie. In un’epidemia
riconosciuta e definita, si possono individuare fino al 100% dei
casi, utilizzando metodi sierologici e di determinazione antigenica
a scopo diagnostico15.
14.
CARATTERISTICHE DI PERFORMANCE SPECIFICHE
14.1. REATTIVITA’ DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI
Gli anticorpi monoclonali utilizzati in questo test, attraverso
immunoanalisi, sono stati evidenziati come specifici. Gli anticorpi
del virus dell’influenza A determineranno i ceppi H1N1, H2N2, H3N2
del virus dell’influenza A e gli anticorpi del virus dell’influenza B
determineranno i diversi virus dell’influenza B raccolti durante il
1940 ed il 19846,16,17.
14.2. STUDI CLINICI
IMAGEN Influenza virus A e B test è stato studiato in due centri di
sperimentazione clinica su secrezioni rinofaringee e su escreato,
prelevati da bambini e adulti ricoverati con sintomatologia da
infezione delle vie respiratorie. Il test è stato inoltre valutato in 5
centri di sperimentazione su culture cellulari di ceppi polivalenti
del virus per confermare la presenza di virus influenzali. Gli studi
sono stati effettuati negli USA, in Europa e in Estremo Oriente.
I centri di sperimentazione hanno effettuato test diretti su 213
campioni clinici e su 227 campioni per la conferma della coltura
cellulare. I ceppi determinati dagli anticorpi monoclonali dell’
IMAGEN Influenza virus A e B test comprendono 22 diversi ceppi
di virus dell’influenza A e 20 diversi ceppi del virus dell’influenza
B. I metodi standard (di riferimento) utilizzati, comprendevano
test di immunofluorescenza indiretta effettuati direttamente sui
campioni e colture cellulari di cellule renali di babbuino, cellule
MDCK o di uova di gallina embrionate. Le colture positive al virus
sono state confermate mediante immunofluorescenza indiretta,
utilizzando anticorpi monoclonali o policlonali o inibizione
dell’emoagglutinazione (HAI).
14.3. PERFORMANCE CLINICA
14.3.1 Campioni diretti
I campioni clinici sono stati prelevati principalmente durante gli
inverni 1984-1987 e i centri di sperimentazione hanno comparato
IMAGEN Influenza virus A e B test con i metodi standard. Per
questa valutazione sono stati utilizzati sia campioni clinici freschi
sia campioni precedentemente congelati.
sensibilità era pari a 86,7% (13/15) e la specificità pari a 99,5%
(197/198). I valori predittivi dei risultati positivi e negativi erano
pari rispettivamente a 92,9% (13/14) e a 98,9% (197/199).
Tabella 14.3.1
Comparazione tra i risultati dei test di
IMAGEN Influenza virus A reagent utilizzato direttamente su
campioni clinici e i test standard
TEST RISULTATI
Metodo standard
IMAGEN Influenza virus A
Centro 1
Centro 2
N. COMPLESSIVO di campioni (213)
Neg
Neg
59
101
160
Pos
Pos
35
16
51
Pos
Neg
1
1
2
Neg
Pos
0
0
0
Tabella 14.3.2
Comparazione tra i risultati dei test di
IMAGEN Influenza virus B reagent utilizzato direttamente su
campioni clinici e i test standard
TEST RISULTATI
Metodo standard
IMAGEN Influenza virus B
Centro 1
Centro 2
N. COMPLESSIVO di campioni (213)
Neg
Neg
81
116
197
Pos
Pos
12
1
13
Pos
Neg
1
1
0
Neg
Pos
1
0
1
14.3.2 Conferma della coltura cellulare
Cinque centri di sperimentazione hanno testato IMAGEN
Influenza virus A e B test su isolati clinici e su ceppi polivalenti
isolati in colture cellulari. L’isolamento del virus è stato effettuato
utilizzando cellule renali primarie o secondarie di babbuino o
cellule renali canine Madin-Darby (MDCK). Le colture cellulari
prima dell’applicazione sui vetrini sono state lavate in PBS (vedi
sezione 9.2). I vetrini sono stati fissati in acetone e testati con
IMAGEN Influenza virus A e B reagents. Per questa valutazione
sono stati utilizzati sia campioni clinici freschi, isolati, che
campioni precedentemente congelati.
Sono state valutate complessivamente 227 colture, che
comprendevano 54 colture positive al virus dell’influenza A e 30
colture positive al virus dell’influenza B. Gli isolati delle colture
cellulari sono stati confermati attraverso immunofluorescenza o
inibizione dell’emoagglutinazione (HAI).
Il risultato dei metodi di riferimento veniva considerato positivo
se la coltura cellulare o l’immunofluorescenza indiretta erano
positive sui campioni diretti. Ciò ha permesso di rilevare la
presenza del virus non vitale attraverso fluorescenza o di
individuare il virus esente da cellule attraverso coltura cellulare.
I risultati (Tabelle 14.3.3 e 14.3.4) indicano che l’Influenza virus
A reagent individua tutti gli isolati del virus dell’influenza A
(sensibilità 100%), mentre l’Influenza virus B reagent rileva tutti
gli isolati del virus dell’influenza B (sensibilità 100%).
La tabella 14.3.1 indica i risultati ottenuti con IMAGEN Influenza
virus A reagent. L’incidenza generale di influenza in queste
popolazioni era pari al 24,9%. I risultati del test IMAGEN Influenza
A evidenziavano correlazione con i test standard in 211 casi
(99,1%). La sensibilità era del 96,2% (51/53) e la specificità del
100% (160/160), assumendo una specificità e una sensibilità dei
metodi standard pari al 100%. I valori predittivi dei test positivi e
negativi erano rispettivamente pari al 100% (51/51) ed al 98,8%
(160/162).
Tabella 14.3.3
Comparazione tra i risultati dei test di
IMAGEN Influenza virus A reagent utilizzato per la conferma
colturale e i test standard
La sensibilità, la specificità e i valori predittivi sono stati calcolati
come descritto in precedenza18.
La tabella 14.3.2 indica i risultati ottenuti con IMAGEN Influenza
virus B reagent. L’incidenza generale di influenza B in queste
popolazioni era pari al 7,0%. Ciò riflette una bassa prevalenza di
casi di influenza B in Europa durante sperimentazioni cliniche. I
risultati del test IMAGEN Influenza B evidenziavano l’esistenza
di una correlazione con i test standard in 210 casi (98,6%). La
La specificità di entrambi i reagenti era pari al 100%.
TEST RISULTATI
Metodo standard
IMAGEN Influenza virus A
Centro 1
Centro 2
Centro 3
Centro 4
Centro 5
N. COMPLESSIVO di campioni (227)
Neg
Neg
59
27
43
23
21
173
Pos
Pos
13
1
13
22
5
54
Pos
Neg
0
0
0
0
0
0
Neg
Pos
0
0
0
0
0
0
Tabella 14.3.4
Comparazione tra i risultati dei test di
IMAGEN Influenza virus B reagent utilizzato per la conferma
colturale e i test standard
TEST RISULTATI
Metodo standard
IMAGEN Influenza virus B
Centro 1
Centro 2
Centro 3
Centro 4
Centro 5
N. COMPLESSIVO di campioni (227)
Neg
Neg
69
25
54
27
22
197
Pos
Pos
3
3
2
18
4
30
Pos
Neg
0
0
0
0
0
0
Neg
Pos
0
0
0
0
0
0
14.4. CROSS-REATTIVITA’
IMAGEN Influenza A e B test è stato eseguito contro preparati di
altri virus e organismi presumibilmente presenti nelle secrezioni
delle vie respiratorie o in colture cellulari. Tutti gli organismi
testati (Tabella 14.4) sono risultati negativi con IMAGEN Influenza
virus A e B reagents.
Tabella 14.4
Organismi analizzati con l’ IMAGEN Influenza
virus A e B Test risultati negativi
Acholeplasma laidlawii
Adenovirus tipo 1 5 e 7
Bordetella parapertussis
Bordetella pertussis
Branhamella catarrhalis
Candida albicans
Chlamydia psittaci
Chlamydia trachomatis
Coxsackie virus tipo A9 e B4
Cytomegalovirus
Echovirus tipi 3, 6, 9, 11 e 22
Virus di Epstein-Barr
Mycoplasma pneumoniae
Mycoplasma salivarium
Mycoplasma orale
Mycoplasma hominis
Mycoplasma arginini
Mycoplasma hyorhinus
Neisseria meningitidis A
Neisseria meningitidis B
Neisseria lactamica
Neisseria perflava
Neisseria cinerarea
Virus parainfluenzale tipo 1, 2
e3
Foamy virus
Pneumocystis carinii
Virus del Herpes simplex tipo Polio virus tipo 1 e 2
1e 2
Legionella pneumophila
Virus sinciziale respiratorio
Virus del morbillo
Rinovirus
Virus della parotite
Virus delle scimmie tipo 5 e 40
Mycobacterium tuberculosis
Staphylococcus aureus
Mycobacterium avium
Streptococcus gruppi A,B,C,D
FeG
Mycobacterium intracellulare Virus varicella zoster
15.
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Selection Strategies. Volume 2. WB Saunders Company: 685 699.
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