APPLICAZIONI DELLA
CITOFLUORIMETRIA
QUALCHE ESEMPIO……
STUDIO DEL SISTEMA IMMUNITARIO
Una delle maggiori applicazioni della citofluorimetria e’rappresentata dall’analisi
(e sorting) delle diverse popolazioni di cellule del sangue.
Si sfruttano fondamentalmente due caratteristiche :
• la maggior parte delle cellule del sangue
mostrano distinti profili di forward and side scatter
SSC-H: SSC-Height
250
granulociti
200
150
100
monociti
50
linfociti
0
0
50
100
150
200
250
FSC-H: FSC-Height
• le diverse popolazioni cellulari esprimono sulla
propria superficie markers specifici che le
discriminano dalle altre
GATING E SORTING
L’analisi multiparametrica, uno dei piu’ potenti aspetti della citofluorimetria a flusso,
permette di affrontare i problemi biologici della eterogeneita’ cellulare. Sfrutta due
operazioni fondamentali della CFM: il gating e il sorting.
Gating: utilizzando una finestra elettronica,
permette di isolare una determinata
popolazione da tutte le altre cellule, e di analizzare i parametri successivi solo all’interno
della popolazione “ghettata”, dividendola cosi’ in ulteriori subpopolazioni.
Sorting: e’ un gating reale, che consente di raccogliere fisicamente le popolazioni che
sono state separate dal resto della miscela. Si stabiliscono delle finestre di selezione per
identificare le popolazioni di interesse che verranno separate e raccolte in provette distinte.
Le cellule mantengono la vitalita’ dopo il sorting!!!
Citofluorimetri a circuito chiuso: il campione analizzato viene perso
Citofluorimetri a circuito aperto: il campione incontra il fascio di luce laser in aria, per poi
essere recuperato selettivamente dopo il sorting.
IL SORTING
Il termine “sorting” indica la capacità di un citofluorimetro (FACS), di raccogliere
fisicamente le sottopopolazioni cellulari separate dalla popolazione eterogenea
iniziale in base alla diversa espressione antigenica.
Il campione fluido viene
frammentato in minuscole
goccioline,
ognuna
delle
quali contiene una singola
cellula.
Le
goccioline
caricate
vengono
elettricamente
e
deviate mediante piastre di
deflessione negli appositi
raccoglitori.
Al termine del “sorting” le cellule mantengono la vitalità.
Strategie di gating:
Situazione ideale (fortunatamente abbastanza tipica):
le cellule positive per il marcatore sono ben separate da
quelle negative, rientrando quindi in una finestra ben
definita.
Parziale sovrapposizione della
fluorescenza tra cellule positive e
negative per il marcatore
Picco unimodale di fluorescenza, in cui
l’istogramma delle cellule positive
presenta un leggero shift rispetto alle
cellule non marcate
Strategie di Gating
250
10000
150
1000
CD4 PerCP
SSC-Height
200
100
50
100
Altri markers
0
0
50
100
150
200
10
250
FSC-Height
1
1
10
100
1000
10000
CD8 FITC
10000
10000
CD4 PerCP
CD4 PerCP
1000
100
10
1000
100
Altri markers
10
1
1
10
100
CD8 FITC
1000
10000
1
1
10
100
CD8 FITC
1000
10000
Strategie di Gating
250
10000
150
32.5
67.5
200
# Cells
100
150
100
CD8 PerCP
SSC-Height
1000
32.5
100
50
10
50
0
0
1
10
100
1000
1
10000
10
100
1000
10000
1
CD28 PE
CD8 PerCP
250
0
1
0
10
100
CD28 PE
1000
10000
10000
120
15.1
200
84.9
SSC-Height
1000
150
CD4 PerCP
# Cells
90
60
100
50
84.9
30
0
1
10
100
CD4 PerCP
1000
10000
0
1
10
100
CD28 PE
1000
10000
100
10
0
1
1
0
10
100
CD28 PE
1000
10000
Analisi multiparametrica
L’analisi multiparametrica e’ uno dei piu’ potenti aspetti della citofluorimetria a flusso,
che sfrutta la strategia di gating. E’ ampiamente utilizzata per caratterizzare
fenotipicamente diverse popolazioni cellulari. Con i moderni citofluorimetri si
possono utilizzare 4 (e piu’) colori contemporaneamente!!!
250
Flow cytometric panel:
FITC
Cyclin B
Cyclin B
Cyclin B
Cyclin B
Cyclin B
Cyclin B
Cyclin B
Cyclin B
PE
CD25
CD28
CD62L
CD25
CD28
CD62L
CD4
CD16
PerCp
CD69
CD95
CD45RA
CD69
CD95
CD45RA
DR
CD20
APC
CD8
CD8
CD8
CD4
CD4
CD4
CD8
CD3
200
CD28
150
100
50
0
1
10
100
1000
10000
1
10
100
1000
10000
250
200
CD62L
150
100
50
0
Strategia di gate per analisi multiparametriche
10000
CD8
1000
100
10
1
1
10
100
1000
10000
Cyclin B
CD8+ Cyclin B-
CD8+ Cyclin B+
10000
10000
CD8
51
81
1000
1000
100
100
10
10
0
1
1
0
10
100
1000
0
1
1
10000
HLA-DR
0
10
100
1000
10000
ANALISI DEL CICLO CELLULARE
• Nelle cellule dei tumori (soprattutto solidi) e’ spesso riscontrabile una variazione
nel contenuto di DNA, principale conseguenza di mutamenti genetici cromosomici
e subcromosomici, aventi un ruolo fondamentale per lo sviluppo e il decorso della
malattia.
• Una delle prime applicazioni della citofluorimetria e’ stata proprio l’analisi della
posizione nel ciclo cellulare, effettuata tramite quantificazione del DNA cellulare.
• La citofluorimetria e’ ancora oggi la tecnica piu’ utilizzata per una veloce ed
accurata determinazione della distribuzione delle cellule nelle varie fasi del ciclo
cellulare.
ANALISI DEL CICLO CELLULARE
Nel metodo piu’ semplice, il contenuto di DNA e’ rilevato usando un colorante fluorescente in
grado di legare il DNA con alta affinita’.
Propidium
iodide:
e’
il
colorante
piu’
comunemente utilizzato. Dopo essersi legato
al DNA, aumenta notevolmente la propria
fluorescenza. Richiede la permeabilizzazione
delle membrana plasmatica.
Hoechst 33342: e’ meno utilizzato, ma rappresenta una valida alternativa quando e’
richiesto la colorazione di cellule non permeabilizzate (vive).
ANALISI DEL CICLO CELLULARE
Quando la quantita’ di DNA viene misurata su cellule non sincronizzate, si osservano cellule
con quantita’ di DNA variabile da 2N (G0/G1) a 4N (G2/M).
Un istogramma rivela la frazione di cellule presente nelle varie fasi del ciclo cellulare
ANALISI DEL CICLO CELLULARE
Il monitoraggio della proliferazione cellulare e posizione in ciclo per mezzo della
misurazione del DNA quale singolo parametro pone diverse limitazioni:
• non permette di distinguere cellule in G0 da quelle in G1 (stesso contenuto di DNA)
• non permette di distinguere cellule in G2 da quelle in M, (stesso contenuto di DNA);
• totale mancanza di informazioni circa la cinetica cellulare.
Analisi Multiparametrica:
Assieme al contenuto di DNA vengono valutati altri parametri della cellula strettamente
correlati alla sua posizione nel ciclo. L’analisi multiparametrica e’ diventata il metodo
preferenziale per studiare le connessioni tra la progressione nelle varie fasi del ciclo di una
cellula e la sua crescita (es contenuto di RNA, specifiche proteine), attivazione (es specifici
markers di superficie), proliferazione (es Ki67, specifiche cicline) e differenziazione (es
specifici markers tumorali)
Aumentato Turnover delle cellule T in
pazienti infetti da HIV
Controls
(10.8)
2.1
HIV + HAART
11
(34.7)
10.4
(43.7)
2.5
1000
CD4
(41.2)
HIV
10000
100
10
1.2
(21)
1
10000
(59.1)
1.5
CD8
1000
100
10
1
10
100
KI67
1000
10000
1
1
10
100
1000
10000
1
10
100
1000 10000
Valutazione dei linfociti CD8+ antigene-specifici
10000
10000
70
30
1000
GAG APC
GAG APC
1000
100
10000
100
10
10
1000
10
100
1000
CD8 PerCp
250
10000
1
0.9
1
10
99.1
150
1
SSC
1000
10000
10000
10
200
100
IL-7R PE
100
1
10
100
100
1000
10000
CD8 PerCp
GAG APC
1
GAG APC
1
1000
100
63.9
36.1
10
50
100
0
CD8PerCp
1
CD8+GAGCD8+GAG+
% of Max
80
60
IL-7R PE
40
20
0
1
10
100
1000 10000
1
10
100
IL-7R PE
1000
10000
Produzione di citochine per la valutazione
della risposta immunitaria (ICC staining)
10000
10000
CD8+IFNg+
CD4+IFNg+
1000
IFN-g PE
IFN-g PE
1000
3.72
100
10
100
15.5
10
1
1
1
10
100
1000
10000
1
10
CD4 APC
10000
10000
CD4+IL2+
20
IL-2 PE
IL-2 PE
1000
10000
CD8+IL2+
1000
1000
100
100
6.29
10
10
1
100
CD8 PerCP
1
10
100
CD4 APC
1000
10000
1
1
10
100
1000
CD8 PerCP
10000
Valutazione dell’apoptosi tramite Annexin V
Durante l’apoptosi le cellule subiscono
specifiche modificazioni morfologiche, che
portano alla perdita dell’integrità della
membrana, alla formazione di corpi
apoptotici e alla morte della cellula
Un
cambiamento
che
avviene
nella
membrana cellulare durante le prime fasi del
processo apoptotico è la traslocazione della
phosphatidylserine (PS) dal lato interno della
membrana a quello esterno. E’ possibile
rilevare PS utilizzando Annexin V marcata,
una proteina di 35 kDa che in presenza di
specifiche concentrazioni di calcio è in grado
di legarsi con alta affinità alla PS.
Valutazione dell’apoptosi tramite Annexin V
Data la sua importanza negli studi dei processi apoptotici, è attualmente
commercialmente disponibile annexin V coniugata con una ampia varietà di
fluorocromi, da utilizzare in citofluorimetria e microscopia.
Valutazione dell’apoptosi tramite Annexin V
Un metodo molto importante nello studio dell’apoptosi utilizza
la colorazione dell’Annexin V in combinazione con un
colorante, che lega gli acidi nucleici, in grado di discriminare
tra cellule vive e morte (viability probe). I due coloranti più
utilizzati sono PI o 7AAD (7-Amino-actinomycin D).
Grazie a questa combinazione
possiamo
ottenere un profilo dove le cellule vitali
risultano negative ad entrambi i markers,
quelle nelle prime fasi dell’apoptosi sono
positive all’Annexin V e negative alla viability
probe, quelle nella late apoptosi sono positive
per entrambi i markers
Livelli di apoptosi in SIV infected and
uninfected sooty mangabeys
campthotecin
7AAD
10000
20 uM 8 hours
0.15
1000
100
100
10
10
10
100
1000
10000
22
late apoptosis
necrosis
early
apoptosis
43.8
55.6
1
0.12
1.36
1000
1
20 uM o/n
10000
23
1
1
55
10
100
1000
10000
Annexin V PE
CD4+
10000
CD8+
0.43
0.069
SIV +
100
10
22.7
7.09
1
1
10
100
1000
10000
1
10000
SIV -
10
100
1000
0.026
10000
5.51
10
1
0.42
100
1000
0.051
10000
0.35
17.6
1000
SM
0.33
21.1
1000
SM
7.74e-3
100
20.2
10
6.47
93.1
1
1
10
100
1000
10000
1
10
100
1000
10000
6.25
1
10
100
1000
10000
