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Le tecniche separative campione ANALISI Sali, H2O2, metalli selettività Separare i singoli componenti per analizzarli successivamente Proteine, peptidi, lipidi, zuccheri Sostanze inquinanti, additivi industriali Disporre, per ciascun componente, di un metodo selettivo e privo di interferenze Ottenere una parziale separazione combinata con sensori o metodi selettivi Trattamento del campione e Separazioni analitiche IL CAMPIONE Classificazione fisica Campione omogeneo (es. soluzione) Campione eterogeneo (sospensione, solido + liquido, gas disciolti in spazi fisicamente definiti) Classificazione chimica Campione omogeneo (es. cosituito da tutte sostanze idrofile) Campione eterogeneo (es. cosituito sostanze idrofile e idrofobiche) Caratteristiche su cui si basano le TS ¾Caratteristiche chimiche ¾Caratteristiche fisiche Vantaggi della preparazione del campione: · selettività, riduzione delle interferenze · possibilità di utilizzare detector sempre più sensibili · aumentare il numero di campioni misurabili per unità di tempo · ridurre il tempo di analisi strumentale e di interpretazione dei risultati · incrementare la vita delle colonne per cromatografia (HPLC e GC) (adsorbimento di molecole sulle pareti della colonna) · possibilità di arricchire il campione (preconcentrazione) (aumentare la sensibilità del metodo) · automazione delle analisi Svantaggi · trattamento chimico-fisico del campione (l’analisi non avviene sul campione, ma su un estratto) Il metodo di estrazione deve essere quantitativo [A] 1° [A] estrazione estrazione [A] [A] analisi analisi Dato analitico 50 mg/L Dato analitico 150 mg/L + [A]100 mg/L 2° estrazione [A] analisi Dato analitico 100 mg/L + [A]100 mg/L RECUPERO: quantità di analita, espressa in %, ottenuta da una matrice con un metodo metodo di estrazione. · Cristallizzazione (precipitazione) Tecnicha basata sulla possibilità di ottenere cristalli insolubili in soluzione mediante: aggiunta di opportuno reagente, variazione delle condizioni della soluzione (pH, temperatura). Ultrafiltrazione FILTRAZIONE Tecnica basasta sull’uso di membrane semipermeabili. Il passaggio è guidata da un gradiente di pressione. P Membrana con pori da 0.2 µm Membrana per osmosi inversa Ultrafiltrazione per l’industria delle bevande Rimozione tramite uso di fibre per ultrafiltrazione di materiale colloidale e organico dall’acqua di processo nell’industria delle bevande. Ad esempio, acqua della rete pubblica appare avere torbidità, e contenere acidi fulvici e umici che conferiscono colore giallastro, Studio su scala pilota di membrana G50 – ultrafiltrazione. Constituent Raw Water G-50 Permeate % Reduction Bacteria, No/ml 0.00 0.00 NA Yeast, No/ml 43.00 0.00 100 Turbidity (NTU) 0.52 0.09 83 Color Highly Colored No Color 100 Iron, ppm 0.15 < 0.01 > 93 TOC, ppm 3.00 < 1.00 > 67 separazione tramite l’utilizzo di fibre da microdialisi La diffusione all’interno della fibra dipende dalle dimensioni dei pori della fibra e dal coefficiente di diffusione della molecola. membrana Direzione del liquido di estrazione pompa [A] i=K d[A]e [A]i [A]e Distillazione Tecnica basata sul diverso punto di ebollizione di due o più liquidi in miscela Estrazione liquido-liquido iIl grado al quale sostanze (organiche o inorganiche) si distribuiscono tra 2 liquidi non miscibili tra loro differisce enormemente. Queste differenze possono essere sfruttate per scopi analitici per separare interferenti. SSeparazione dei costituenti di una miscela in liquidi non miscibili tra di loro. o La tecnica si basa sulle caratteristiche chimiche delle sostanze da separare. o Può separare sostanze con punti di ebolllizione vicini (non separabili per distillazione). Il risultato è una nuova miscela (2 o più costituenti) Coefficiente di distribuzione Costante di equilibrio che descrive la distribuzione di un soluto tra due solventi non miscibili A(acq) Kd= A(org) [A]org [A]acq Imbuto separatore Rapporto di distribuzione D = rapporto di tutte le specie del soluto in ciascuna fase es. se A è un acido debole KD= Ka = [A]org D = [A]acq [AH] (acq) + [A-] (acq) [H+] (acq) + [A-] (acq) [AH] (org) = [AH] (acq) KD [AH] (acq) [AH] (org) [A-] (acq) = Ka [AH] (acq) [H+] (acq) D = = KD [AH] (acq) [AH] (acq) + Ka [AH] (acq) / [H+] (acq) KD 1 + Ka/[H+] (acq) Se [H+] >> Ka D ≅ KD e AH viene estratto nello strato organico Se [H+] << Ka D = KD [H+] /Ka è più piccolo e AH rimane nello strato acquoso, in soluzione alcalina l’acido non può essere estratto! Se si usano volumi diversi bisogna correggere per la variazione L’efficienza di estrazione è indipendente dalla concentrazione di soluto! Estrazione di metalli con agenti chelanti (difeniltiocarbazone) D = KDMRn Kf Kan KDHRn [HR]o = K [H+]a [HR]o [H+]a Se ci sono 2 o più metalli come vengono separati? Solo Kf e KDMRn sono funzioni del metallo e quindi possiamo esprimere un fattore di separazione β = D1/D2 = Kf1 KDMRn1 / Kf2 KDMRn2 Estrazione in stadi multipli E’ facilmente dimostrabile come sia molto più efficiente estrarre quantitativamente un composto operando su estrazione multiple che su una singola estrazione con volumi grandi di solvente. Estrazione controcorrente Tubi di Craig La frazione di soluto Fr,n contenuta nel r-esimo tubo dopo n trasferimenti (volumi uguali di solventi) è Fr,r = n! / r!(n-r!) (1 / D+1)n Dr Estrazione liquido-liquido Solvente organico – non H2O mix -di eluizione Strato acquoso contenente il campione Terra di diatomee Gas cromatografo Applicazione all'analisi di alimenti: molecole non polari da tessuti animali e vegetali. Terra di diatomee offre grande superficie Æ film polare di campione che offre una ampia superficie di scambio fase polare/fase apolare Vantaggio: ridotto volume di solvente di estrazione utilizzato Estrazione SPE (solid phase extraction) Vantaggi: ¾Semplicità ¾Efficienza ¾Versatilità ¾Disponibilità commerciale di colonne pre-impaccate In SPE si utilizzano 2 strategie alternative: 1. Ritenzione degli interferenti 2. Ritenzione dell’analita 1 Interferenti Materiale: ¾Colonna impaccata con materiale adsorbente ¾Eluente Le 2 strategie si basano sul diverso grado di affinità di analita e interferenti per il materiale di impaccamento e per il solvente di eluizione 2 analita Interferenti analita 1. Si usa quando [A] è elevata 2. Si usa quando [A] è bassa Æ ARRICCHIMENTO Estrazione SPE (ARRICCHIMENTO) Aggiunta di ripetuti volumi di campione e eluizione in volume ridotto Æ concentrazione Arricchimento 1 Arricchimento 2 Arricchimento n eluizione Es: 3 x 100 ml [A] = 2 ng/ml Eluente 1 ml Quale concentrazione nell’eluito? SPE viene eseguita in tre modalità: ¾Fase diretta (normal phase) ¾Fase inversa (reversed phase) ¾Scambio ionico (ion exchange) Fase adsorbente polare Eluente bassa polarità Fase adsorbente apolare Eluente alta polarità Fase adsorbente polare Eluente alta polarità Uso di colonna C18 (bassa polarità) EsempioA: estrazione degli acidi organici da vini rossi Step 1: acidificazione del campione Step 2: aggiunta a colonna C18 (fase adsorbente apolare) Step 3: analisi dell’eluito 2 Pigmenti interferenti adsorbiti Acidi organici eluiti analisi Esempio B: estrazione dei pigmenti fenolici da vini rossi Step Step Step Step 1: 2: 3: 4: acidificazione del campione aggiunta a colonna C18 (fase adsorbente apolare) eliminazione dell’eluito eluizione con eluente più forte 2 4 Eluente più apolare Pigmenti fenolici adsorbiti Acidi organici e zuccheri interferenti Pigmenti fenolici analisi Schema generale per SPE in fase diretta Fase adsorbente polare (alumina, silica gel, ammino gruppi) 1. 2. 3. 4. 5. Condizionare la colonna con solvente NON POLARE Caricare il campione in colonna Eluire interferenti con solvente non polare Eluire i primi componenti di interesse con solvente polare Aumentare progressivamente la polarita dell’eluente Schema generale per SPE in fase inversa Fase adsorbente apolare (C8, C18, ) 1. 2. 3. 4. 5. Condizionare la colonna con metanolo, acetonitrile poi lavare con acqua Caricare il campione in soluzione fortemente polare in colonna Eluire interferenti con solventi fortemente polari Eluire i primi componenti di interesse con solvente a polarità decrescente Aumentare progressivamente la apolarita dell’eluente Schema generale per SPE a scambio ionico Fase adsorbente polare a forte carattere ionico 1. 2. 3. 4. 5. Condizionare la colonna con acqua Caricare il campione in soluzione acquosa (acqua o tampone) Eluire interferenti con tampone debole Eluire i primi componenti di interesse con tampone più forte o aggiustando il pH Aumentare progressivamente le caratteristiche eluenti del tampone Estrazione di sostanze volatili Le sostanze volatili possono essere estratte: 1. Dalla fase sovrastante la matrice (SPAZIO DI TESTA) 2. Direttamente dalla matrice chiusura ermetica La complessità chimico-fisica della matrice influenza la distribuzione dei volatili nello spazio di testa in base alla diversa ‘affinità’ per la fase ‘matrice’. spazio di testa matrice La composizione dello spazio di testa può non rappresentare la composizione dei volatili in una data matrice SPME – microestrazione in fase solida Non prevede uso di reagenti, il campione è desorbito generalmente per via termica fibra capillare pulsante ago Ago: serve a forare il setto in gomma di vial di campionamento Fibra: silice fusa rivestita di fase stazionaria appropriata a volatili o a liquidi da estrarre Capillare: serve da protezione e sostegno alla fibra Pulsante: serve a comandare la posizione di ‘iniezione’ e ‘campionamento’ ago capillare fibra Chromatography Chromatographyisisaamature maturetechnique techniquenow. now. ©Gary Christian, Analytical Chemistry, 6th Ed. (Wiley) Descrizione generale della cromatografia I metodi cromatografici sono accomunati dalla separazione di sostanze presenti in miscela attraverso l’uso di una fase stazionaria e di una fase mobile. I componenti sono trasportati lungo la fase stazionaria dal flusso della fase mobile (Eluizione). La diversa ripartizione tra queste due fasi determina la separazione dei componenti. Fase stazionaria: fase fissa in una determinata posizione (o colonna o superficie planare) Fase mobile: fase che si muove lungo, o attraverso la fase stazionaria, trasportando con sé l’analita Classificazione La fase stazionaria è contenuta C. su colonna all’interno di un capillare e la fase mobile passa attraverso la fase stazionaria per gravità o per pressione. Cromatografia C. planare La fase stazionaria è supportata su una superficie piana e la fase mobile passa attraverso la fase stazionaria per capillarità. Classificazione generale Metodo specifico Fase stazionaria Tipo di equilibrio Cromatografia liquida (LC), fase mobile: liquido Liquido-liquido Liquido adsorbito su solido Ripartizione tra liquidi non miscibili Liquido, a fase legata Specie organiche legate a superficie solida Ripartizione tra liquido e superficie legata Liquido-solido Solido Adsorbimento Scambio ionico Resina a scambio ionico Scambio ionico Esclusione dimensionale Liquido in interstizi di solido polimerico Ripartizione/setacciamento Gas-liquido Liquido adsorbito su solido Ripartizione tra gas e liquido Gassoso, a fase legata Specie organiche legate a superficie solida Ripartizione tra gas e superficie legata Gas-solido solido Adsorbimento Gas-cromatografia, Fase mobile: gas Cromatografia di eluizione FASE MOBILE campione A+B B Colonna impaccata B A B RILEVATORE A B SEGNALE CROMATOGRAMMA A B TEMPO FASE MOBILE 1. 2. B A Il movimento lungo la colonna avviene solo quando il soluto si trova nella fase mobile La velocità dipende quindi dal tempo che il soluto trascorre nella fase mobile La frazione di tempo è piccola per composti molto trattenuti (B), mentre è grande per composti poco trattenuti (A). La ripartizione di un soluto tra fase stazionaria e fase mobile determina quindi i tempi di eluizione, e la possibilità di separare miscele complesse. CROMATOGRAMMA SEGNALE A B TEMPO POSIZIONE DEI PICCHI Informazioni QUALITATIVE Informazioni QUANTITATIVE DIMENSIONI (ALTEZZA E AREA) DEI PICCHI NECESSITA’ DI AVERE PICCHI BEN DEFINITI Velocità di migrazione dei soluti Dalla velocità relativa di 2 o più molecole da separare dipende l’efficacia della colonna La velocità dipende dai rapporti di ripartizione dei soluti nella FM e FS Rapporto di ripartizione o coefficiente di ripartizione Amobile Astazionaria K=CS/CM CS =K CM Questa proporzionalità è valida in un ampio intervallo di concentrazione, ciò determina l’indipendenza del tempo di eluizione dalla concentrazione Tempo morto e tempo di ritenzione SEGNALE tM tR tM: tempo necessario ad una specie non trattenuta per attraversare una colonna B A TEMPO tR: tempo che passa tra l’iniezione di un campione in colonna e la comparsa di un picco sul cromatogramma Specie non trattenuta Velocità media lineare del soluto e della fase mobile L v=L/TR u=L/TM Coefficiente di ripartizione e velocità di migrazione KA=CS/CM V = u x frazione di tempo che il soluto trascorre in FM v= u x numero di moli di soluto in fase mobile/numero di moli totali di soluto v=u CM VM 1 =uX X CM VM + CS VS v= u X 1 + CS VS /CM VM 1 1 + KAVS/VM CS =KA CM Fattore di capacità, indice della velocità di migrazione del soluto ¾Parametro che può essere calcolato sperimentalmente k’A = v=uX KA VS 1 v=uX 1 + KAVS/VM VM 1 L/TR =L/TM x 1 + k’A u=L/TM 1 k’A= 1 + k’A SEGNALE tM v=L/TR A t R - tM tM tR B TEMPO k’A ideale tra 1 e 5! Fattore di selettività, indice della velocità di migrazione relativa di due soluti ¾Parametro che può essere calcolato sperimentalmente k’B= A B VM KB KA α> 1 K’A= SEGNALE tM A tM KB VS K’B= α= t R - tM α= (tR)B - tM (tR)A - tM KA VS VM tR B TEMPO k’A= t R - tM tM Geometria del picco e efficienza della colonna SEGNALE Fronting TEMPO Tailing Tailing e fronting sono prodotti da un coefficiente di distribuzione non lineare A A 1 A2 variazione di geometria del picco B detector Fase stazionaria Interfaccia di scambio A flusso B Fase mobile SEGNALE considerando che una molecola è capace di effettuare migliaia di trasferimenti fase mobile-fase stazionaria possiamo immaginare il picco come centrato sul valore effettivo di tR attorno al quale c’è una distribuzione di errori “ casuali” di percorso Efficienza di una colonna cromatografica Altezza di un piatto teorico H N=L/H Numero di un piatti teorici N L L’efficienza di una colonna è proporzionale ad N, quindi inversamente proporzionale all’altezza di un piatto. L-1σ L+1σ tR H= σ2/ L Picco asimmetrico (tailing) W TEMPO N= 16 (tR/W)2 Intensità di colore = numero di molecole di analita N = 41.7(tR/W0.1)2/(A/B + 1.25) Variabili che influenzano l’efficienza di una colonna ¾Velocità lineare della fase mobile ¾Coefficiente di diffusione nella fase mobile (DM) ¾Coefficiente di diffusione nella fase stazionaria (DS) ¾Fattore di capacità ¾Diametro delle particelle della fase stazionaria impaccata ¾Spessore del film liquido sulla fase stazionaria ¾Velocità lineare della fase mobile H Max efficienza 0.5 ¾Cromatografia liquida colonne 25-50 cm ¾Gas-cromatografia fino a decine di m 1.0 1.5 cm/sec Teoria dell’allargamento della banda; equazione di Van Deemter H=B/u + CSu + CMu Diffusione longitudinale: direttamente proporzionale coefficiente di diffusione importante in GC che in LC Coefficiente di trasferimento di massa nella fase stazionaria: Film di liquido su particella solida - direttamente proporzionale a (spessore)2 , inversamente proporzionale a DS nel film Fase stazionaria solida – direttamente proporzionale al tempo adsorbimento/desorbimento supporto Fase stazionaria liquida o solida al più Fase mobile Coefficiente di trasferimento di massa nella fase mobile: inv. prop. a DM, funzione di (diametro particelle)2 (diametro colonna)2 e u La diffusione turbolenta diminuisce a flussi bassi di fase mobile L’allargamento di banda può essere minimizzato dall’utilizzo di particelle piccole e regolari (p.es. sfere) Diffusione turbolenta Risoluzione di una colonna Sovrapposizione del 4% Sovrapposizione dello 0.3% Controllo di flusso SCHEMA DI UN GAS CROMATOGRAFO I Igas gasdiditrasporto trasportoinerti inertiutilizzati utilizzatisono sonoHe, He,Ar, Ar, NN2, , CO 2 e H2. La pressione in ingresso è 2 CO2 e H2. La pressione in ingresso è 10-50 10-50 psi psi corrispondenti corrispondenti aa 30-150 30-150 mL/min mL/min per colonne impaccate e 1-25 mL/min per colonne impaccate e 1-25 mL/min per per 2=6.89 x 103 colonne capillari. (1 psi=lb/inch 2 colonne capillari. (1 psi=lb/inch =6.89 x 103 -2 Pa=6.8 Pa=6.8xx10 10-2Atm) Atm) IlIl campione campione (vol (vol da da nL nL fino fino aa 20 20 µL) µL) èè iniettato iniettato mediante mediante siringa siringa inin una una camera camera aa rapida rapidavaporizzazione vaporizzazioneinintesta testaalla allacolonna colonna Le Lecolonne colonnepossono possonoessere essereimpaccate impaccateoocapillari capillari(lunghezza (lunghezzada da22aa50 50m) m)eesono sonoininacciaio, acciaio,vetro, vetro, silice fusa o teflon. La t deve essere controllata a livello di decimi di grado e deve essere appena silice fusa o teflon. La t deve essere controllata a livello di decimi di grado e deve essere appena superiore superiorealla allatemperatura temperaturadidiebollizione ebollizionedell’analita. dell’analita.Per Percampioni campionicomplessi complessisisiusano usanogradienti gradientididi temperatura temperaturaprogrammabili. programmabili. Colonne lunghezza Colonneimpaccate: impaccate: lunghezza2-3 2-3m, m, riempimento riempimentoterra terradididiatomee diatomee(dia (dia0.15-0.25 0.15-0.25mm; mm;area area 2 superficiale > 1m /g) ricoperto di fase stazionaria liquida 2 superficiale > 1m /g) ricoperto di fase stazionaria liquida Colonne Colonnetubolari tubolariaperte aperte(WCOT): (WCOT):colonne colonnecapillari capillaricon conpareti paretiricoperte ricoperteda dafase fasestazionaria stazionaria Colonne Colonnetubolari tubolariaperte aperteaasupporto supportoricoperto ricoperto(SCOT): (SCOT):alla allaparete paretedel delcapillare capillaresono sonoadese adeseparticelle particelle solide ricoperte di fase stazionaria solide ricoperte di fase stazionaria Le Lecolonne colonnecapillari capillariaabase basedi disilice silicefusa fusahanno hannouna unarisoluzione risoluzionemigliore migliore ¼ inch dia. x 6ft impaccata 0.03 inch dia. X 500 ft acciaio capillare 0.25 dia. X 50 m in vetro capillare Gas cromatogramma di estratto di menta piperita La Lachiave chiaveper perlalarisoluzione risoluzioneèèrappresentata rappresentatadalle dallediverse diversefasi fasi stazionarie. stazionarie.Tra Tralelepiù piùcomuni comunicicisono sonoI Ipolisilossani. polisilossani. I Irivelatori rivelatoripiù piùcomuni comunisono sonoaaionizzazione ionizzazionedi difiamma, fiamma,aaconducibilità conducibilitàtermica, termica, termoionici termoionicieequelli quelliaaspettrometria spettrometriadi diMassa! Massa! Le Lecondizioni condizionicromatografiche cromatograficherappresentano rappresentanosempre sempreun uncompromesso compromessotra tra tempo tempodi dianalisi, analisi,risoluzione risoluzioneeesensibilità sensibilità Fig. 20.6. Analisi con temperatura programmata . L’uso L’usodi distandard standardinterni internièècomune comune in GC. Questi migliorano l’analisi in GC. Questi migliorano l’analisi minimizzando minimizzandovariazioni variazionitra tradiversi diversi strumenti, nella prparazione strumenti, nella prparazione dei dei campioni campioni ee nella nella iniezione iniezione del del campione. campione. Per Per calcolare calcolare lala concentrazone concentrazone della specie si usa il della specie si usa ilrapporto rapportotra traI I picchi picchianalita/standard analita/standardinterno. interno. autocampionatore Strumento GC-MS da banco Schema a blocchi di uno spettrometro di massa La sorgente di ionizzazione converte molecole neutre in ioni che vengono separate secondo il loro rapporto m/z. Ogni molecola si frammenta (carica) in ioni caratteristici in base alla sorgente. Le Lesorgenti sorgentiaaimpatto impattoelettronico elettronicosono sonoad adelevata elevataenergia energiaeeframmentano frammentanolele molecole molecolein inmodo modocosì cosìintenso intensoche cheaavolte volte manca mancalo loione ionemolecolare. molecolare.Da Da informazioni sulla struttura della molecola. informazioni sulla struttura della molecola. Le Lesorgenti sorgentiaaionizzazione ionizzazionechimica chimicasono sonoaaenergia energiainferiore, inferiore,lo loione ionemolecolare molecolareèè sempre sempredominante. dominante. Le Lesorgenti sorgentiaaElettrospray ElettrosprayeeMALDI MALDIsono sonousate usatein inHPLC HPLC I Ipicchi picchivengono vengononormalizzati normalizzatiassegnando assegnandoililvalore valoremassimo massimoalalpicco piccopiù piùfrequente frequente(picco (piccobase) base) + (m/z = 31), m/z = 32 è il picco molecolare e c’è un Nell’esempio + (m/z = 31), m/z = 32 è il picco molecolare e c’è un Nell’esempioililpicco piccobase basecorrisponde corrispondeaa CH CH2OH OH 2 13 piccolo picco a m/z=33 corrispondente allo ione molecolare piccolo picco a m/z=33 corrispondente allo ione molecolareper perl’isotopo l’isotopo 13CC(abbondanza (abbondanzarelativa relativa== 1.1%) 1.1%) Le Letabelle tabelledidiabbondanza abbondanzarelativa relativasono sonousate usateper perassegnare assegnareI Ivari varipicchi picchi Spettro di massa EI del metanolo Nella Nellaionizzazione ionizzazionechimica chimica un ungas gasreagisce reagiscecon conl’analita l’analitaattraverso attraversotrasferimento trasferimentodi di protoni o idruri e da una frammentazione limitata, lo ione molecolare è sempre protoni o idruri e da una frammentazione limitata, lo ione molecolare è sempre + + dominante. dominante.Ad Adesempio esempioililmetano metanoproduce produceCH CH5 +eeCC2HH5 + che chereagisce reagiscecosì: così: 5 + + CH CH55+++MH MH==MH MH22+++CH CH44 CC2HH5++++MH ==MM++++CC2HH2 MH 2 5 2 2 La Laframmentazione frammentazioneda daluogo luogoaaioni ioniM-H M-HooM+H M+H 2 5 Analizzatore Analizzatorepiù piùutilizzato utilizzatoper perGC-MS. GC-MS. Una Unadifferenza differenzadi dipotenziale potenziale(U) (U)diretta direttaeeuna unadifferenza differenzadi dipotenziale potenzialeoscillante oscillanteaa radiofrequenze radiofrequenze(V (Vcos cosωt) ωt)vengono vengonoapplicate applicatealle alle44barre barreparallele. parallele. (ω (ω==frequenza, frequenza,t t== tempo). tempo). Due Duepoli polisono sonopositivi positivi(U (U++VVcos cosωt) ωt)eedue due negativi negativi[-(U [-(U++VVcos cosωt)]. ωt)]. IlIlpotenziale potenziale applicato determina la traiettoria degli ioni. Solo quelli con rapporto m/z applicato determina la traiettoria degli ioni. Solo quelli con rapporto m/zparticolare particolare raggiungono il rivelatore. raggiungono il rivelatore. spettrometro di massa a quadrupolo. L’analizzatore L’analizzatoreaatempo tempodi divolo volo(TOF) (TOF)èèadatto adattoper permolecole molecolegrandi, grandi,gli gliioni ionivengono vengono accelerati ed entrano nel tubo con energia cinetica identica. accelerati ed entrano nel tubo con energia cinetica identica. Ioni Ionicon conm/z m/zdivers diversraggiungono raggiungonoililrivelatore rivelatoreaatempi tempidifferenti. differenti. Spettrometro di massa a tempo di volo sopra: sopra:gas gascromatogramma cromatogramma(corrente (correnteionica ionicatotale) totale)didicocaina cocainainincampione campionedidiurina urina InInmezzo: mezzo:spettro spettrodidimassa massadel delpicco piccoaa 11.5 11.5min. min. Sotto Sottospettro spettrodidimassa massadidiuno unostandard standarddidicocaina. cocaina. Conferma di Cocaina per GC-MS UltraFast GC-TOF-MS of 30 pesticides in 3 minutes RT: 1.31 - 2.96 2.49 100 2.25 95 90 85 80 75 70 65 1µg/ml, 1 µl splitless 25 spectra/sec 50-600 u ramp rate 210°C/min 2.26 2.38 2.28 2.89 2.59 2.48 2.69 2.55 Relative Abundance 60 55 2.14 50 No deconvolution 45 1.78 40 35 1.90 2.78 2.00 1.96 1.62 30 2.65 2.32 1.84 2.40 2.86 2.17 1.72 2.03 25 2.20 1.57 20 2.82 2.94 15 10 5 0 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 2.2 Time (min) 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 K. Patel et al – Poster presentation - 16th IMSC 2003 Componenti per cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC) Vengono Vengonousate usatecolonne colonneimpaccate impaccatecon conpiccole piccoleparticelle, particelle,iningrado gradodidioperare operareaapressioni pressioni 1000-3000 1000-3000 psi psi I Icontenitori contenitoriper per I Isolventi solventipossono possonocontenere conteneresolventi solventiaadiversa diversapolarità polaritàper pereffettuare effettuareeluizioni eluizioniinin gradiente gradiente Una Unapre-colonna pre-colonnaèèpresente presenteper pertrattenere trattenerecomposti compostiad adelevato elevatoadsorbimento adsorbimentoche chenon nonsarebbero sarebbero eluiti e materiale particolato. eluiti e materiale particolato. I Irivelatori rivelatoriclassici classicisono sonoad adindici indicididirifrazione, rifrazione,UV, UV,DAD, DAD,aafluorescenza fluorescenzaeevoltammetrici voltammetriciooMS MS La Ladiffusione diffusionemolecolare molecolareèèmeno menoimportante importantenei neiliquidi liquidi IlIltrasferimento trasferimentodi dimassa massaèèpiù piùimportante importante L’allargamento L’allargamentodi dibanda bandaèèdovuto dovutoaaeffetti effettiextra extracolonna colonna H=B/u + CSu + CMu Nelle Nellesfere sferemicroporose microporoseililsoluto solutodiffonde diffondenella nellafase fasemobile mobilestagnante stagnante bagnando i pori. bagnando i pori. Le Lemicrosfere microsfereaaperfusione perfusionehanno hannoun unmix mixdi dipori porigrandi grandieepiccoli piccolivengono vengono usate a flussi elevati per molecole grandi e proteine. . usate a flussi elevati per molecole grandi e proteine. . Microsfere Microsferenon nonporose porosesono sonopiccole piccole (1.5-2.5 (1.5-2.5µm µmvs. vs.3-10 3-10µm). µm).IlIlfilm film sottile non presenta fase mobile stagnante per un trasporto di massa sottile non presenta fase mobile stagnante per un trasporto di massaed ed una separazione rapidi. Presentano una capacità inferiore ed una una separazione rapidi. Presentano una capacità inferiore ed una contropressione contropressioneelevata. elevata. Colonne HPLC N = 9000-15000 misura iniezione dalla pompa loop dalla pompa loop alla cella scarico alla cella scarico valvola ad iniezione Cromatografia Cromatografialiquida liquida di diripartizione ripartizioneaafase faselegata legata Gruppi Gruppisilanolici silanolicisulla sullafase fasestazionaria stazionariadidisilice silicefusa fusavengono vengonolegati legatiaaclorosilani clorosilaniper per produrre una fase organica lipofilica (C-8; C18) produrre una fase organica lipofilica (C-8; C18) La Lacromatografia cromatografiasisidice dicedidiripartizione ripartizioneaafase faseinversa inversa In InHPLC, HPLC, lelecondizioni condizionidi diseparazione separazionevengono vengonovariate variatecambiando cambiandolalafase fase mobile. mobile. Nell’esempio Nell’esempiolalapolarità polaritàdel delsolvente solventeèèstata stataaggiustata aggiustataalalfine finedi diottenere ottenere valori di 0.5 to 20 (α = k /k ). valori di 0.5 to 20 (α = k2 /k1 ). 2 1 Cromatografia Cromatografiaad adesclusione esclusionedimensionale dimensionale Le Lemolecole molecolepenetrano penetranonel nelgel gelininfunzione funzionedella dellagrandezza grandezzaeedella della forma forma ©Gary Christian, Analytical Chemistry, 6th Ed. (Wiley) Cromatografia Cromatografiaaascambio scambioionico ionico La Lamaggior maggiorpate patedelle delleseparazioni separazioniutilizza utilizzaresine resinecon conscambiatore scambiatoreacido acidoforte. forte. Resine Resinead adacido acidodebole debolevengono vengonoutilizzate utilizzateper perproteine proteineeepeptidi peptidiritenuti ritenutitroppo troppo fortemente da quelle ad acido forte. fortemente da quelle ad acido forte. L’eluizione L’eluizioneviene vieneeffettuata, effettuata,ininquesto questocaso, caso,con conuna unasoluzione soluzionedidiuno unoione ioneiningrado gradodidi competere competere con con gli gli analiti analiti per per i i gruppi gruppi ionici ionici della della resina, resina, ilil frazionamento frazionamento avviene avviene inin 2+ 2+ 2+ base baseaaKK(p.es (p.esper peruna unaresina resinaad adacido acidosolfonico solfonicoKKva vanell’ordine nell’ordine Ba Ba2+ >>Pb Pb2+>>Ca Ca2+ 2+ 2+ + + + + + + >>Ni Ni2+ >>Cd Cd2+>>> >>>Ag Ag+>>Cs Cs+>>KK+>Na >Na+ >>HH+>>LiLi+. .Si Sipuò puòlavorare lavorarecon conun unsistema sistemaaa colonna colonnasingola singolaoocon consoppressore soppressore L’uso L’usodella dellacolonna colonnasoppressore soppressoreha hapermesso permessolaladeterminazione determinazioneaabassi bassilivelli livellidi di ioni mediante rivelatori conduttimetrici ioni mediante rivelatori conduttimetrici La Lacolonna colonnaanalitica analiticasepara separagli glianaliti analitiionici, ionici,lalacolonna colonnasoppressore soppressoreneutralizza neutralizzailil solvente solventeriducendone riducendonelalaconducibilità conducibilitàeepuò puòconvertire convertireI Isali saliad adacidi acidioobasi basiforti forti L’interfaccia L’interfacciaper perun unHPLC-MS HPLC-MSdeve deveessere esserein ingrado gradodi dirimuovere rimuovereililsolvente solventeeedi di convertire convertiresoluti solutilabili labilinon-volatili non-volatiliin informa formagassosa. gassosa. Nell’interfaccia Nell’interfaccia“particle “particlebeam” beam”L’eluente L’eluenteviene vienenebulizzato nebulizzato con conHe Hein inun unaerosol aerosolin inuna una camera camerariscaldata riscaldataaabassa bassapressione. pressione. He Heeeililsolvente solventesono sonopiù piùleggeri leggerieesono sonoeliminati eliminati tramite una pompa tramite una pompa Gli Glianaliti analitivengono vengonointrodotti introdottiin inuna unasorgente sorgentead adimpatto impattoelettronico elettronico(EI). (EI). L’interfaccia L’interfacciapiu piuutilizzata utilizzataèèl’elettrospray l’elettrosprayperchè perchèrappresenta rappresentaun unprocesso processodi di ionizzazione ionizzazionesoft. soft. IlIlcampione campioneviene vienenebulizzato nebulizzatoed edèècomtemporaneamente comtemporaneamentesoggetto soggettoad aduna unaelevata elevata differenza di potenziale all’interno dell’interfaccia. Si formano delle goccioline differenza di potenziale all’interno dell’interfaccia. Si formano delle goccioline cariche caricheche chevengono vengonodesolvatate desolvatatetramite tramitecalore caloreeegas gasinerte. inerte.Le Lemolecole molecolecariche cariche entrano nel rivelatore. entrano nel rivelatore. John JohnFenn Fenn ha haricevuto ricevutonel nel 2002 2002ililpremio premio Nobel Nobelin inchimica chimicaper perlo losviluppo sviluppodell’ESI dell’ESI L’eluente L’eluentesale saleper percapillarità. capillarità.IlIlcontenitore contenitoreviene vienechiuso chiusoper perprevenire prevenire l’evaporazione. l’evaporazione. Vengono Vengonoutilizzate utilizzatelelestesse stessefasi fasistazionarie stazionarieutilizzate utilizzatein incromatografia cromatografialiquida liquidasu su colonna colonna Cromatografia su strato sottile Per Per elettroforesi elettroforesi capillare capillare sisi intende intende tutta tutta una una serie serie didi tecniche tecniche separative separative che che utilizzano utilizzano capillari capillari (25-75 (25-75 µm µm diadia- 25-100 25-100 cm cm lunghezza) lunghezza) nei nei quali quali sisi realizzano realizzano migrazioni migrazioni differenziali differenziali didi sostanze sostanze cariche cariche sotto sotto l’influenza l’influenza didi un un intenso intenso campo campo elettrico elettrico (voltaggi (voltaggi compresi tra 10-50 KVolt) compresi tra 10-50 KVolt) Elettroforesi capillare I I gruppi gruppi sul sul capillare capillare ionizzano ionizzano oltre oltre pH pH 22 ee producono producono cariche cariche negative negative che che formano formanoun undoppio doppiostrato stratocon congli gliioni ionipositivi positividel deltampone tampone La La fase fase mobile mobile solvatata solvatata (diffuse (diffuse layer) layer) carica carica migra migra verso verso ilil catodo catodo ee ilil solvente solventeviene vienetrascinato trascinato (flusso (flussoelettroosmotico) elettroosmotico) Tutti Tutti gli gli analiti analiti vengono vengono trasportati trasportati ma ma aa velocità velocità diverse diverse dovute dovute alla alla diversa diversa 2 mobilità mobilitàelettroforetica elettroforetica(µ). (µ).IlIltempo tempodi dimigrazione migrazioneèèdato datoda da LL==l l2/µ/V /µ/Vdove dovel lèè la lalunghezza lunghezzadel delcapillare capillareeeVVililvoltaggio voltaggioapplicato applicato Distribuzione di carica e flusso elettroosmotico IlIlflusso flussoelettrosmotico elettrosmoticogenerato generatoèècostante costantelungo lungotutto tutto ililcapillare capillare Gli Glianaliti analitisisimuovono muovonoalla allastessa stessavelocità velocitàlungo lungotutto tuttoililcapillare, capillare,laladispersione dispersione èèminima e i picchi molto stretti. minima e i picchi molto stretti. L’efficenza L’efficenzadi diseparazione separazioneèècirca circa10-100 10-100volte voltemaggiore maggiorerispetto rispettoall’HPLC. all’HPLC. IlIlvolume volumetotale totalenel nelcapillare capillareèèdell’ordine dell’ordinedei deiµL, µL,ililvolume volumedi dicampione campioneiniettato iniettato èènell’ordine dei nL! nell’ordine dei nL! Separazione di 2-7 attomoli di una miscela di 18 aminoacidi (rivelazione fluorimetrica) ANALISI ENZIMATICA Comprende le tecniche di dosaggio che comportano l’uso di enzimi. Molto importanti a livello biochimico e analitico. Sfruttano la selettività di riconoscimento tra un enzima ed i suoi substrati. E’ possibile dosare sia l’attività enzimatica che i substrati. DOSAGGIO DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA In opportune condizioni sperimentali, la velocità di una reazione enzimatica è direttamente proporzionale alla concentrazione di enzima. L’attività enzimatica viene espressa in unità internazionali o in Katal (Kat). 1 U = quantità di enzima che trasforma una µmol di substrato al min in condizioni sperimentali costanti; 1 Kat = una mole di substrato al secondo. 1 Kat = 6 × 107 U. Nel caso in cui il PM del substrato non è noto (proteinasi, DNAsi, RNAasi) si usano unità arbitrarie. La velocità di una reazione enzimatica varia nel tempo a causa della diminuzione del substrato o inibizione da prodotto o per catalisi della reazione inversa è quindi necessario dosare l’attività enzimatica alla velocità iniziale (v0). E’ opportuno non superare il 5% della reazione complessiva. I metodi di dosaggio continui sono sempre da preferire a quelli discontinui per una determinazione accurata della v0 FATTORI CHE INFLUENZANO L’ATTIVITA’ ENZIMATICA Concentrazione di enzima. Purchè sia valida la condizione alla base dell’equazione di Michaelis ([S] >> [E]) v0 è direttamente proporzionale a [E]. Concentrazione di substrato. La dipendenza tra concentrazione di substrato e v0 è data dalla Michaelis v0 =VMAX S /Km S La Km è indipendente dalla quantita di E Per [S] << Km la reazione è di pseudo primo ordine (dipendendente dalla [S]) per [S] >> Km, la reazione è di ordine zero Valori di v0 pari al 91%, 95%, 98% e 99% di VMAX si raggiungono per valori di [S] di 10 Km, 19 Km, 49 Km e 99 Km. Per determinare l’attività enzimatica bisogna lavorare più vicino possibile alla VMAX (condizioni saturanti di substrato). La Km varia con le condizioni sperimentali (p.es. enzimi da varie fonti). Per reazioni a più substrati la cinetica è più complessa. Temperatura. Nelle reazioni semplici la temperatura influenza secondo l’equazione di Arrhenius k = a e-Ea/RT In quelle enzimatiche, oltre una certa temperatura c’è una diminuzione dovuta ad inattivazione termica. Nel tratto ascendente il Q10 (variazione per 10° C) è uguale a ≈ 2. La temperatura influenza anche la Km! pH. Se sono presenti 2 amminoacidi con gruppi dissociabili all’interno del sito attivo si ha una curva a campana con un optimum di pH. Se è presente un solo gruppo si avrà un solo tratto della curva, se non ci sono gruppi dissociabili v0 è indipendente da pH. Sia il tipo di tampone utilizzato che la sua forza ionica possono influenzare la misura, è opportuno utilizzare un tampone con pK vicino al pH ottimale della reazione Modificatori. Molto spesso è necessario aggiungere alla miscela di reazione attivatori della reazione enzimatica (p.es. ADP per la glutammico deidrogenasi, Mg2+ per alcune chinasi) o composti che mantengano lo stato redox attivo dell’enzima (glutatione o cisteina per la riduzione degli SH dell’enzima). Altre volte è invece necessario prevenire l’inibizione dell’enzima (p.es. con EDTA per eliminare l’inibizione da metalli) TECNICHE DI DOSAGGIO Reazioni semplici. I substrati (anche di sintesi) o i prodotti della reazione possono essere rilevati per via spettrofotometrica, fluorimetrica, elettrochimica etc. (p.es . Deidrogenasi NAD(P) dipendenti). Reazioni accoppiate. Quando non è possibile determinare la reazione direttamente, si accoppia con una o più reazioni indicatrici. La reazione indicatrice deve essere molto rapida in modo da non influenzare la cinetica della reazione da determinare. S → P →Q La reazione S → P è catalizzata dall’enzima da dosare, quella P → Q dall’enzima indicatore. All’inizio della reazione, la concentrazione di P è bassa e l’enzima indicatore non può lavorare alla Vmax. Questo produce un ritardo (fase lag). Misura del bianco Attività = (∆E/min) /ε d n × (V/v) = U/mL ε = coefficiente di estinzione molare; d = cammino ottico; n= stechiometria della reazione; V = volume di reazione (in mL); v = volume di campione (in mL) PROBLEMI a = saggio OK b = non è stato sottratto il bianco c = poco E indicatore, d = presenza di attivatore e = presenza di inibitore irreversibile DOSAGGIO DI ANALITI Condizioni: L’azione dell’enzima deve essere specifica, l’enzima deve essere ad elevato grado di purificazione, nel campione non devono essere presenti inibitori, la reazione deve essere veloce. Esistono due metodi per la misura di analiti mediante analisi enzimatica: a termine (end-point), cinetico. End-point: si lascia che la reazione enzimatica raggiunga l’equilibrio, non è rilevante ne la quantità di enzima usato ne il tempo di analisi. Il segnale, (p.es. assorbanza) prima e dopo l’aggiunta di E da la concentrazione di analita. Non è necessaria una retta di taratura (se si conosce ε) E’ necessario che l’equilibrio della reazione sia spostato fortemente verso destra. Talvolta vengono usati accorgimenti per spostarlo, quali uso di agenti sequestranti i prodotti o variazione di pH. Si può calcolare la quantità di enzima da usare nel saggio dal’espressione cinetica delle reazione di primo ordine ([S]<<Km) t = 1/k 2,3 log [S]0 / ([S]0 – x] k = VMAX/Km ; [S]0 = concentrazione del substrato al t = 0 ; x = concentrazione del substrato al tempo t Per una reazione completa al 99%: t = 1/k 2,3 log 1 / (1 - 0.99) = 4.6 /k = 4.6 Km/VMAX Se voglio il 99% della reazione in 4.6 min Km/VMAX deve essere 1! Analogamente si può calcolare la quantità di enzima necessaria a far avvenire la reazione nel tempo desiderato. I kit enzimatici spettrofotometrici in commercio utilizzano metodi endpoint. Metodi cinetici. La concentrazione di substrato viene determinata in base alla velocità della reazione enzimatica. Sono importanti la quantità di enzima utilizzato e il tempo. E’ necessaria sempre una retta di taratura. Misura diretta: è utilizzata negli analizzatori automatici perché è necessario misurare la velocità in tempi rapidi perché il substrato viene consumato immediatamente. Dosaggio catalitico e amplificazione enzimatica: una reazione rigenerante l’analita viene usata per poter misusare a tempi più lunghi e aumentare la sensibilità Dosaggio di acido lattico con lattato ossidasi (LOD) e lattico deidrogenasi (LDH): LOD lattato + O2 → piruvato + H2O2 LDH piruvato + NADH + H+ → lattato + NAD+ IMMOBILIZZAZIONE ENZIMATICA Uso dello stesso enzima per un numero elevato di analisi Possibilità di posizionare l’enzima su un sensore (p.es elettrodi ad enzima) o in un reattore per analisi in flusso Immobilizzazione di tipo fisico (non covalente) : maggiore attività ritenuta dall’enzima, tempo di vita inferiore. Immobilizzazione di tipo chimico (covalente). Minore attività iniziale, maggiore stabilità. Si usano supporti polimerici contenenti gruppi funzionali che possono essere legati a quelli enzimatici (p.es. amino gruppi dell’enzima + aminogruppi del supporto + glutaraldeide). Che cosa cambia con l’immobilizzazione covalente? • La Km (apparente) aumenta • L’attività è 0.5-5% della iniziale • L’optimum di pH dell’attività viene spostato • L’enzima è più resistente ad attivatori ed inibitori • L’enzima può essere utilizzato più volte (tempo di vita operazionale e di mantenimento) L’immobilizzazione su reattore permette in genere di ritenere una maggior quantità di enzima rispetto a quella su membrana. Questo aumenta l’efficienza di reazione (% di substrato convertito) ed il tempo di vita.
