Espressione della CK20 nel tratto gastroenterico nell`embrione e nel

© Springer-Verlag 2001
Pathologica (2001) 93:640-644
A RT I C O L O O R I G I NA L E
M.C. Botta · R. Ambu · C. Liguori · P. Van Eyken · A. Pisanu · A. Cabras · H. Hofler · M. Werner · G. Faa
Espressione della CK20 nel tratto gastroenterico nell’embrione e nel feto
Cytokeratin 20 expression in developing human gut
Riassunto Il classico catalogo delle citocheratine umane,
gruppo eterogeneo di proteine presenti nella quasi totalità
degli epiteli, si è ampliato nel 1990 con la scoperta della citocheratina 20 (CK20). Nell’uomo la CK20 presenta una distribuzione caratteristica: viene espressa nel tratto gastroenterico, nelle cellule di Merkel e nell’urotelio. Allo
scopo di analizzare l’espressione della CK20 nell’intestino
umano durante la vita intrauterina, sono stati esaminati prelievi di mucosa esofagea, gastrica, intestinale (tenue, colon
e appendice vermiforme) in feti, a partire dalla dodicesima
settimana di gestazione, e in neonati. La ricerca immunoistochimica della CK20 è stata eseguita su sezioni paraffiniche. La mucosa esofagea non ha mostrato immunoreattività
per la CK20 in tutti i soggetti testati. Negli altri distretti esaminati, la CK20 ha mostrato una distribuzione non omogenea, con tre quadri principali di reattività: il primo, osser-
vato nello stomaco e nel tenue, è caratterizzato da un progressivo aumento del numero di cellule CK20-positive durante la gestazione; il secondo, tipico del duodeno, presenta una progressiva diminuzione dalla dodicesima alla quarantesima settimana di gestazione; il terzo, osservato nel colon e nell’appendice vermiforme, è caratterizzato da una
costante positività durante la vita fetale. I nostri dati preliminari indicano che l’immunoreattività dell’epitelio del
tratto gastroenterico per la CK20 presenta notevoli variazioni nei vari tratti del tubo digerente. Il grado di positività
per la CK20 può essere utilizzato come marcatore di maturazione epiteliale solo a livello di mucosa gastrica e di intestino tenue. Ulteriori studi appaiono necessari per verificare se tali differenze nell’espressione della CK20 permangano anche nei soggetti adulti.
Parole chiave Citocheratine • CK20 • Tratto gastroenterico
Key words Cytokeratins • CK20 • Gastrointestinal tract
Introduzione
M.C. Botta () • R. Ambu • C. Liguori • G. Faa
Dipartimento di Citomorfologia, Sezione di Anatomia Patologica,
Ospedale San Giovanni di Dio,
Via Ospedale 60, I-09124 Cagliari, Italia
e-mail: [email protected]
Tel.: +39-070-6092370/6092488
Fax: +39-070-657882
A. Van Eyken
Department of Pathology,
K.U. Leuven, Belgio
A. Pisanu
Cattedra di Chirurgia Generale
Università di Cagliari, Cagliari, Italia
A. Cabras • H. Hofler • M. Werner
Institute of Pathology,
GSF&TUM, Munich, Germania
Le citocheratine rappresentano un insieme di 20 polipeptidi,
identificabili nelle cellule epiteliali umane [1] e di 10 polipeptidi caratteristici dei trittici presenti nei capelli e nelle unghie [2]. Il catalogo delle citocheratine epiteliali, comprendente 19 tipi di citocheratine [1], si è recentemente ampliato
con la scoperta della CK20, proteina costituita da 424 aminoacidi con PM di 48.553 Da, evidenziata inizialmente nell’epitelio intestinale [3]. Successivamente, una nuova citocheratina, definita CK21, è stata descritta nell’intestino del
ratto, dove mostra una distribuzione simile a quella della
CK20 [4]. Nell’intestino dell’adulto, la CK20 viene espressa soprattutto negli enterociti differenziati e nelle cellule caliciformi dei villi intestinali; nelle cripte ghiandolari solo poche cellule isolate sono CK20-positive [3]. Questa distribuzione della CK20 ha permesso di correlare la sua espressio-
M.C. Botta et al.: Espressione della CK20 nel tratto gastroenterico nell’embrione e nel feto
ne con la differenziazione cellulare, facendola considerare
un marcatore della differenziazione enterocitaria [5]. I primi
studi sull’espressione della CK20 nelle cellule dell’intestino
tenue durante l’embriogenesi, hanno dimostrato la sua comparsa intorno all’ottava settimana gestazionale, nell’epitelio
dei villi. Nelle settimane successive, si è evidenziato un gradiente cripte-villi; gli enterociti dei villi hanno mostrato diversi gradi di positività per la CK20, che appariva espressa
soprattutto dalle cellule caliciformi. Parte degli enterociti dei
villi risultavano costantemente CK20-negativi [6]. Sulla base di questi dati, ci è parso di un certo interesse studiare l’espressione della CK20 nei vari segmenti del tratto gastroenterico durante lo sviluppo fetale e nel neonato al fine di: (1)
verificare se l’immunoreattività per la CK20 sia omogenea
nei vari segmenti del tratto gastroenterico; (2) definire se la
CK20 si comporti come marcatore di differenziazione cellulare anche nello stomaco e nel colon; (3) accertare se la
CK20 sia segregata all’epitelio superficiale o se venga
espressa nelle ghiandole della mucosa intestinale.
Pazienti e metodi
Oggetto del nostro studio sono stati 1 embrione di 12 settimane, 4 feti di età gestazionale compresa tra la tredicesima
e la ventunesima settimana, 3 pretermine immaturi di 22, 32
e 37 settimane gestazionali e 2 neonati di 40 settimane. La
causa mortis dei primi 5 casi studiati riguardava una patologia placentare, nei rimanenti 5 casi non si ha una comune
causa mortis (emorragia cerebrale, emorragia polmonare
massiva). All’esame macroscopico, in tutti i casi esaminati,
l’apparato gastrointestinale non presentava alterazioni patologiche ed appariva normoconformato. In tutti i soggetti esaminati, sono stati eseguiti prelievi dei seguenti organi: esofago, stomaco, duodeno, intestino tenue, appendice vermiforme, colon discendente. I prelievi sono stati fissati in
formalina tamponata al 10% e inclusi in paraffina. Sulle sezioni paraffiniche sono state eseguite le seguenti colorazioni di routine: ematossilina-eosina, PAS, alcian. La ricerca
immunoistochimica della CK20 è stata eseguita con tecnica
streptavidina-biotina (DAKO), utilizzando l’anticorpo anti
CK20, clone IT-Ks 20.8 (Biogenex, diluizione 1:50), dopo
passaggio delle sezioni in forno a microonde per 5 min, in
tampone citrato. Come controllo positivo abbiamo utilizzato
il fegato di ratto adulto, che ha mostrato tipica positività per
la CK20 nell’epitelio dei dotti biliari [7]. Come controllo negativo abbiamo utilizzato una biopsia epatica umana. Il grado di immunoreattività per la CK20 è stato valutato secondo la seguente scala semiquantitativa: grado 0 = assenza di
reattività; grado 1 = positività per la CK20 in meno del 10%
delle cellule epiteliali intestinali; grado 2 = positività nel 1050%; grado 3 = positività nel 51-80%; grado 4 = presenza
della CK20 in più dell’80% delle cellule del tratto di intestino esaminato (Fig. 1).
641
Risultati
Alla 12a settimana di gestazione, se si eccettua l’esofago,
che è risultato negativo per la CK20 in tutti i soggetti esaminati, la CK20 è risultata espressa in tutto il tratto digerente umano. Il grado di immunoreattività, espresso come
percentuale di cellule epiteliali che esprimono la CK20, è
risultato diverso a seconda del tratto esaminato. Nello stomaco e nell’intestino tenue, alla 12a settimana, la CK20
era presente focalmente, in cellule isolate. Nel duodeno,
alla 12a settimana l’immunoreattività era più marcata, interessando più del 10% delle cellule epiteliali e configurando il grado 2 di positività immunoistochimica. Nel colon e nell’appendice, la CK20 era localizzata in oltre il
50% delle cellule con il grado 3 di positività immunoistochimica.
Durante lo sviluppo embrionale, in ognuno dei segmenti
del tratto gastroenterico studiati, si sono osservate delle variazioni nel numero di cellule che esprimono la CK20.
Nello stomaco, si è osservato un aumento progressivo
di immunoreattività: mentre prima della 14a settimana di
gestazione si osserva un grado di positività 1, alla 14a
settimana l’immunoreattività aumenta e passa al grado 2;
alla 21a settimana la positività immunoistochimica per la
CK20 aumenta ulteriormente, passando al grado 3; alla
32a settimana gestazionale, la positività risulta ulteriormente aumentata esprimendo il grado 4 che viene riscontrato anche in 37a settimana e al termine della gestazione
(Fig. 2).
Nel duodeno, si è osservato un incremento nella reattività
per la CK20 già alla 13a settimana, epoca in cui più dell’80%
delle cellule epiteliali è risultato positivo. Tale positività diffusa è stata osservata anche alla 14a, 16a e 21a settimana. Alla
22a settimana si registra un decremento di positività fino al
grado 3 e tale grado di positività veniva confermato anche alla 32a, 37a e 40a settimana gestazionale (Fig. 3).
Un andamento simile a quello descritto nello stomaco
è stato osservato a livello dell’intestino tenue. Alla 12a
settimana l’immunoreattività per la CK20 è risultata focale, localizzata prevalentemente nell’epitelio dei villi,
sia nelle cellule fondamentali che nelle cellule caliciformi mucipare. Alla 13a, 14a e 16a settimana, la presenza
della CK20 è stata osservata in una percentuale compresa tra il 10 e il 50% delle cellule, con prevalente localizzazione nell’epitelio dei villi. Alla 21a settimana si è osservato un ulteriore aumento delle cellule CK20-positive,
raggiungendo il grado 3; tale grado di positività veniva
confermato alla 22a e 32a settimana gestazionale; la positività è infine divenuta diffusa e uniforme alla 37a e alla
40a settimana, interessando non solo le cellule dei villi
ma anche l’epitelio ghiandolare, con esclusione costante
delle cellule di Paneth che sono risultate sempre CK20negative (Figg. 4, 5).
L’andamento dell’immunoreattività nei prelievi di colon
642
M.C. Botta et al.: Espressione della CK20 nel tratto gastroenterico nell’embrione e nel feto
Stomaco
Grado di positività
4
3
2
1
0
12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
Settimane Gestazionali
Duodeno
Grado di positività
4
3
2
1
0
12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
Settimane Gestazionali
Tenue
Grado di positività
4
3
2
1
0
12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
Settimane Gestazionali
Appendice
Grado di positività
4
3
2
1
0
12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
Settimane Gestazionali
Colon
Grado di positività
4
3
2
1
0
12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
Settimane Gestazionali
Fig. 1 Ricerca immunoistochimica della
CK20. Grado di positività: 0 = nessuna positività cellulare; 1 = <10% di cellule epiteliali positive; 2 = 10-50% di cellule epiteliali positive; 3 = 51-80% di cellule epiteliali positive; 4 = >80% di cellule epiteliali positive
M.C. Botta et al.: Espressione della CK20 nel tratto gastroenterico nell’embrione e nel feto
643
Fig. 2 Stomaco: sedicesima settimana gestazionale. Positività per
la CK20: grado 2
Fig. 5 Particolare della Figura 4
Fig. 3 Duodeno: 12a settimana gestazionale. Positività per la
CK20: grado 2
Fig. 6 Appendice: 32a settimana gestazionale. Positività per la
CK20: grado 4
Fig. 4 Intestino tenue; 16a settimana gestazionale. Positività per la
CK20: grado 2
Fig. 7 Colon: 37a settimana gestazionale. Positività per la CK20:
grado 4
e di appendice è stata del tutto sovrapponibile. Già intensa
dalla 12a alla 14a settimana, l’immunoreattività per la CK20
è divenuta diffusa (grado 4) alla 16a settimana, interessando
sia l’epitelio superficiale che l’epitelio ghiandolare.
Il grado 4 di immunoreattività veniva espresso anche alla
21a, 22a, 32a e 37a settimana; alla 40a settimana si è osservato
un decremento delle cellule CK20-positive, la cui percentuale è scesa al di sotto dell’80% (grado 3) (Figg. 6, 7).
644
M.C. Botta et al.: Espressione della CK20 nel tratto gastroenterico nell’embrione e nel feto
Discussione
Precedenti studi sull’immunoreattività per la CK20, nei vari
organi e tessuti umani, hanno evidenziato la negatività completa in molti epiteli superficiali e ghiandolari quali quelli
delle vie biliari, gli epatociti [6], il pancreas, i mesoteli [8];
positività in altri quali cellule di Merkel [9], epitelio gastrointestinale dell’adulto e cellule superficiali “ad ombrello”
della vescica [8]. Il tratto grastroenterico dell’adulto è risultato particolarmente ricco di cellule CK20-positive. L’unico
studio che abbia sino ad ora analizzato nel corso dello sviluppo la distribuzione della CK20 nell’epitelio gastroenterico [6] è stato limitato all’intestino tenue. In tale tratto del tubo gastroenterico, acquisiscono immunoreattività per la
CK20 prima rare cellule dei villi e, in seguito, un numero
progressivo di enterociti, cellule caliciformi e delle cripte.
Il nostro studio ha evidenziato, in primo luogo, che l’espressione della CK20 non è omogenea ma, anzi, è molto differenziata nei vari segmenti del tratto gastroenterico. È stata,
in primo luogo, evidenziata la mancata espressione della
CK20 a livello dell’epitelio esofageo. In tutte le altre sezioni, la CK20 è risultata presente, ma con caratteristiche peculiari: nello stomaco e nell’intestino tenue il grado di immunoreattività dell’epitelio è apparso strettamente correlato all’età gestazionale, raggiungendo il massimo già alla 32a settimana di gestazione; nel duodeno l’espressione della CK20
ha mostrato un andamento nettamente differente, caratterizzato da espressione intensa e diffusa nelle prime settimane di
gestazione, per poi diminuire a partire dalla 22a settimana fino al termine della gestazione; nel colon e nell’appendice, infine, l’immunoreattività per la CK20 è risultata pressoché costante dalla 16a settimana fino al termine della gestazione.
Per quando concerne gli elementi cellulari che esprimono la
CK20, l’epitelio superficiale è apparso focalmente interessato
nello stomaco e nel tenue, fin dalla 12a settimana. Successivamente, l’immunoreattività si è estesa alla componente
ghiandolare. Nel tenue, non solo le cellule principali, ma anche
le caliciformi hanno espresso la CK20. Va sottolineata la costante negatività delle cellule del Paneth. Nel colon e nell’appendice, l’espressione della CK20 è apparsa omogeneamente
distribuita tra l’epitelio superficiale e quello ghiandolare.
In conclusione il nostro studio evidenzia che, durante lo
sviluppo fetale, l’espressione della CK20 non è omogenea nel
tratto gastroenterico, ma presenta notevoli variazioni a seconda del compartimento interessato. Il grado di immunoreattività e quindi la percentuale di cellule CK20-positive varia durante lo sviluppo fetale; si possono riconoscere tre quadri
principali: il primo, caratterizzato da un aumento progressivo
di positività tipico dello stomaco e dell’intestino tenue; il secondo, caratterizzato da un progressivo decremento, tipico del
duodeno; il terzo, caratterizzato da una sostanziale costanza di
immunoreattività, tipica del colon e dell’appendice. Ne consegue che, sulla base dei nostri dati, l’uso eventuale della reattività per la CK20, come indice di maturazione (e come marcatore di differenziazione) cellulare, può essere consigliato
solo per lo studio dello stomaco e dell’intestino tenue.
Summary A novel type of cytokeratin, cytokeratin 20 (CK20),
was added in 1990 to the classic catalog of human cytokeratins,
a heterogeneous group of proteins present in almost all epithelia. In man, the expression of CK20 is almost entirely confined
to the gastro-intestinal epithelium, to the urothelium and to
Merkel cells. Since only few data are available regarding the
expression of CK20 in the developing human intestinal mucosa,
we studied CK20 immunoreactivity in fetal and neonatal human
gut. Immunoreactivity for CK20 was tested in fetuses and
newborns, from the twelfth up to the fortieth week of gestation.
In each subject, a specimen from the oesophagus, stomach,
small intestine, colon, appendix was studied. Tissue samples
were routinely processed and paraffin sections were stained
with the CK20-specific antiboby IT-Ks 20.8. CK20 immunoreactivity was absent in the oesophageal epithelium and it was
unevenly distributed in the gastrointestinal mucosa. Three main
patterns of immunoreactivity were observed during normal
development: the first, found in the stomach and in the small
bowel, is characterized by a progressive increase in CK20
expression during gestation; the second pattern, found in the
duodenum, shows a progressive decrease in CK20 expression
during gestation; in colon and appendix (third pattern), we did
not find significant changes in the degree of immunoreactivity
for CK20 during gestation. CK20 is unevenly expressed in
developing human intestinal mucosa. The degree of positivity
for CK20 appears to be related to the epithelial maturation
stage only in gastric and small bowel mucosa. Further studies
are needed to verify if the uneven CK20 immunoreactivity in the
gastrointestinal tract persists even in adulthood.
Bibliografia
1. Moll R, Franke WW, Schiller D et al (1982) The catolog of
human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells. Cell 31:11-24
2. Heid HW, Moll I, Franke WW (1988) Patterns of expression
of trichocytic and epithelial cytokeratins in mammalian tissues. Differentiation 37:215-230
3. Moll R, Schiller D, Franke WW (1990) Identification of protein of the intestinal cytoscheleton as a novel type 1 cytokeratin with unusual properties and expression patterns. J Cell
Biol 111:567-580
4. Quaroni A, Calner D, Quaroni E, Chandler JS (1991) Keratin expression in rat intestinal crypt and villous cells. Analysis with a
panel of monoclonal antibodies. J Biol Chem 266:11923-11931
5. Calnek D, Quaroni A (1992) Changes in keratin expression
during fetal and postnatal development of intestinal epithelial
cells. Biochem J 285:939-946
6. Moll R, Zimbelmann R, Goldschmidt MD et al (1993) The
human gene encoding cytokeratin 20 and its expression
during fetal development and in gastrointestinal carcinoma
Differentiation 53:75-93
7. Faa G, Van Eyken P, Roskams T et al (1998) Expression of cytokeratin 20 in developing rat liver and in experimental models
of ductular and oval cell proliferation. J Hepatol 29:628-633
8. Moll R, Lowe A, Laufer J et al (1992) Cytokeratin 20 in human carcinomas. Am J Pathol 140:427-447
9. Moll I, Kuhn C, Moll R (1992) Early development of human
Merkel cells. Exp Dermatol 1:180-184