Lezione 3.

Fattori ambientali che influenzano la
crescita microbica
•
•
•
•
•
•
Sostanze nutritive: carbonio, azoto, fosforo, zolfo,
ioni metallici
Temperatura ottimale (mesofili: 20 - 45°C, psicrofili:
0 - 10°C, termofili: 45 - 100°C)
pH ottimale: solitamente neutro, batteri acidofili:
pH 1 – 2, batteri basofili: pH 10 – 11
Pressione: di solito pressione atmosferica ma
esistono batteri barofili (batteri nei sedimenti
marini)
Concentrazione salina: ottimale quella fisiologica
(0,75% NaCl), ma esistono batteri alofili (15 - 25%
NaCI, batteri marini o di mari salati) e batteri
alotolleranti (7 - 8% NaCl)
Pressione osmotica
Atmosfera di incubazione
Presenza o assenza di ossigeno (aerobi o anaerobi
obbligati, aerobi-anaerobi facoltativi)
• Aerobi obbligati non hanno la fermentazione, ma la
fosforilazione ossidativa
• Anaerobi obbligati hanno la fermentazione, ma non la
fosforilazione ossidativa, possono mancare di alcuni
enzimi (catalasi, perossidasi, superossido-dismutasi)
• microaerofili: crescono bene in presenza di CO2 (10%)
L’assenza o presenza di ossigeno influenza il metabolismo batterico,
soprattutto per la resa energetica.
Prendendo ad esempio il metabolismo dei carboidrati (glicolisi), i
batteri producono ed immagazzinano energia (ATP) mediante
fermentazione, respirazione anaerobia oppure respirazione aerobia.
Resa energetica: fermentazione (2 ATP) < respirazione anaerobia <
respirazione aerobia (38 ATP).
Nutrizione Microbica
I batteri per la loro crescita hanno bisogno di:
acqua, vari ioni, fonti di carbonio, azoto, energia
Fonti di carbonio
Autotrofi
CO2 come unica o principale fonte di carbonio
per le biosintesi
Eterotrofi
Molecole organiche preformate
provenienti da altri microrganismi
ridotte,
Fonti di energia
Fototrofi
Chemiotrofi
Fonti di idrogeno o
elettroni
Litotrofi
Organotrofi
Luce
Ossidazione di composti organici o inorganici
Molecole inorganiche ridotte
Molecole organiche
Principali tipi nutrizionali tra i microrganismi
Principali tipi
nutrizionali
Fotolitotrofi
autotrofi
Energia
luminosa.
Donatore
Alghe; Solfobatteri
inorganico di idrogeno/elettroni porporini e verdi; Batteri
(H/e-). CO2 come fonte di carbonio
verdi-blu (cianobatteri)
Fotorganotrofi
eterotrofi
Energia
luminosa.
Donatore
organico H/e-. Carbonio organico (o
CO2) come fonte di energia
Chemiolitotrofi
autotrofi
Sostanze inorganiche come fonte di
energia. Donatore inorganico H/e-.
CO2 come fonte di carbonio
Chemiorganotrofi
eterotrofi
Fonti di energia
Sostanze organiche come fonte di
energia. Donatore organico H/e-.
Carbonio organico come fonte di
energia
Microrganismi
rappresentativi
Batteri porporini non
sulfurei; Batteri verdi
non sulfurei
Batteri ossidanti lo zolfo
Batteri dell’idrogeno e del
Ferro; Batteri nitrificanti
Protozoi; Funghi;
molti batteri non
fotosintetici
I primi 3 gruppi comprendono molti microrganismi ambientali, indispensabili nei cicli della materia (carbonio,
azoto, zolfo, fosforo, ferro). L'ultimo gruppo comprende molti microrganismi patogeni o commensali, che
soddisfano le loro esigenze contraendo rapporti con organismi superiori (simbiosi, commensalismo, parassitismo,
predazione)
Batteri esigenti (molti patogeni) richiedono la presenza nell'ambiente di fattori di crescita: sostanze
organiche di varia natura (vitamine, aminoacidi, nucleotidi) indispensabili per lo sviluppo (incapacità di
sintetizzarle)
Elementi inorganici indispensabili
per i microrganismi e loro funzioni
Elementi
L'acqua costituisce un
Funzione
principali
altro elemento
fondamentale:
Carbonio (C)
Componente dei composti organici; Fonte di
carbonio e di energia
acqua libera
Solvente, che consente il
Azoto (N)
Componente dei composti organici. Forme
metabolismo (reazioni
inorganiche (nitrati - NO3 - e nitriti - NO2 -)
metaboliche biochimiche)
utilizzate come accettori di e- nella respirazione
Zolfo (S)
Componente degli aminoacidi metionina e
cisteina. Legami S-S contribuiscono a
stabilizzare la struttura delle proteine. Alcune
forme inorganiche possono essere utilizzate come
fonti di energia o come accettori di e- nella
respirazione
acqua legata
costituente della materia
organica
Batteri
azoto-fissatori
Fosforo (P)
Componente di acidi nucleici e ATP (energia Capaci di fissare N2 atmosferico
chimica)
Ossigeno (O)
Componente di numerose molecole organiche.
Può essere immagazzinato
Accettore di e- nella respirazione aerobia
Idrogeno (H)
Componente della materia organica. Alcuni
batteri possono utilizzarlo come fonte di energia
Fosforo
come materiale di riserva
(granuli di volutina)
Elementi inorganici indispensabili
per i microrganismi e loro funzioni
Elementi
secondari
Funzione
Magnesio (Mg)
Richiesto per alcune attività enzimatiche. Contribuisce a
stabilizzare la struttura degli acidi nucleici carichi negativamente
Calcio (Ca)
Richiesto per la formazione di spore batteriche. Ruolo importante
nei movimenti dei microrganismi
Potassio (K)
Ruolo importante nella funzione dei ribosomi. Utilizzato da alcuni
batteri per mantenere l'equilibrio osmotico
Ferro (Fe)
Ruolo importante nel trasporto di elettroni da parte dei citocromi.
Influenza la patogenicità dei batteri
Manganese (Mn)
Può sostituirsi al magnesio nella regolazione di alcune attività
enzimatiche
Sodio (Na)
Utilizzato da alcuni batteri per mantenere l'equilibrio osmotico.
Richiesto da alcuni microrganismi marini
Zinco (Zn)
Richiesto per la funzione di alcuni enzimi
Cloro (Cl)
Utilizzato da alcuni batteri per mantenere l'equilibrio osmotico
Silicio (Si)
Richiesto da alcune alghe e diatomee
Il metabolismo dei microrganismi
Cellula
insieme di polimeri ordinati altamente improbabile che
richiede un continuo apporto di materiali ed energia
per mantenersi
Metabolismo
somma di tutte le reazioni chimiche e biochimiche che
avvengono nella cellula, rese possibili dall'apporto di
energia e dall'intervento degli enzimi (proteine con
funzioni di catalizzatori, che accelerano la velocità delle
reazioni a basse temperature)
Reazioni di sintesi: anabolismo (richiedono energia)
Reazioni degradative: catabolismo (producono energia)
Anabolismo (Biosintesi)
Livello di
organizzazione
Esempi
Costruzione delle
cellule
Cellule
Batteri, Alghe
Funghi, Protozoi
Organelli
Nuclei, Mitocondri
Ribosomi, Flagelli
Sistemi
sopramolecolari
Membrane
Complessi enzimatici
Macromolecole
Acidi nucleici, Proteine
Polisaccaridi, Lipidi
Durante le biosintesi un
microrganismo, partendo da
precursori semplici (molecole
inorganiche,
monomeri),
sintetizza molecole sempre più
complesse fino a formare gli
organuli e la cellula. Tutto
questo
richiede
grandi
quantità di energia libera
(ATP e legami ad alta
energia)
prodotte
nel
catabolismo.
Monomeri o
Nucleotidi, Aminoacidi
Zuccheri, Acidi grassi
↑
↑
↑
↑
strutture molecolari
di base
↑
Molecole
inorganiche
CO2, NH3, H2O, PO43-
20 AA Æ migliaia di proteine
4 (5) nucleotidi Æ DNA, RNA
monosaccaridiÆ polisaccaridi
acidi grassi Æ lipidi
Organizzazione dell’anabolismo
Complessi rapporti
tra sintesi e
degradazione dei vari
costituenti della
materia organica.
Gli scheletri
carboniosi derivano
principalmente
dall’acetil-CoA e dagli
intermedi del ciclo
degli acidi
tricarbossilici (TCA): i
precursori sono spesso
prodotti in vie
amfiboliche
Alcune vie
biosintetiche hanno
percorsi comuni
Fasi della sintesi del peptidoglicano
Nel citoplasma: 1. Sintesi di UDP-NAG e di UDP-NAM (da UDP-NAG e
fosfoenolpiruvato), 2. Aggiunta di 5 AA a UDP-NAM. Sulla membrana
interna: 3. Trasferimento di NAM-pentapeptide da UDP a un vettore lipidico
della membrana, l’undecaprenil-fosfato o bactoprenolo; 4. aggiunta di NAG
Bactoprenolo pirofosfato
legato a NAM
Fasi della sintesi del peptidoglicano
Sulla membrana esterna: 5. Trasferimento di NAG-NAM-pentapeptide
attraverso la membrana ad opera di bactoprenolo; 6. aggiunta di NAGNAM-pentapeptide alla catena crescente di peptidoglicano; 7. il bactoprenolo si defosforila e ritorna sulla faccia interna; 8. si formano i legami
trasversali ad opera delle transpeptidasi.
Il distacco della seconda molecola di D-alanina libera energia utilizzata
per l’inserimento dei vari frammenti polimerici di peptidoglicano nei siti
di allungamento della parete.
Antibiotici che inibiscono
la sintesi del peptidoglicano
Fosfomicina
(analogo del fosfoenolpiruvato)
blocca la sintesi di UDP-NAM da UDP-NAG
Cicloserina
blocca la sintesi di D-Ala e la formazione del dimero D-Ala-D-Ala
Bacitracina
blocca la defosforilazione del bactoprenolo
(che non può essere riutilizzato per il trasporto)
β-lattamici (penicilline, cefalosporine)
bloccano le transpeptidasi
Vancomicina (glicopeptide)
blocca l'aggiunta di unità funzionali al peptidoglicano
complessandosi al dimero D-Ala-D-Ala
Catabolismo (3 stadi)
Degradazione di
molecole complesse
in composti più
semplici con
liberazione di
energia, in parte
dispersa come calore
ed in parte
immagazzinata come
ATP, e formazione di
scheletri carboniosi
per le nuove sintesi.
Nello stadio 1 non
viene prodotta
energia
Vie di degradazione
del glucosio
A sx, Glicolisi
(via di EmbdenMeyerhof-Parnas):
da glucosio ad acido
piruvico, via + comune
A dx, Via del pentoso
fosfato (EntnerDoudoroff):
può decorrere insieme
alla glicolisi
Ciclo degli acidi tricarbossilici
(di Krebs): da acido piruvico
(acetil-CoA)
Catena di trasporto degli elettroni:
massima produzione di ATP
Respirazione aerobia:
accettore finale O2
Respirazione anaerobia:
accettore molecola inorganica
(nitrati, solfati, CO2, ecc.)
Fermentazioni
Lattica (omo-, etero-)
Alcolica
Acidofili, muffe, protozoi,
muscoli
Funghi, batteri,
protozoi, alghe
in assenza di O2 viene
utilizzato l'acido piruvico
per riossidare NADH
Propionica
Acido-Mista
alcuni Enterobatteri
Trasformazioni del piruvato
in diversi prodotti finali ad
opera dei vari microrganismi.
CoA: Coenzima A
Acido-Mista
alcuni Enterobatteri
Acetica
I diversi prodotti metabolici
servono per la classificazione
dei microrganismi:
il profilo biochimico di
un batterio ne consente
l’identificazione
Identificazione biochimica dei batteri
mediante l’uso di terreni differenziali
Esempio: terreno di Kligler, particolarmente
l’identificazione di batteri Gram negativi
utilizzazione dei
carboidrati (glucosio
e lattosio):
acidità: colore giallo
alcalinità: colore rosso
produzione di gas:
presenza di bolle o rottura
dell’agar
produzione di
idrogeno solforato:
annerimento in tutto o in
parte del fondo
utile
per
Identificazione biochimica dei batteri
mediante sistema API 20E
Enterobacter cloacae
Nei singoli pozzetti sono contenuti diversi
substrati (zuccheri, AA, ecc. ) che il batterio
può o meno utilizzare per il proprio
metabolismo: nel caso di utilizzazione, c'è
un cambiamento del pH e quindi
dell'indicatore (cambiamento di colore).
L'insieme delle singole prove biochimiche
fornisce il profilo biochimico-metabolico
caratteristico di ogni specie.
mediante metodi automatizzati
Classificazione e nomenclatura
dei microrganismi
Tassonomia
Scienza che studia la classificazione degli organismi,
ossia il loro inserimento, sulla base di determinate
caratteristiche, in raggruppamenti omogenei (taxa),
nonché la loro denominazione (nomenclatura)
• Ceppo (stipite): popolazione microbica derivata da
una singola cellula (o virione) iniziale
• Specie: insieme
di
ceppi
che
presentano
caratteristiche comuni, morfologiche, metaboliche,
genetiche, ecc.
Specie ⇒ Genere ⇒ Famiglia ⇒ Ordine ⇒ ⇒ Classe ⇒
Philum ⇒ Regno
Classificazione e nomenclatura
dei microrganismi
Nomenclatura linneiana
2 termini a desinenza latina
1° termine in corsivo (lettera maiuscola iniziale):
indica il Genere (es. Escherichia)
2° termine in corsivo (lettere minuscole):
indica la Specie (es. coli)
Vibrio cholerae, Clostridium botulinum, Escherichia coli
Plasmodium falciparum, Herpes simplex, ecc.
Attribuzione alla specie sulla base di:
- osservazione microscopica
(caratteristiche morfologiche e tintoriali)
- prove biochimiche (caratteristiche metaboliche e colturali)
- caratteristiche genetiche (DNA, RNA, omologia, ecc.)
Tassonomia dei procarioti
Tassonomia dei procarioti
Coltivazione dei microrganismi
I terreni di coltura
Indispensabili per coltivare i microrganismi in laboratorio
(isolamento, identificazione, ecc.). Riproducono artificialmente
l'ambiente che può soddisfare le esigenze metaboliche.
Diversi tra loro per composizione chimica e stato fisico
♦ Terreni sintetici (definiti o minimi): composizione nota
- fonte di carbonio (CO2, glucosio o sostanze organiche più complesse)
- fonte di azoto (nitrati, ammoniaca)
- sali minerali (solfati, fosfati, tracce di altri ioni, ecc.)
- acqua
- pH
♦Terreni complessi (o arricchiti o completi):
alcuni componenti complessi a composizione non esattamente nota
- siero o sangue animale, peptoni, estratti di carne o di lievito, …
- eventuali fattori di crescita (vitamine, ecc.)
Coltivazione dei microrganismi
I terreni di coltura
♦Terreni selettivi
- contengono sostanze che inibiscono la crescita di certi batteri,
consentendo la crescita di altri (antibiotici, sali biliari,
coloranti, ecc.) (es. agar di MacConkey)
♦ Terreni differenziali
- contengono particolari substrati che consentono di
rilevare attività metaboliche e possono essere utilizzati per
identificazioni presuntive iniziali (es. fermentazione di
zuccheri, attività proteasica, DNAsica, ecc.)
Preparazione dei terreni
- tutti i componenti termostabili + H2O miscelati e sterilizzati in autoclave
- componenti termolabili sterilizzati per filtrazione, aggiunti sterilmente
(a 45°C o a freddo )
Coltivazione dei microrganismi
I terreni di coltura
♦ Terreni liquidi (brodocolture)
- consentono la coltivazione dei microrganismi in bottiglie, beute, provette
- a partire anche da una sola cellula consentono di ottenerne miliardi in
tempi rapidi
- la crescita microbica determina intorbidamento del terreno
- consentono studi sulla curva di crescita
♦ Terreni solidi
- terreno liquido + agente gelificante:
gelatina (fonde sopra i 28°C, è degradata da numerose specie batteriche)
agar (+ utilizzato) farina vegetale polisaccaridica ottenuta da alghe
(si scioglie a 70 - 80°C, risolidifica a 41,5°C, consente la preparazione di
terreni, anche con aggiunta di sostanze termolabili)
- consentono la crescita con formazione di colonie
(107-108 batteri derivati da 1 sola cellula batterica)
- consentono la coltivazione dei microrganismi in provette (es. agar inclinato),
capsule di Petri
Tecniche di isolamento e coltivazione
Ago per
la semina
Agar inclinato
per la semina
Ago per in provetta
la semina
Aspetto delle colonie batteriche
Forma delle colonie
Puntiforme
Margine
Profilo
Superficie
Intero
Piatto
Liscia,
lucida
Ondulato
Elevato
Ruvida
Convesso
Rugosa
Pulvinato
Secca,
polverosa
Rotonda
Rizoide
Lobato
Irregolare
Filamentosa
Filamentoso
Eroso
Umbonata
a
c
b
Colonie batteriche su Agar
MacConkey in capsule di
Petri (piastre)
a: Escherichia coli
b: Salmonella typhi
c: Klebsiella pneumoniae
Colonie batteriche su agar sangue
in capsule di Petri (piastre)
Curva di crescita batterica
→
Inoculo
iniziale
Determinazione del numero di batteri vivi in un sistema chiuso
(recipiente chiuso, terreno liquido)
incremento dei componenti cellulari, aumento delle dimensioni delle
cellule, divisione cellulare, aumento numerico della popolazione
Curva di crescita batterica
Durata
dipende dal tempo di generazione
Batteri a rapida crescita
(tempo di generazione 20 minuti)
Curva: 18 - 24 ore
Batteri a lenta crescita
(tempo di generazione alcune ore)
Curva: da 48 ore a diversi giorni o settimane
(es. Micobatteri)
Colture continue: Chemostato
Sistema aperto
• Apporto di terreno
sempre nuovo
• Allontanamento di
cataboliti (tossici o
prodotti utili)
• Allontanamento di
batteri in eccesso
(molti già morti)
La coltura rimane costantemente in fase di crescita esponenziale
("coltura giovane")
La velocità di crescita è regolata dal flusso del terreno
Il tipo di moltiplicazione assomiglia a quello che si verifica nel corso
di infezioni negli organismi animali superiori
Colture continue
Turbidostato
particolare tipo di chemostato fornito di una
fotocellula che controlla la torbidità della coltura,
regolando di conseguenza il flusso del terreno fresco e
l'allontanamento di cellule e cataboliti
Questi sistemi consentono di effettuare studi sulle
popolazioni microbiche
Opportunamente
modificati
(Fermentatori)
vengono utilizzati per la produzione industriale di
prodotti microbici, quali:
- Antibiotici - Farmaci
- Enzimi
Tecniche dirette per la misura quantitativa
di una popolazione microbica
Misure qualitative e quantitative indispensabili per molti scopi
- controlli microbiologici di sterilità o di contaminazione
Conteggio cellulare:
determinazione della
concentrazione
Conteggio totale:
Microscopia
Vantaggi: rapidità,
fornisce conta totale,
permette di osservare la
morfologia
Svantaggi: non
differenzia cellule vive e
morte; i batteri sono
difficilmente osservabili
perchè trasparenti
Tecniche dirette per la misura quantitativa
di una popolazione microbica
• Conteggio vitale:
Titolazione per diluizione
In terreno liquido
Aliquote (1 cc) di diluizioni
(1:10, 1:100, ecc.) del campione
(sospensione batterica), vengono
aggiunte a provette contenenti
un terreno liquido sterile
(limpido). Dopo incubazione, si
avrà intorbidamento del terreno
dove è arrivata almeno 1 cellula
batterica,
consentendo
di
risalire al numero di batteri/ml
presenti nel campione iniziale.
Tabella statistica di
Carpenter
Determinazione del MPN
(NPP = numero più probabile)
Vantaggi: valutazione statistica, senza
necessità di conteggio colonie
Svantaggi: metodo indaginoso
Tecniche dirette per la misura quantitativa
di una popolazione microbica
• Conteggio
vitale:
Conteggio delle
colonie
Vantaggi:
- distingue cellule
vive e morte
- consente la ricerca
di specifici agenti o
gruppi microbici
(terreni selettivi)
Svantaggi:
- consente il
conteggio dei soli
microrganismi
coltivabili
Conteggio mediante diffusione su piastra o
mescolamento in agar
sospensione batterica, a varie diluizioni Æ stratificazione sulla superficie di un
terreno solido in piastra o mescolamento con terreno agarizzato liquefatto (42°C),
poi versato in piastra Æ incubazione Æ conta n° colonie Æ deduzione n° batteri
Tecniche dirette per la misura quantitativa
di una popolazione microbica
Conteggio mediante
filtrazione su
membrana
Un volume noto di
sospensione batterica o
campione liquido viene
filtrato su membrane a
pori predefiniti (0,45 0,22 µm); la membrana è
deposta sulla superficie
di un terreno di coltura
in capsula di Petri; dopo
incubazione si esegue la
conta colonie
Vantaggio: conteggio di
microrganismi in scarsa
concentrazione
Esempi di
colonie su
terreni
diversi
(analisi
microbiologica
delle acque)
Tecniche dirette per la misura quantitativa
di una popolazione microbica
• Conteggio mediante Contatore Coulter
Resistenza elettrica:
le cellule sono cattive conduttrici di elettricità
la sospensione cellulare è fatta passare in una fessura
sottilissima con ai lati degli elettrodi; le cellule passando
interrompono il campo elettrico con conseguente caduta
di voltaggio, proporzionale al volume della cellula,
registrata dallo strumento
N° e forma degli impulsi Æ N° e dimensioni delle cellule
Svantaggi
- conta totale
- possibili errori per presenza particelle inanimate
Tecniche dirette per la misura quantitativa
di una popolazione microbica
♦ Determinazione della densità cellulare
determinazione del N° mediante sistemi fotometrici (torbidità)
- Spettrofotometri: turbidimetri, nefelometri
Turbidimetria: intensità della luce non deviata (trasmessa)
Nefelometria: intensità della luce deviata
Relazione tra D.O. e concentrazione batterica (curve di riferimento)
♦ Determinazione della Massa cellulare (poco utilizzati)
Determinazione del peso secco
la sospensione batterica è lavata e centrifugata,
asciugata a 100°C (80°C sotto vuoto) e pesata
Determinazione del peso umido
le cellule sono adsorbite a un filtro di peso noto
asciugato a 40°C sotto vuoto e pesato
Tecniche indirette per la misura
quantitativa di una popolazione microbica
Quantificazione di specifici componenti cellulari
Possono essere quantificati: Carbonio o azoto organico totale;
LPS, lipidi; acidi nucleici (ricerca con nuove tecnologie di Biologia
molecolare, quale la Reazione Polimerasica a Catena - PCR), ATP
Determinazione del contenuto in ATP
ATP associato solo ad organismi viventi (membrana cellulare
impermeabile); concentrazione per ogni cellula batterica
abbastanza costante: 2-6 nmol per mg
- sistema luciferina - luciferasi (lucciole)
luciferasi
ATP + luciferina ridotta + O2 ---------> AMP + pirofosfato
inorganico + prodotto degradazione + CO2 + luce
apparati fotorilevatori Æ quantità di luce direttamente
proporzionale alla concentrazione batterica