PRINCIPI DELLA
STERILIZZAZIONE
CORSO DI IMPIANTI
DELL’INDUSTRIA FARMACEUTICA
ANNO ACCADEMICO 2007-2008
GENERALITA’
LA DEFINIZIONE TEORICA DI STERILITA’ E’ ASSENZA DI TUTTE LE
FORME VITALI (MICROORGANISMI) DA UN SUBSTRATO.
SUBSTRATO
QUESTO CONCETTO E’ ASSOLUTO, E NON E’ CORRETTO PARLARE
DI “GRADO” DI STERILITA’.
LA STERILIZZAZIONE E’ QUALUNQUE PROCESSO CHE PERMETTE
DI RAGGIUNGERE LA STERILITA’, UCCIDENDO (CALORE,
SOSTANZE CHIMICHE, RADIAZIONI IONIZZANTI) O ALLONTANANDO
(FILTRAZIONE STERILIZZANTE) TUTTI I MICROORGANISMI DA UN
SUBSTRATO.
QUESTE DEFINIZIONI HANNO ALCUNE IMPORTANTI IMPLICAZIONI:
DEFINIZIONE DI MORTE DEI MICROORGANISMI
CONOSCENZA DELLA CINETICA DI INATTIVAZIONE DEI
MICROORGANISMI
MORTE MICROBICA
DA UN PUNTO DI VISTA PRATICO E APPLICATIVO, UN BATTERIO E’
DEFINITO MORTO QUANDO NON E’ PIU’ IN GRADO DI
MOLTIPLICARSI SUI TERRENI DI COLTURA IN CUI NORMALMENTE
CRESCE.
IN BASE A QUESTO CRITERIO UN BATTERIO ANCORA VIVO MA
DANNEGGIATO, NON IN GRADO DI MOLTIPLICARSI, E CHE QUINDI
NON DA’ COLONIE O INTORBIDAMENTI NEI TERRENI, E’
CLASSIFICATO MORTO.
ATTUALMENTE NON SI DISPONE DI TERRENI DI COLTURA CAPACI
DI FAR CRESCERE I MICRORGANISMI SOLO DANNEGGIATI DA
TRATTAMENTI DI STERILIZZAZIONE; PERCIO’ L’ASSENZA DI FORME
VITALI IN UN SUBSTRATO E’ UNO STATO NON DIMOSTRABILE
PRATICAMENTE.
PRATICAMENTE
UNA VALIDA ALTERNATIVA AL TERMINE “ STERILE” POTREBBE
ESSERE “LIBERO DA FORME DI VITA DIMOSTRABILI”.
CINETICA DELLA
INATTIVAZIONE MICROBICA
I MICROORGANISMI ESPOSTI AD
UN AGENTE LETALE NON
MUOIONO TUTTI ALLO STESSO
TEMPO; LA CINETICA DI
MORTALITA’ E’ DI TIPO
ESPONENZIALE E PUO’ ESSERE
RAPPRESENTATA DALLE CURVE
A SINISTRA, CHE SI
RIFERISCONO AD UNA
POPOLAZIONE BATTERICA
OMOGENEA.
DATO IL TIPO DI CINETICA,
L’ASSENZA DI QUALUNQUE
MICROORGANISMO SI VERIFICA
SOLO PER UN TEMPO DI
ESPOSIZIONE INFINITO.
INFINITO
TRATTO DA: “MICROBIOLOGIA FARMACEUTICA”. P. MAZZA, MILANO 1992
CINETICA DELLA
INATTIVAZIONE MICROBICA
IN TUTTI I PROCESSI CHE DISTRUGGONO CHIMICAMENTE O
FISICAMENTE I MICROORGANISMI (FATTA ECCEZIONE PER
L’INCINERAZIONE E PER IL TRATTAMENTO CON PLASMA)
LA CINETICA DI INATTIVAZIONE MICROBICA E’ QUELLA
DESCRITTA; E’ UNA CINETICA DEL 1° ORDINE E PUO’
ESSERE DESCRITTA DALLA SEGUENTE EQUAZIONE:
DOVE N0 E’ IL NUMERO DI MICROORGANISMI VITALI ALL’INIZIO
DEL TRATTAMENTO, Nt E’ IL NUMERO DI MICROORGANISMI
VITALI AL TEMPO t E N0/Nt E’ IL GRADO DI INATTIVAZIONE.
DIVERSE CURVE DI
INATTIVAZIONE AL CALORE
LA CURVA DI INATTIVAZIONE VISTA PRIMA
(A) E’ TEORICA; QUELLE REALI
PRESENTANO DELLE DEVIAZIONI:
CURVA (B): CON UNA PICCOLA
CONCAVITA’ INIZIALE VERSO IL BASSO,
INDICA LA NECESSITA’ CHE SI VERIFICHINO
ALCUNI EVENTI CRITICI PRIMA CHE ABBIA
LUOGO LA MORTE CELLULARE (ES.,
BATTERI CHE CRESCONO IN AGGREGATI)
CURVA (C): FASE INIZIALE DI RAPIDA
CADUTA DEL TITOLO MICROBICO SEGUITA
DA UNA INATTIVAZIONE PIU’ LENTA
(PRESENZA DI POPOLAZIONE MICROBICA
MISTA CON DIVERSA RESISTENZA
TERMICA)
CURVA (D): TIPICA DELLE POPOLAZIONI DI
BATTERI SPORIGENI, CON UN LEGGERO
INCREMENTO INIZIALE DEL NUMERO DI
BATTERI DOVUTO ALL’ATTIVAZIONE
TERMICA DELLE SPORE
TRATTO DA: GUIDE TO MICROBIOLOGICAL CONTROL IN
PHARMACEUTICALS”, ED. S. DENYER E R. BAIRD
PARAMETRI DELLA
RESISTENZA
FATTA ECCEZIONE PER LA FILTRAZIONE STERILIZZANTE E PER I
TRATTAMENTI DISTRUTTIVI (ES., INCINERAZIONE), I VARI METODI DI
STERILIZZAZIONE POSSONO ESSERE CARATTERIZZATI DA VARI
PARAMETRI NUMERICI CHE INDICANO L’EFFICIENZA DELLA LORO
AZIONE ANTIMICROBICA E CHE SONO MOLTO UTILI PER
CALCOLARE LA GARANZIA DI STERILITA’ O S.A.L. (VEDI OLTRE)
I PARAMETRI PIU’ IMPORTANTI SONO:
D-VALUE
z-VALUE
D-VALUE
IL D-VALUE (VALORE DI RIDUZIONE
DECIMALE)
DECIMALE DI UN
MICROORGANISMO AD UNA CERTA
TEMPERATURA x (Dx) E’ IL TEMPO,
ESPRESSO IN MINUTI, NECESSARIO
PER RIDURRE IL NUMERO DEI
BATTERI SOPRAVVISSUTI AD UN
TRATTAMENTO TERMICO DI UN
FATTORE 10 (CIOE’ DEL 90%,
OPPURE DI UN LOGARITMO).
E’ UN VALORE INDIPENDENTE
DALLA CARICA MICROBICA DI
PARTENZA
TRATTO DA: GUIDE TO MICROBIOLOGICAL CONTROL IN
PHARMACEUTICALS”, ED. S. DENYER E R. BAIRD
SIGNIFICATO DEL D-VALUE
IL VALORE D ESPRIME LA RESISTENZA DI UN MICROORGANISMO AL
TRATTAMENTO STERILIZZANTE (PIU’ ALTO E’ D, PIU’ RESISTENTE E’ IL
MICROORGANISMO).
MICROORGANISMO
I VALORI D PER UN CERTO MICROORGANISMO DIMINUISCONO CON L’AUMENTARE
DELLA TEMPERATURA.
COSI’ COME E’ STATO DEFINITO IL D-VALUE E’ VALIDO PER LA
STERILIZZAZIONE AL CALORE SECCO E UMIDO E PER LA STERILIZZAZIONE
CON OSSIDO DI ETILENE O ALTRI GAS; IN RELAZIONE ALLA
STERILIZZAZIONE CON RADIAZIONI IONIZZANTI VIENE DEFINITO COME DOSE
DI RADIAZIONE ASSORBITA (IN kGy).
DETERMINAZIONE DEL DVALUE
CI SONO VARI SISTEMI PER RICAVARE IL VALORE D DI UN
MICROORGANISMO AD UNA CERTA TEMPERATURA:
SI PUO’ RICAVARE GRAFICAMENTE DALLA PENDENZA
DELLA RETTA DI INATTIVAZIONE
METODO DI STUMBO-MURPHY-COCHRAN
METODO DI SPEARMAN-KARBER
CINETICA DI INATTIVAZIONE DI
UNA POPOLAZIONE BATTERICA
TRATTO DA: “MICROBIOLOGIA FARMACEUTICA”. P. MAZZA, MILANO 1992
NELL’ESEMPIO ILLUSTRATO NELLA TABELLA SI CONSIDERA UNA
POPOLAZIONE BATTERICA OMOGENEA DI 1x106/ml INIZIALI
CARATTERIZZATA DA UN D-VALUE DI 1 RELATIVAMENTE AD UN CERTO
TRATTAMENTO STERILIZZANTE. AD OGNI MINUTO IL 90% DELLA
POPOLAZIONE BATTERICA PRESENTE VIENE UCCISO. DOPO 8 MINUTI
SOLO 1 BATTERIO SOPRAVVIVERA’ IN 100 ml.
RESISTENZA DEI MICROORGANISMI
ALLA INATTIVAZIONE
AUMENTO DELLA RESISTENZA ALLA STERILIZZAZIONE
BATTERI IN FORMA
VEGETATIVA (GRAM+
PIU’ RESISTENTI DEI
GRAM-)
FUNGHI E MUFFE IN
FORMA VEGETATIVA
GRANDI VIRUS
SPORE SESSUALI
DELLE MUFFE
SPORE
ASESSUALI DELLE
MUFFE
ASCOSPORE
SESSUALI DEI
LIEVITI
PICCOLI VIRUS
(ES., POLIOVIRUS,
EPATITE B)
ENDOSPORE
BATTERICHE (CON
VARI GRADI DI
RESISTENZA)
VIRUS LENTI (ES.,
VIRUS DELLO
SCRAPIE)
IN GENERE LA SENSIBILITA’ DEI VARI MICROORGANISMI NON DIPENDE
DAL TIPO DI AGENTE STERILIZZANTE UTILIZZATO.
QUANDO SI VUOLE TESTARE L’EFFICACIA DI UN METODO DI
STERILIZZAZIONE SI SCELGONO LE SPORE BATTERICHE,
BATTERICHE CHE SONO LE
FORME PIU’ RESISTENTI IN ASSOLUTO.
RESISTENZA DEI MICROORGANISMI
ALLA INATTIVAZIONE
L’INTRINSECA RESISTENZA DI UN MICROORGANISMO AD UN
DETERMINATO TRATTAMENTO STERILIZZANTE PUO’ ESSERE
NOTEVOLMENTE MODIFICATA DALL’AMBIENTE, CIOE’ DA:
pH
FORZA IONICA
PRESENZA DI PROTEINE, CARBOIDRATI, GRASSI
PRESENZA DI ALTRI SOLUTI
z-VALUE
FACENDO UN GRAFICO CHE RIPORTI
IN ASCISSE LA TEMPERATURA (IN C°)
ED IN ORDINATE IL LOGARITMO DI D
ALLE VARIE TEMPERATURE, SI
OTTIENE LA COSIDDETTA CURVA DI
RESISTENZA TERMICA.
TERMICA
DA QUESTA CURVA SI RICAVA IL zVALUE, CHE ESPRIME LA RELAZIONE
TRA LA TEMPERATURA ED IL
LOGARITMO DI D,
D CIOE’
RAPPRESENTA L’INCREMENTO DI
TEMPERATURA RICHIESTO PER
RIDURRE DEL 90% (CIOE’ DI 1
LOGARITMO) IL VALORE D DI UN
MICROORGANISMO.
SI ESPRIME IN GRADI CENTIGRADI.
SI PUO’ RICAVARE GRAFICAMENTE
OPPURE DA EQUAZIONI
MATEMATICHE.
TRATTO DA: GUIDE TO MICROBIOLOGICAL CONTROL IN
PHARMACEUTICALS”, ED. S. DENYER E R. BAIRD
GARANZIA DI STERILITA’
LE CURVE CHE RAPPRESENTANO LA CINETICA DI INATTIVAZIONE INDICANO
CHE IL CONCETTO DI STERILITA’ TEORICA NON E’ APPLICABILE
PRATICAMENTE.
PER LE APPLICAZIONI PRATICHE (STERILIZZAZIONE DI FARMACI, DI PRODOTTI
ALIMENTARI, ECC.) SI UTILIZZA ILCONCETTO DI GARANZIA DI STERILITA’ O
STERILITY ASSURANCE LEVEL (S.A.L.): LA STERILITA’ VIENE ESPRESSA COME
LA PROBABILITA’ MATEMATICA DI UN OGGETTO SOTTOPOSTO A
TRATTAMENTO STERILIZZANTE DI ESSERE ANCORA CONTAMINATO DA
MICROORGANISMI.
QUESTA PROBABILITA’ DEVE ESSERE MOLTO BASSA; IN PARTICOLARE LA
FARMACOPEA ITALIANA STABILISCE CHE UN PROCESSO DI STERILIZZAZIONE
DEVE GARANTIRE CHE SU UN MILIONE DI UNITA’ STERILIZZATE AL MASSIMO
UNA RISULTI CONTAMINATA (1 MICROORGANISMO VITALE SU 1x106 UNITA’ DI
PRODOTTO)
S.A.L. PRODOTTI FARMACEUTICI = 10-6
NELLA F.U. SONO RIPORTATE PER CIASCUN METODO DI STERILIZZAZIONE LE
CONDIZIONI ADOTTANDO LE QUALI LA PROBABILITA’ CHE UNA UNITA’ DI
DOSAGGIO DI UN LOTTO SOTTOPOSTO AL TRATTAMENTO NON SIA STERILE E’
≤ 10-6
GARANZIA DI STERILITA’
ESEMPIO DI APPLICAZIONE PRATICA DEI CONCETTI DI D-VALUE E
S.A.L. NELLA MESSA A PUNTO DI UN PROTOCOLLO DI
STERILIZZAZIONE.
LOTTO DI FIALE DA 1 ml; CONTAMINAZIONE INIZIALE 102
BATTERI/FIALA. D-VALUE DEI BATTERI A 121°C = 1.
LA CONTAMINAZIONE FINALE TOLLERATA E’ 10-6.
102 → 10-6
RIDUZIONE DI 8 CICLI LOGARITMICI
PER RIDURRE DI 1 CICLO LOGARITMICO OCCORRERA’ 1 MINUTO A
121°°C, PER RIDURRE DI 8 CICLI LOGARITMICI OCCORRERANNO 8
MINUTI A 121°°C.
APPROCCIO “OVERKILLING”
METODI DI STERILIZZAZIONE
USATI IN CAMPO FARMACEUTICO
LETTURE CONSIGLIATE
“GUIDE TO MICROBIOLOGICAL CONTROL IN
PHARMACEUTICALS”, ED. S. DENYER E R. BAIRD,
ELLIS HORWOOD, 1990.
“MICROBIOLOGIA FARMACEUTICA”, P. MAZZA,
SOCIETA’ EDITORIALE FARMACEUTICA, MILANO,
1992.
“MICROBIOLOGIA FARMACEUTICA”, W.B. HUGO E
A.D.RUSSELL, EMSI, ROMA, 1991.
