La valutazione tossicologica e la derivazione dei valori di riferimento if i Emanuela Testai Istituto Superiore di Sanità -Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria- Roma (Italy) [email protected] Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 1 La valutazione tossicologica L’obbiettivo è quello di identificare i possibili rischi per la salute dell’uomo e dell’ambiente dell ambiente derivanti dalla esposizione all’agente potenzialmente tossico Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 2 E s p o s i z i o n e Fase farmaco/ i tossico cinetica ADME X Effetto X* assorbimento distribuzionem etabolismo escrezione Fase farmaco/ tossico din mic dinamica Corso Fitofarmaci Interazione tra X o X* e il bersaglio Roma, ISS 19 maggio 08 3 Studi Sperimentali vs. Studi epidemiologici ¾ Sperimentali. Si somministra la sostanza con precise modalità (dose, (dose tempo, tempo via ecc.) ecc ) e se ne studiano gli effetti tossici. L’esposizione alla sostanza è controllata. L’esposizione L esposizione ad altre sostanze è eliminata o comunque controllata (gruppi di controllo) ¾ Epidemiologici. Epidemiologici. Si studiano gli effetti di una sostanza su popolazioni popolaz on umane che sono comunque esposte alla sostanza, presente nell’ambiente o somministrata a scopo terapeutico (farmaci, vaccini). L’esposizione non può essere controllata ll ((tranne che h per i farmaci). f ) Gli l individui d d sono contemporaneamente esposti a molte altre sostanze o condizioni che possono influenzare l’effetto l effetto tossico Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 4 Vantaggi: STUDI EPIDEMIOLOGICI Condizioni di esposizione reale Effetti misurati sulla specie bersaglio Spettro completo delle suscettibilità individuali della specie Valutazione di eventuali interazioni tra sostanze diverse Svantaggi Svantaggi: Costosi e di lunga durata Necessità di numeri molto elevati per evidenziare aumenti di rischio Effetti misurati (a posteriori): presenza di malattie, decessi Difficoltà nel definire ll’esposizione esposizione (presenza di fattori confondenti) Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 5 Vantaggi: STUDI TOSSICOLOGICI Condizioni di esposizione facilmente manipolabili Possibilità di misurare effetti diversi Possibilità di variare parametri (età, sesso, specie, dieta, altri f tt i modulatori fattori d l t i lla risposta) i t ) Potenzialità di valutare i meccanismi Svantaggi: Possibili differenze di specie Incertezza della rilevanza dell’effetto nell’uomo Limitata variabilità interspecifica p irrealistiche Condizioni di esposizione Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 6 Gli studi in vivo hanno lo svantaggio di avere a disposizione un sistema molto complesso complesso. Paradossalmente questo è anche il loro maggior pregio: nessuno studio in vitro può singolarmente p fedelmente le interconnessioni tra i diversi sistemi riprodurre e tra i diversi processi che costituiscono il destino di uno xenobiotico nell’organismo. Gli studi in vitro sono estremamente utili per : • mirare i lla strategia t t i sperimentale i t l di eventuali t li studi t di in i vivo i • identificare i meccanismi di azione • identificare gli enzimi coinvolti nel metabolismo • produrre dati per l’applicazione l applicazione dei sistemi allometrici di scaling che permettono una maggiore accuratezza nelle estrapolazioni di specie (animale (animale-uomo) uomo) Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 7 STUDI in silico Vantaggi: Costi e tempi contenuti Possibilità illimitata di variare parametri e simulare scenari diversi Nessun uso di animali da laboratorio Svantaggi: Necessità di validazione con dati sperimentali ‘classici’ Estrema generalizzazione dei fenomeni (una semplice variazione nella configurazione di una molecola determina cambiamenti bi ti radicali di li nella ll sua attività tti ità bi biologica) l i ) Estrema dipendenza dalle conoscenze umane pregresse Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 8 Studi sperimentali di tossicità vs tempo 9 9 9 9 acuta: singola somministrazione; a breve termine (dosi ripetute o subacuta): 14--28 giorni; 14 prolungata (10 (10--25 % della vita dell dell’animale animale, subcronica): subcronica ): 3 mesi(nel ratto e nel topo) 1 anno (nel cane beagle) cronica (> 50% della vita): 2 anni nel ratto; 18 mesii nell topo t (in (i genere associata i t a studi t di di cancerogenesi) Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 9 A Aspetti tti regolatori l t i Gli studi inclusi nel Dossier devono essere condotti in accordo con specifiche Test Guidelines OECD in centri di ricerca certificati per le GLP (Good Laboratory Practice)/BPL (Buona Pratica di Laboratorio) Practice La compliance alle GLP dei centri di ricerca in Europa è certificata dalla Unità di Monitoraggio Nazionale che fa i ispezioni i i della d ll struttura e study d audits di ognii d due anni. i Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 10 Mutuo Riconoscimento dei Dati (MAD) Evita la duplicazione dei test regolatori F ilit gli Facilita li scambi bi commerciali i li Linee Guida OECD o test in All.V Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 Buona Pratica di Laboratorio 11 La valutazione del Rischio tossicologico Un Processo in 4 fasi: fasi: ¾ Hazard H d identification id tifi ti ((usato (usato t per la l classificaz classifica zione ione e l’etichettatura l’etichettatura)) ¾ Relazione R l i D DoseDose -risposta i t ¾ Valutazione della esposizione ¾ Risk Ri k characterization h t i ti La procedura L d èd definita fi it a livello li ll EU EU:: (Commission (C C Commission i i Directive 93/67/EEC; Council Regulation (EEC) 793/93; TGD Technical Guidance Document on Risk Assessment, Assessment 2003; Commission Regulation (EC) No. 1488/94. Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 12 1. HAZARD IDENTIFICATION (Id ntifi (Identificazione i n d dell p pericolo) i l ) Che differenza tra pericolo e rischio? Il pericolo i l è una caratteristica tt isti iintrinseca t i s d ll della sostanza e ne esprime la ‘pericolosità’. Ill rischio è la l probabilità l à di andare incontro agli l effetti avversi che la sostanza può provocare, in caso di d esposizione. Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 13 1. L’identificazione del pericolo riflette ll’Aspetto Aspetto Qualitativo della valutazione e risponde alla domanda: Che tipo di effetti avversi induce la sostanza ? Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 14 Studi di tossicità acuta * * * Studi St di di tossicità t i ità acuta t su ratto tt ((singola i l somministrazione LD50 orale, inalatoria, cutanea) t ) Studi di irritazione cutanea e oculare su coniglio Studi di sensibilizzazione su guinea pig Importanti per la classificazione ed etichettatura Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 15 TEST DI TOSSICITÀ ACUTA Sono assimilabili a casi di intossicazione acuta o avvelenamenti accidentali dovuti a incidenti e disastri ambientali (Seveso, sversamenti in mare delle petroliere in avaria), a volontarietà (suicidi) o ad uso incontrollato di sostanze chimiche riversate deliberatamente nell nell’ambiente ambiente (scarico non consentito di sostanze tossiche) Intossicazione accidentale. Deve essere possibile attribuire con certezza gli effetti osservati all’esposizione all esposizione (imputabilità) L’endL’ d-point L’end i t è il d decesso dell’animale; d ll’ i l il risultato i lt t sii esprime come LD50: la dose che si stima sia in grado di produrre la morte del 50% degli animali trattati Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 16 Classificazione UE (Etichettatura delle Sostanze pericolose) DL50 orale orale,, ratto DL50 cutanea cutanea,, CL50 (mg/kg) ratto o inalatoria coniglio g ratto (mg/lt (mg/kg) per 4 ore) Classe di tossicità ≤ 25 ≤ 50 ≤ 0,5 05 25 - 200 50 – 400 0,5 – 2 Molto M lt tossico t i (T+) Tossico (T) 200 – 2000 400 – 2000 2 - 20 Nocivo (Xn) Sostanze con DL50 maggiori non si classificano Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 17 • Un test di tossicità acuta dà indicazioni sul range di dosi da usare nei test a breve termine; • le osservazioni cliniche permettono di avere una prima idea dell’organo dell organo bersaglio; • l’analisi post-mortem permette di evidenziare gli organi bersaglio della tossicità; • considerando effetti tossici subletali si può ottenere il valore di DE50). Dose efficace 50 (DE50). E’ la dose con la quale si ha: ⇒ una risposta pari al 50% dell’effetto massimo (curve dose-risposta p graduali) g ) ⇒ una risposta nel 50% dei soggetti (curve dose-risposta quantali) Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 18 2. RELAZIONE DOSE-RISPOSTA Aspetto Quantitativo ‘Omnia venenum sunt: nec sine veneno qquicquam q existit. Dosis sola facit ut venenum non sit ‘ (Paracelso) A quale concentrazione si osserva l’effetto l effetto ? Il livello ‘efficace’ si raggiunge gg g attraverso: Una singola esposizione (acuta e generalmente elevata) incidenti, incidenti avvelenamenti Esposizioni p prolungate p g (basse ( dosi ripetute p nel tempo non tossiche singolarmente effetti cumulativi)) Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 19 Relazione dose-effetto. Curve dose-risposta La LD50 e/o la ED50 sono il primo esempio di curva dosedoserisposta espressione della relazione dosedose-effetto. Importanza della Forma della curva/ Pendenza della retta. (curva/retta ripida: piccole variazioni di concentrazione determinano grandi differenze nella risposta) decessi 100 % 50% LD50 A Corso Fitofarmaci LD50 B Roma, ISS 19 maggio 08 Dose mg/kg20 ¾ Dose soglia: soglia: la dose al di sotto della quale non si manifesta tossicità (dipende dall’endpoint in esame). La dose soglia sull’effetto ll’ ff critico i i è la l base b per estrapolare l i limiti li i i di sicurezza. DE50 e dose d s soglia s li sono s n una un misura misu della d ll potenza p t nz di un una sostanza tossica. tossica. A Effetto B>A B>A A>B B ED50 B Corso Fitofarmaci Dose soglia A ED50 A Roma, ISS 19 maggio 08 Dose mg/kg21 Quale è l ’Effetto Critico? L’effetto ’ ff critico può ò essere tale l perché: hé • è presente alle dosi più basse. basse • è più rilevante dal punto di vista tossicologico La prevenzione dell’effetto critico vale a maggior ragione anche per gli altri effetti. Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 22 Le curve dose dose-risposta variano con l’effetto g variano. tossico osservato ⇒ anche le dosi soglia LOEL NOEL Corso Fitofarmaci LOEL NOEL Roma, ISS 19 maggio 08 23 • LO(A)EL - Lowest Observed Adverse Effect Level: il più basso livello di dose (esposizione) in cui si osserva un effetto. •NO(A)EL - No Observed Effect Level: il più ù alto l livello l ll di d dose d (esposizione) ( ) in cui si osserva assenza di effetti. NOEL e LOEL si esprimono generalmente come: mg/kg /k peso corporeo/giorno / i •LOEC e NOEC (Concentrazione): nelle matrici (mg/l, etc.) Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 24 Alcuni criteri per riconoscere l’effetto critico : • Rilevanza tossicologica dell’effetto Dose-dipendenza dipendenza dell dell’effetto effetto • Dose • Presenza di effetti correlati alle dosi più alte (indicator di effetto precoce) : alterazione di parametri biochimici seguita da danni istopatologici (i.e. aumento delle transaminasi epatiche p vs ipertrofia p epatocellulare p o necrosi) • Coerenza del quadro generale • Presenza degli effetti in un numero levato di animali per gruppo • Presenza in entrambi i sessi . Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 25 Durata e frequenza dell’esposizione La tossicità di una dose specifica p aumenta all’aumentare della durata e della frequenza dell’esposizione, p , a causa di due fenomeni fenomeni:: 1. accumulo l del d l tossico t i nell’organismo ll’ i ⇒ la l frequenza di somministrazione è maggiore d ll della velocità l i à di eliminazione li i i ⇒ la l concentrazione dello xenobiotico supera la soglia li di tossicità i i à (necessità ( i à di conoscere i dati tossicocinetici) Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 26 Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 27 2. accumulo del danno ⇒ la velocità di somministrazione i i i è maggiore i d della ll velocità l i à di riparazione del danno da parte dell’organismo. Si può avere accumulo del danno anche senza accumulo l del d l ttossico i ⇒ il tempo t di recupero del d l danno è spesso maggiore del tempo necessario all’eliminazione ll’ li i i d dell ttossico i d dall’organismo. ll’ i Es: la somministrazione di etanolo causa deposito di lipidi nel fegato (steatosi); il tempo necessario per la scomparsa dei d i depositi d iti lipidici li idi i è molto lt più iù llungo di quello ll necessario all’eliminazione dell’etanolo ⇒ comparsa di effetti cronici (cirrosi) Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 28 3. VALUTAZIONE DELLA ESPOSIZIONE Quale è il livello di esposizione? quale concentrazione una data - esterna Aq sostanza è presente nei vari comparti ambientali/ dieta/aria /ambienti lavorativi/in prodotti ad uso voluttuario? l tt i ? Attraverso q quali vie l’uomo è esposto? p (inalatoria, ( , cutanea, orale..) quali situazioni ? lavoro,, ambiente,, stili di vita,, In q alimentazione.. A quale sostanza si è esposti? (ad es., possono essere rilevanti i prodotti di degradazione ambientale) bi t l ) Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 29 - interna A quale concentrazione la sostanza è presente neii varii distretti di i corporeii e nell sito i di azione? Quale è il destino della sostanza all’interno dell’organismo? Quale è la concentrazione della ‘specie chimica’ tossicologicamente rilevante? ADME Biomarcatori di esposizione Studi di biomonitoraggio e misura del ‘body-burden’ Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 30 Principali vie di ingresso: mucosa GI (via ( i orale) l ) epitelio polmonare (via inalatoria) cute (via dermale) Principali p vie di escrezione: urinaria fecale (via biliare) aria espirata sudore latte materno Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 31 Studi di tossicocinetica :ADME (AssorbimentoDistribuzioneMetabolismoEscrezione AssorbimentoDistribuzioneMetabolismoEscrezione)) • Somministrazione della sostanza (fredda o marcata) per via orale e i.v. o altre se pertinenti • Determinazione della concentrazione plasmatica f(t) per la determinazione di AUC, t1/2 e Cli • Determinazione della escrezione urinaria, fecale e nell’aria espirata f(t) del parentale e dei metaboliti • Identificazione dei vari metaboliti formati • Determinazione del potenziale di bioaccumulo (concentrazione nei vari organif(t) Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 32 Parametri essenziali da derivare: Assorbimento per via orale (esposizione attraverso i residui) id i) Assorbimento per via cutanea (esposizione professionale – se non disponibile si usano valori di default 10 e 100%) Assorbimento p per via inalatoria (esposizione ( p professionalep route to route extrapolation) Potenziale di bioaccumulo (valutazione effetti a lungo termine) Metaboliti tossicologicamente rilevanti (definizione dei residui) Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 33 4. CARATTERIZZAZIONE DEL RISCHIO Che previsione può essere fatta in merito alla frequenza e alla severità degli effetti nella popolazione esposta? Le informazione sulla relazione dose-risposta sono combinate bi con lle iinformazioni f i i sulla ll entità i à della esposizione per produrre una stima della probabilità b bili à di osservare l’l’effetto ff tossico i nella ll popolazione Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 34 Fattori di variabilità: variabilità Esposizione (durata, dose, via di esposizione): Quale popolazione e e’ più esposta ? Suscettibilità (età, stati pato/fisiologici, fattori genetici e/o acquisiti): Quale popolazione è più suscettibile, suscettibile indipendentemente dai livelli di esposizione? Se, attraverso la valutazione del rischio proteggo t questa/e t / popolazione/i l i /i proteggo anche la popolazione generale Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 35 Fattori di incertezza: del dato sperimentale (qualità degli studi disponibili) adeguatezza del modello sperimentale (specie animale rilevante, rilevante durata dello studio) della estrapolazione dei dati animali uomo e alte dosi sperimentali basse dosi reali Introduzione dei fattori di sicurezza (o incertezza) per tenere conto della variabilità e dell’incertezza nella determinazione dei valori di riferimento. riferimento Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 36 Procedure per il Risk Assessment Studio di tossicità rilevante ed effetto critico (dati sull’uomo e/o su animali) NOAEL uomo NOAEL animali Nessun fattore di incertezza Variabilità interspecifica UF=10 ( TK: 4x TD: 2.5) Estrapolazione Animali /uomo Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 37 Variabilità interspecifica UF=10 Fattore TDx TK =3.2x3.2=10 Differenze tra individui Variabilità intraspecifica UF 10 UF=10 Fattore di incertezza 10x10 =100 Qualità del dato/ Assenza di dati di tox cronica/Gravità dell’effetto UF=2 30 UF=2-30 UF Fattore di incertezza totale : 200 200-3000 Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 38 Fattori di incertezza La scelta di tali fattori dipende dalla valutazione complessiva e sono scelti dall dall’esperto esperto sulla base di ‘expert judgement’. Per quanto si cerchi omogeneità di g giudizio all’interno di ciascun ambito valutativo, nei diversi organismi internazionali o in dipendenza della destinazione d’uso si usano UF diversi. Gli UF (come molti valori di default) non sono basati su solide basi scientifiche e quindi ogniqualvolta si d disponga d di d dati sperimentali l è necessario considerarli. Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 39 ADI/TDI = Acceptable/tolerable p Daily Intake ADI/TDI= dose giornaliera g accettabile/tollerabile= dose che può essere ingerita ogni giorno per tutto l’arco della vita senza avere alcun rischio apprezzabile per la salute. salute Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 40 Calcolo della ADI/TDI Si calcola sulla base del NOAEL più basso identificato dagli studi di tossicità (preferibilmente dalla cronica), al quale si applica un fattore di ‘incertezza’ che varia in dipendenza della gravità degli effetti misurati. In assenza di genotossicità, tossicità riproduttiva/sviluppo e di oncogenicità si applica un fattore 100 (10 per la variabilità i t interspecifica ifi 10 per quella ll iintra-specifica). t ifi ) TDI= NO(A)EL ( ) UF Se il NOEL non è disponibile si può eccezionalmente utilizzare il LOEL, con un fattore di incertezza maggiore. Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 41 • In p presenza di effetti genotossici g o di possibili p effetti a lungo termine, tali da determinare la classificazione ed etichettatura del prodotto, ma non il suo bando, per d t determinare i l’ ADI sii usano f fattori tt i di sicurezza i >>100. 100 • Per cancerogeni g genotossici g : non si p può definire NOEL perchè si presuppone che il meccanismo non abbia una soglia definibile (one-hit event= in teoria basta un solo danno al DNA in un punto sensibile per dare inizio alla catena di eventi) • P Per cancerogenii non genotossici t ssi i : il m meccanismo ism ha h una soglia s li e si può definire un NOEL (es:solo in presenza di tossicità si sviluppa il tumore per un meccanismo di proliferazione cellulare compensatoria) Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 42 ARfD = Acute Reference Dose Si calcola solo se il PF ha un tossicità acuta elevata e/o specifica p (es:effetti ( neurotossici)) o effetti specifici p sulla riproduzione applicando un fattore di incertezza al valore del NOAEL di tossicità a breve termine. Definisce il rischio per gruppi di individui che ne facciano uso in quantità superiori alla media. ARfD= NO(A)EL UF Quando Quan o l’esposizione spos z on è mo molto to vicina c na a al valore a or di ARfD, fD, è necessario tenere in considerazione il rischio cumulativo derivante anche dalla esposizione ad altre fonti Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 43 AOEL= Acceptable Operator Exposure Level Si calcola dal valore di NOAEL più basso nei test tossicità a medio termine o di tossicità riproduttiva, corretto per il valore di assorbimento (orale e/o dermico) e applicando un opportuno fattore di incertezza (>100). Si possono definire un AOEL sistemico e uno cutaneo, cutaneo se necessario. Vengono identificati V id tifi ti i più iù appropriati i ti scenarii di esposizione e attraverso l’uso di specifici modelli si identifica l’AOEL l AOEL e i DPI (dispositivi di protezione individuale) che devono essere utilizzati per mitigare il rischio e devono essere indicati in etichetta. Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 44 Calcolo dei Valori Guida ((GV)) ADI/TDI parziali (quota di dose accettabile per ognii singola i l fonte f t di esposizione, i i i l incluso il consumo di acqua): si stima sulla base dei dati disponibili di monitoraggio (ambientale o alimentare) o di stime delle possibili assunzioni attraverso le vie di esposizione (es: ll’acqua acqua potabile). ¾Il GV sono riferiti ad una persona adulta di 60 kg di peso ed un consumo medio di acqua potabile di 2L al giorno ¾ Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 45 Calcolo dei Valori Guida ((GV)) GV= massima concentrazione accettabile ((MAC)) in ogni singola fonte di esposizione (es: acqua potabile, prodotti p p ittici….)) GV= TDI x peso corporeo x AF consumo giornaliero (C) AF= allocation factor= p proporzione p della TDI attraverso ogni singola fonte di esposizione. Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 46 Il Dossier di registrazione deve contenere inf rmazi ni sia sul principio informazioni principi attivo attiv che sulle varie formulazioni. Dati relativi al p.a. Identità e dati chimicochimico-fisici (es: punto di fusione e di * ebollizione, pressione di vapore, costante di Henry, densità solubilità densità, solubilità, logPow logPow, esplosività esplosività, infiammabilità ….)) * Descrizione degli usi e prove di efficacia * M Metodi di di analisi li i (in (i varie i matrici) i i) con relativo l i ll.o.d. d HPLC, GC, GC/MS, HPTLC, scintillazione,……metodi multiresiduo Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 47 *Studi * tossicologici per la valutazione dell’impatto sulla salute umana ed animale: Studi di tossicocinetica ((AssorbimentoDistribuzioneMetabolismoEscrezione)) * Studi di tossicità acuta su ratto (LD50 orale, orale inalatoria, cutanea) * * Studi St di di irritazione i it i cutanea t e oculare l s coniglio su i li Studi di sensibilizzazione su guinea pig Importanti per la classificazione ed etichettatura Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 48 * Studi di tossicità a breve termine 28 e 90 gg su roditore di ((ratto e topo); ) 28 28gg, 90 90gg e 1 anno su cane- via orale; eventualmente via cutanea e/o inalatoria. Identificazione di un NOAEL (No Observed Adverse Effect Level) e di un LOAEL ( Low Observed Adverse Effect Level) Propedeutici alla tossicità cronica e importanti per la definizione della ARfD * Studi di genotossicità (presenza e tipo di interazioni con il patrimonio patr mon o genet genetico co ) test di mutagenesi in vitro su batteri e cellule di mammifero, test in vitro di aberrazione cromosomica, test del micronucleo in vivo Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 49 * Studi di tossicità cronica (effetti cumulativi o a lunga latenza, sulla durata di vita e sulla incidenza di patologie degenerative) g ) e cancerogenesi (prevalenza delle neoplasie in generale, aumento della malignità o del numero di tumori per individuo, comparsa di patologie rare) 2 anni ratto e 18 8 mesi topo via orale (dieta) Identificazione di un NOAEL e di un LOAEL e dei principali effetti al LOAEL Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 50 * Studi di tossicità riproduttiva p e teratogenesi g studio riproduttivo a due generazioni (ratto) effetti sul ciclo c c o riproduttivo, r pro utt o, infanzia nfanz a e maturazione maturaz on ssessuale ssua (l’unico protocollo sperimentale standard in cui vi è una p completa p per p l’intero sviluppo) pp ) esposizione tossicità prenatale (su ratto e coniglio) effetti sulla gravidanza, malformazioni congenite e teratogenesi o Identificazione di un NOAEL e di un LOAEL e dei principali effetti al LOAEL Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 51 * Definizione dei residui rilevanti per il calcolo di MRL (Maximum (Max mum Residues Res dues Levels) Prove residui del p.a. e dei metaboliti rilevanti nelle specie agricole g di interesse e negli g animali. * Destino e comportamento ambientale (acqua, aria, suolo) * Eff tti sulle Effetti ll specie i non bersaglio b li Applicazioni A li i i di modelli d lli per simulazione i l i - Identificazione Id tifi i d deii metaboliti rilevanti Studi su vertebrati terrestri, specie acquatiche, api e artropodi utili macro-e utili, macro e micro-organismi micro organismi del suolo Valutazione complessiva del rischio Identificazione delle Frasi R e S da apporre in etichetta Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 52 Dati relativi al formulato e dati chimico-fisici (percentuale di p.a., * Composizione id tifi identificazione i e quantificazione tifi i d degli li altri lt i componenti) ti) * Descrizione degli usi e prove di efficacia * Metodi di analisi (in varie matrici) con relativo l.o.d. * Studi di tossicità acuta orale e cutanea, di irritazione cutanea e oculare, l d sensibilizzazione di bl * Studi di destino ambientale e tossicità Corso Fitofarmaci Roma, ISS 19 maggio 08 53