7. regolazione espressione genica 14.21.04
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13/05/15 21. Regolazione dell’espressione genica contiene materiale protetto da copyright, ad esclusivo uso personale; non è consentita diffusione ed utilizzo di tipo commerciale Le cellule di un organismo pluricellulare sono diverse l’une dalle altre pur avendo lo stesso patrimonio genetico perché sintetizzano e accumulano diversi RNA e proteine. Oggi sappiamo che le cellule si differenziano attraverso l’espressione differenziale dei geni. tre postulati: 1) Ogni nucleo cellulare contiene l’intero genoma istituitosi nell’uovo fecondato 2) Nelle cellule differenziate i geni non utilizzati non vengono distrutti né mutati, e mantengono la potenzialità di essere espressi. 3) In ogni cellula viene espressa soltanto una piccola percentuale del genoma, e una parte dell’RNA sintetizzato in ogni cellula è specifica di quel tipo cellulare. 1 13/05/15 Come fa la cellula a stabilire quali geni deve esprimere? Differenziamento serve affinchè le cellule producano RNA e proteine diverse, cioè geni diversi: In un organismo pluricellulare diversi tipi di cellula contengono lo stesso DNA In tutti gli organismi viventi le informazioni contenute nel genoma non si esprimono contemporaneamente, e sono finemente regolate. • Geni ad espressione costitutiva (housekeeping) • Geni ad espressione condizionale (inducibili, reprimibili) • Geni specializzati (tessuto specifici, che a loro volta possono essere costitutivi o condizionali) 2 13/05/15 Le cellule differenziate hanno tutte le informazioni per formare un organismo completo Cellula epidermica NON ha perso sequenze importanti di DNA Singola cellula genera intera pianta adulta La produzione di tipi celulari specializzati in genere non dipende da riarrangiamenti del DNA L’espressione genica può essere controllata a livello di molti passaggi distinti 3 13/05/15 Quali sono i meccanismi che determinano l’accensione o lo spegnimento dell’espressione di un gene? procarioti: – espressione genica selettiva permette alle cellule di risparmiare energia – La regolazione avviene per lo più a livello trascrizionale eucarioti: – espressione genica selettiva permette alle cellule di svolgere ruoli specializzati – La regolazione avviene a vari livelli Il controllo della trascrizione è basato sul riconoscimento di corte sequenze di DNA da parte di diverse classi di proteine proteine che legano il DNA devono avere alta af&inità per permettere una regolazione ef7iciente 4 13/05/15 i PROMOTORI dei geni contengono sito d’inizio dove comincia la trascrizione i geni hanno anche delle SEQUENZE di REGOLAZIONE del DNA che devono essere riconosciute da proteine che legano il DNA: i REGOLATORI della TRASCRIZIONE proteine si interfacciano con il DNA perché assumono una configurazione tridimensionale che si adatta al solco e formano strette interazioni con gruppo specifico di nucleotidi: Si legano al solco principale della doppia elica di DNA Si formano molti legami che danno luogo ad una interazione molto specifica e forte 5 13/05/15 Strategie di controllo dell’espressione genica nei batteri • Genoma estremamente compatto • Le RNA polimerasi possono riconoscere il promotore in assenza di altre proteine • Organizzazione dei geni in operoni • Regioni di controllo molto piccole (in genere <200 bp) Regolazione genica nei procarioti • Geni costitutivi: sono costantemente attivi (es. geni che codificano per gli enzimi della glicolisi) • Geni regolati: la loro espressione è regolata in modo tale che che la quantità del corrispondente prodotto (proteina o RNA) è controllata in relazione al fabbisogno cellulare (es. sintesi adattativa di enzimi) Scopo: Rispondere rapidamente ai cambiamenti ambientali Risparmiare energia; niente mRNA o proteine che non servano subito 6 13/05/15 molti geni batterici sono organizzati in “cluster”: gruppi di geni codificanti per proteine con funzioni correlate, (es. enzimi di una stessa via metabolica, proteine deputate al trasporto intracellulare ecc), che si trovano sotto il dominio di un unico promotore. OPERONE Unità di trascrizione che include: • Geni strutturali: codificano per le proteine di interesse • Operatore: Sito sul DNA riconosciuto dalla proteina repressore • Promotore: Sito sul DNA cui si lega l’RNA polimerasi per iniziare la trascrizione dei geni situati a valle La capacità dell’RNA polimerasi di iniziare la trascrizione dipende dall’assenza di impedimenti a livello dell’operatore; possono essere presenti dei repressori che impediscono l’inizio della trascrizione: regolazione negativa 7 13/05/15 esempi 1. per sintesi TRIPTOFANO servono cinque enzimi, codificati da cinque geni appartenenti allo stesso operone (trp) 2. per trasformare l’ALLOLATTOSIO in glucosio da utilizzare come fonte di energia sono necessari tre enzimi codificati da tre geni appartenenti allo stesso operone (lac) Controllo negativo: l’operon del triptofano VIA ANABOLICA, normalmente attiva (espressa), che viene inattivata o REPRESSA dalla presenza della molecola (il triptofano) che si forma per effetto delle attività enzimatiche. Repressore del Triptofano Si lega al DNA solo se associato a molecole di TRP 8 13/05/15 Controllo negativo: l’operon del triptofano Controllo negativo: l’operon del triptofano 9 13/05/15 Regolazione della sintesi del triptofano: operone reprimibile L’operone Lac codifica per le proteine necessarie per importare e digerire il lattosio Si tratta di una VIA CATABOLICA, normalmente inattiva (non espressa), che viene attivata (INDOTTA) dalla presenza della molecola da degradare (il lattosio) 10 13/05/15 Regolazione dell’operone lac L’espressione genica può essere controllata anche tramite attivatori proteici EX. L’operone Lac di E.Coli è controllato sia dal repressore Lac sia dall’attivatore CAP Devono associarsi con una seconda molecola per riuscire a legare il DNA: Ex. CAP lega cAMP prima di legare il DNA 11 13/05/15 L’operone Lac è controllato da due segnali La cellula deve metabolizzare il lattosio Operone lattosio (lac) Geni inducibili b-­‐galattosidasi Operone triptofano (trp) Geni reprimibili 12 13/05/15 Il controllo dell’espressione genica negli eucarioti è molto più sofisticato che nei procarioti Differenze della regolazione genica fra procarioti ed eucarioti • Dimensione e complessità del genoma • Compartimentazione del genoma • Organizzazione strutturale del genoma • Stabilità dell’mRNA • Modificazione post-­‐traduzionale delle proteine • Turnover delle proteine 13 13/05/15 Livelli multipli di regolazione dell’espressione genica degli eucarioti Il controllo della trascrizione avviene a più livelli: • Pre-­‐attivazione (Induzione di uno stato trascrizionalmente competente) • Inizio/re-­‐inizio della trascrizione § Fattori di trascrizione legati a specifici promotori/enhancers § Co-­‐attivatori (acetilasi degli istoni, attivita’ che rimodellano la cromatina) § Fattori “generali” di trascrizione (GTFs) e RNA polimerasi • Elongazione del trascritto • Terminazione del trascritto 14 13/05/15 trascrizione dei geni eucarioti controllata da numerosi elementi TBP TFIIs Pol.II ery machin Basal tr. ~ -­‐200 ENHANCER (~ 100 bp) intensificatori TATA PROSSIMALE ~ -­‐50 CORE PROMOTORE § La funzione principale dei fattori di trascrizione e’ di facilitare l’assemblaggio del macchinario basale di trascrizione sul promotore essenziale (core). Il promotore essenziale (core promoter) • Determina il sito di inizio della trascrizione e dirige il legame dell’ RNA Pol II • I promotori essenziali più frequenti per l’RNA Pol II sono: – TATA box: la sua sequenza e’ altamente conservata (TATAAA); si trova prevalentemente in geni che vengono trascritti rapidamente, ed e’ localizzata ~25-­‐30 bp a monte del sito di inizio della trascrizione. è la TATA box dirige l’inizio della trascrizione a siti ben definiti – Isole CpG: proprio di molti geni “house-­‐keeping”. La trascrizione comincia a siti multipli disseminati in una regione di circa 20-­‐200 bp. 15 13/05/15 Inizio trascrizione richiede • Fattori di trascrizione generali insieme con l’RNA Pol II formano l’apparato trascrizionale basale, che lega il promotore essenziale ed è sufficiente alla trascrizione • Fattori di trascrizione specifici, anche richiesti per la trascrizione attivata: servono per reclutare e assemblare l’apparato trascrizionale – Si legano a elementi di riconoscimento sul promotore e sull’enhancer nell’attivazione di un gene sono normalmente coinvolti multipli fattori di trascrizione I meccanismi di controllo usati per regolare l’espressione dei geni umani devono essere molto più complessi da quelli utilizzati dagli altri organismi. • Regolazione trascrizionale • Regolazione post-­‐trascrizionale • Meccanismi epigenetici e controllo dell’espressione genica a lunga distanza 16 13/05/15 Controllo dell’espressione genica a lunga distanza 1. attivatore si lega al DNA su enhancer (o intensificatore) 2. Si legano GTF 3. Il DNA si ripiega ad ansa 4. Legame attivatore con Mediatore 5. Si lega RNA polimerasi Gli attivatori trascrizionali reclutano TFIID 17 13/05/15 NB I fattori di trascrizione devono legarsi al promotore prima dell’RNA pol RNA pol inizierà la trascrizione in maniera dipendente dal legame di attivatori e repressori. Elementi distali Elementi prossimali Promotore basale 18 13/05/15 enhancers intensificano la trascrizione indipendentemente da orientamento (d, f), distanza (e) e posizione (g) Gli enhancers o gli elementi di risposta legano fattori di trascrizione (TF) tessuto specifici e/o inducibili: responsabili delle regolazione genica differenziale nei vari tessuti 19 13/05/15 Riassunto delle principali caratteristiche degli enhancers 1. Attivano l’utilizzazione di un promotore, controllandone l’efficienza e la velocità di trascrizione 2. Non è necessario che siano posti sul lato 5’ del gene (a monte) ma possono essere anche all’estremo 3’, negli introni o anche nel filamento di DNA complementare 3. Regolano l’espressione genica in modo tempo-­‐ e tessuto-­‐specifico 4. La maggior parte dei geni necessita di enhancer per essere trascritta 5. Sono i principali determinanti della trascrizione differenziale nello spazio (tipo cellulare) e nel tempo 6. Un dato gene può avere più siti enhancers e ciascun enhancer può legare più fattori di trascrizione 7. Attivano la trascrizione: a) stabilizzando i fattori generici e quindi facilitando il legame della RNApol al promotore b) b) rimodellando la cromatina in modo da esporre il sito promotore Sinergia e cooperazione tra molecole di fattori trascrizionali: concetto di enhanceosoma Sinergia TBP + TAFs=TFIID Enhanceosoma Cooperazione Il legame cooperativo porta all’assemblaggio di strutture nucleoproteiche specifiche per ogni promotore: l’enhanceosoma 20 13/05/15 Repressori trascrizionali eucariotici a) competizione con il legame di un attivatore b) schermare il dominio di attivazione dell’attivatore c) legame al complesso trascrizionale d) reclutamento modificatore degli istoni che altera il nucleosoma (ex. inducendo una deacetilazione (meccanismo più comune) CROMATINA • EUCROMATINA -­‐> TRASCRIZIONE POTENZIALE a) geni housekeeping b) geni tessuto-­‐specifici • ETEROCROMATINA FACOLTATIVA -­‐> inattiva quando condensata. • ETEROCROMATINA COSTITUTIVA -­‐> sempre inattiva; Localizzata nelle regioni peri -­‐ e centromeriche 21 13/05/15 Meccanismi epigenetici Fattori che vengono trasmessi alla progenie, ma che non sono direttamente attribuibili alla sequenza del DNA. • Metilazione del DNA Nelle cellule eucariotiche la metilazione è a carico della Citosina. Solo il 3% delle C sono metilate ed in genere è bersaglio della metilazione la C della doppietta CpG. • Modificazioni degli istoni Acetilazioni, fosforilazioni e metilazioni, responsabili di cambiamenti conformazionali della cromatina. Metilazione del DNA La metilazione del DNA è un processo post-­‐replicativo. L’estensione delle modificazioni riguardanti la metilazione del DNA è fondamentalmente decisa durante lo sviluppo. La metilazione del DNA è quindi uno dei meccanismi correlati con il differenziamento cellulare, tramite l’inibizione dell’espressione genica a livello trascrizionale. 22 13/05/15 Modificazioni degli Istoni I residui amminoacidici all’N-­‐terminale di ciascun istone (20-­‐60 residui) si estendono al di fuori della superficie del nucleosoma. Queste regioni sono particolarmente ricche in lisina (K) che può essere reversibilmente modificata mediante acetilazione, fosforilazione e metilazione. Schema riassuntivo del controllo dell’espressione genica 23
