Diapositiva 1 - W W W . T E L E S A . ORG

17° CORSO NAZIONALE PER TECNICI DI
LABORATORIO BIOMEDICO
RICCIONE 25-28 maggio 2010
NOVITA’ IN TEMA DI HPV
Stefania Casazza
S.C. Anatomia Patologica – E.O. Galliera
GENOVA
RAZIONALE
•
Numerosi studi epidemiologici,clinici e di biologia molecolare hanno
evidenziato una stretta correlazione tra la neoplasia cervicale e
l’infezione da Human Papilloma Virus (HPV).
•
E’ stata ampiamente dimostrata la capacità di questi virus a indurre
la trasformazione in senso displastico-neoplastico nelle cellule
infettate, soprattutto a livello genitale femminile.
•
Il problema clinico strettamente attuale è poter individuare
precocemente le donne che presentino un’infezione virale “attiva”
che risultino cioè ad alto rischio di sviluppare lesioni neoplastiche.
• Sottoporre queste donne ad un follow-up clinico e strumentale
“personalizzato”
HUMAN PAPILLOMA VIRUS
• Sono stati caratterizzati oltre 120 tipi di
papilloma virus umano (HPV) che possono
infettare la cute e le mucose.
• Di questi almeno 40 infettano la cervice e la
mucosa dei genitali.
• Circa il 75% della popolazione entra in contatto
con uno o più HPV nel corso della vita.
HPV: CICLO VITALE
• Gli HPV penetrano nell’epitelio attraverso
microabrasioni e raggiungono, infettandole,
le cellule dello strato basale.
• Si replicano all’interno del nucleo delle
cellule dell’epitelio squamoso stratificato,
sfruttando la differenziazione cellulare.
Human Papilloma Virus (HPV)
• Famiglia di virus a DNA (Papovaviridae) il cui
genoma comprende delle regioni che
codificano per “proteine precoci “ (E, early) e
regioni che codificano per “proteine tardive”
(L, late).
• Le proteine precoci più studiate sono le E6
ed E7 la cui iper-espressione risulta essere
la maggior causa del processo di
trasformazione cellulare.
HPV Genoma Virale: Funzioni durante
il ciclo cellulare
L1
L2
E1
 Producono proteine capsidiche
 Legano il DNA virale e auto-assembla
 E1/E2: replicazione del genoma virale
E2
 E4: destabilizza il citoscheletro
E4
 1st proteine virali prodotte
E5
 Coinvolti nella trasformazione
cellulare
E6
 Causano le alterazioni precancerose
E7
 Sopprimono la regolazione del ciclo
cellulare
 Inibiscono l’apoptosi
HPV Genoma Virale
URR: Regione di regolazione principale
E:
precoce
URR
L:
tardiva
PAL
Replicazione del genoma virale
Replicazione del genoma virale
p97
Proteine capsidiche virali
Group:
Group I (dsDNA)
Family:
Papillomaviridae
Genus:
Papillomaviridae
Species:
Human papillomavirus
Genome:
8,000 base pairs
8 open reading frames
Encode for 10 proteins
Size:
55nm in diameter
E1
p670
Replicazione del genoma virale
Proteine capsidiche virali
PAE
E2
Replicazione del genoma virale
Codificazione proteinica per
la fase finale di replicazione
HPV: patogenesi
HPV a “Basso Rischio” (LR-HPV):
• 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81
• 90% condilomi genitali
• 4-25% lesioni cervicali CIN I (L-SIL)
HPV ad “Alto Rischio” (HR-HPV):
• 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,52, 56, 58,
59, 68, 73, 82
• 25% CIN I
• 70% CIN 2-3 (H-SIL)
• Oltre 85-98% carcinomi cervicali
HPV - HR
Gli HPV-HR tipo 16 e 18 risultano di
gran
lunga
quelli
più
frequentemente
implicati
nella
genesi del carcinoma cervicale:
sono responsabili rispettivamente
del 60% e del 10% di tutti i tumori
cervicali (seguiti poi dagli HPV tipo
31, 33 e 45 !!).
• La maggior parte delle donne contrae un’infezione da
HPV entro pochi anni dall’inizio dei rapporti sessuali.
• Il 75-80% di queste infezioni risultano TRANSIENTI,
regrediscono spontaneamente (coinvolgimento attivo
del sistema immunitario).
• In circa il 20% dei casi l’infezione PERSISTE più a
lungo e può essere riscontrata anche a molti anni di
distanza (infezione latente).
• Circa il 40% delle infezioni persistenti da HPV-HR
PROGREDISCONO in lesioni precancerose di alto
grado (HSIL).
• Solo l’1% di infezioni persistenti con tipi virali ad alto
rischio esitano in carcinoma , dopo un intervallo
medio di 15 anni.
Possibile evoluzione
dell’infezione da HPV
• REGRESSIONE
• PERSISTENZA – INTEGRAZIONE
• PROGRESSIONE
Fattori che favoriscono la
PERSISTENZA dell’infezione da HPV
• Immunodepressione
• Infezione da HPV-HR (specie tipo 16 e 18)
• Elevata carica virale di HPV
• Co-infezione di vari tipi di HPV
• Il grado della lesione presente a livello cervicale
• Infezione contemporanea da parte di Herpes Virus,
Chlamydia
INTEGRAZIONE DEL GENOMA
VIRALE
• Entro
“cellule
non
permissive”
l’integrazione del genoma virale degli
HPV-HR
induce
un’espressione
deregolata delle oncoproteine virali E6 ed
E7 che interagiscono, inattivandole, con
le proteine regolatrici del ciclo cellulare
(principalmente la P53 e pRB): alterazioni
nella maturazione e nella proliferazione
cellulare, acquisizione e mantenimento
fenotipo displastico-neoplastico.
Gli oncogeni virali interferiscono con I geni
soppressori del carcinoma cervicale
Oncoproteine
Cromosoma
E6
E7
Espresse nel carcinoma cervicale in
seguito all’integrazione nel
cromosoma della cellula ospite
lega p53
lega pRb
Alto Rischio vs. Basso Rischio
16, 18, 45
E6
Alto
Rischio
E7
Basso
Rischio
E6
6, 11
E7
 Integrazione nel DNA della cellula
 Incapaci di integrarsi nel DNA
ospite
della cellula ospite
 Proteine che interrompono lo
schema riproduttivo cellulare
 E6 non degrada p53
 Forte legame con la proteina p53
e pRb
 E7 lega debolmente la pRb, senza
inattivarla
OBIETTIVI
• Individuare le donne affette da infezioni virali persistenti, indotte
da HPV-HR, in cui sia già avvenuta l’integrazione del genoma
virale.
• Classificare e “stratificazione” le lesioni da ritenersi ad alto
potenziale di trasformazione e progressione in senso neoplastico,
anche quelle non ancora clinicamente e/o citologicamente
definibili (ASC-US / L-SIL)
• Follow-up delle lesioni LSIL/HSIL per monitorare la progressione.
• Monitorare l’efficacia del trattamento per displasia cervicale
(individuazione precoce “malattia residua”)
• Definizione di mirati e “personalizzati” protocolli di trattamento e
follow up delle pazienti con controlli clinico-patologici
(colposcopia) più appropriati al singolo caso.
STRUMENTI
DIAGNOSTICI
DIAGNOSTICA CITOLOGICA
DEGLI HPV
• Sensibilità del Pap-test nell’identificazione delle
lesioni pre-neoplastiche della cervice uterina:
70% (con 20% di falsi negativi)
• Se affiancato a metodiche di biologia molecolare
(DNA e mRNA test):
sensibilità fino al 98%
• L’introduzione della citologia su “strato sottile”
migliora la performance del Pap-test:
– Riduzione strisci inadeguati
– Aumento accuratezza diagnostica
– Rende possibile l’esecuzione simultanea
(sullo stesso campione) sia dell’indagine
morfologica che molecolare.
DNA TEST- HPV
•
Metodiche d’indagine che consentono di
identificare e/o genotipizzare il DNA degli
HPV (LR/HR) a partire da campioni sia
citologici che istologici.
•
I tests commerciali disponibili sono
molteplici,
con
caratteristiche
estremamente varie di complessità,
costi, affidabilità, livello di automazione
ed accuratezza.
IBRIDAZIONE IN SOLUZIONE
(Hybrid Capture – HC2)
Evidenziazione di 13 HPV-HR e 5 HPV-LR,
probes a RNA che formano ibridi RNA/DNA
molto stabili catturati da anticorpi coniugati
ad un complesso di fosfatasi alcalina.
Il segnale è amplificato di 3000 volte e viene
evidenziato su un substrato chemioluminescente
e
misurato
con
un
luminometro.
PCR (Amplificazione genica)
Amplificazione enzimatica in vitro di una definita sequenza
di DNA (target)
Primers regione altamente conservata L1(Test “screening”):
• MY09/MY11: identificano oltre 30 tipi di HPV (450 bp)
• GP5+/GP6+: (140 bp)
Primers regioni conservate di E6/E7 (Test “tipizzazione”):
•pU-1M/pU-2R:
identificano HPV-HR tipo 16,18,31,33,35,45,52,58
(233-268 bp)
•pU-31B/pU-2R: identificano HPV-LR tipo 6,11 (248 bp)
MARCATORI DI
PROGRESSIONE DELLA
MALATTIA DA HPV
GENOTIPIZZAZIONE HPV
Nel follow up delle pazienti trattate per CIN2+ può
rappresentare un valido strumento per discriminare
precocemente le pazienti persistentemente positive
per uno specifico tipo di HPV-HR, specie HPV16 e
HPV 18.
“Linear Array HPV Genotyping test”(Roche):
• PCR (primers MY09/MY11)
• Denaturazione ampliconi e ibridazione su Array (strip)
marcate con sonde specifiche per 37 tipi di HPV
TECNICHE DI
SEQUENZIAMENTO
MICRO
ARRAY
I Microarray di DNA (matrici ad alta densità) sono costituiti
da un insieme di microscopiche probe di DNA fissate ad
una superficie solida come vetro, plastica, o chip di silicio
formanti un array (raggruppamento). Si fa avvenire
l'ibridazione fra la sonda presente sulla matrice e il DNA
target che può essere identificato semplicemente rilevando
la posizione dove è rimasto legato.
CARICA VIRALE
• Diversi studi hanno dimostrato che pazienti
con alta carica virale di HPV-HR hanno un
rischio aumentato di sviluppare il cancro della
cervice.
• La “PCR Quantitativa Real Time” rappresenta
l’approccio migliore per la quantificazione
degli acidi nucleici.
• La tecnica si basa sul monitoraggio continuo
dei prodotti durante l’amplificazione: elevata
sensibilità, alta riproducibilità e rapidità di
esecuzione.
RNA TEST - HPV
mRNA E6/E7 HPV-HR TEST
L’analisi trascrizionale degli oncogeni E6/E7
rappresenta un indicatore diretto dell’
espressione deregolata delle relative proteine
entro la cellula ospite.
• PreTect HPV Proofer (NorChip)
• NucliSENS EasyQ HPV (Biomerieux)
• APTIMA (Gen-Probe)
NucliSENS EasyQ - HPV (Biomerieux)
E’ un test di amplificazione e di rilevazione in
“tempo reale” degli acidi nucleici per la
determinazione dell’mRNA di E6/E7 degli
HPV-HR 16,18,31,33,45
• Estrazione DNA/RNA
• Amplificazione
• Rilevamento
CONSERVAZIONE
RNA
• I campioni citologici conservati in
PresrvCyt devono essere conservati
almeno a -20°C (max 6 settimane)
• I campioni citologici lisati in Lysis
Buffer (tiocianato di guanidina e Triton
X-100) sono stabili a T ambiente (max
24 h) o a -70°C (max 4 mesi)
ESTRAZIONE DNA/RNA
(MiniMAG o EasyMAG)
ESTRAZIONE DNA/RNA
(MiniMAG o EasyMAG)
• Al campione cervicale conservato nella soluzione
di PreservCyt viene aggiunto il Lysis Buffer:
rilascio degli acidi nucleici e inattivazione di tutte
le RNasi e DNasi.
• Al lisato si aggiunge la SILICE MAGNETICA: gli
acidi nucleici si legano alle particelle magnetiche.
• Lavaggi in tamponi
• Eluizione DNA/RNA
AMPLIFICAZIONE
• Il test contiene un cocktail di 6 coppie di primers per
la rilevazione degli mRNA target di HPV
16,18,31,33,45 e U1A (gene housekeeping).
• Amplificazione Real-Time NASBA:
si basa su un processo isotermico (41°C) ripetitivo di
annealing dei primer, sulla formazione di DNA a
doppia catena contenente un sito promotore T7 e
sulla trascrizione di molteplici copie delle sequenze
target dell’RNA (ampliconi)
RILEVAZIONE
Il processo di rilevazione impiega 6 “Sonde Beacon” target-specifiche.
Sonda Beacon: è una sequenza oligonucleotidica, associata ad un
fluoroforo e ad un quencher, in grado di riconoscere e ibridare con uno
specifico RNA target.
In assenza dell’ibrido la sonda forma una struttura “a molletta”: il
fluoroforo è vicino al quencher e non si libera fluorescenza.
RILEVAZIONE
Se si forma l’ibrido si ha l’apertura del
Beacon ed emissione di fluorescenza,
segnalando la presenza dell’RNA target.
L’analisi cinetica (grafico) dei segnali
fluorescenti da parte di un analizzatore
rivela la trascrizione dell’U1A e di
ciascuno dei 5 RNA target degli HPV.
Uno specifico programma interpreta i
grafici come positivi/negativi per gli RNA
specifici.
NASBA Principle
Caratteristiche del test
Riproducibilità: 96-100%
Sensibilità clinica 98%
Specificità: 92%
Valore Predittivo Positivo (PPV)
ASCUS/L-SIL verso H-SIL:
40% mRNA Test
14-16 % DNA
Valore Predittivo Negativo (NPV)
96-98% circa per entrambi i Test
Test
• La
ricerca
dell'mRNA
delle
oncoproteine E6/E7 degli HPV-HR nelle
lesioni ASCUS e L-SIL evidenzia una
percentuale di pz infettati da HPV più
bassa (6% e 25%) rispetto a quella
rilevata da DNA-test (32% e 55%).
• La
percentuale
aumenta
con
l'aumentare del grado della lesione
(oltre il 60%) per entrambi i test.
CONCLUSIONI
1.
2.
3.
4.
Valido strumento diagnostico per la rilevazione
latente delle lesioni ad alto grado nei casi
ASCUS/LSIL
Determinazione combinata di genotipizzazione di 5
tipi HPV-HR e relativa attività oncogenica.
Nuovi Algoritmi nella gestione del TRIAGE
ASCUS/L-SIL : colposcopia solo se mRNA test
positivo! (se negativo : follow-up secondo LINEE
GUIDA NAZIONALI)
LIMITE DEL TEST:
SOLO 5 GENOTIPI DISPONIBILI !!
PROTEINA P16
ad attività “tumore-soppressore”
che regola il ciclo cellulare (fase G1-S)
• Proteina
• Iperespressione di P16 nelle cellule
cervicali displastiche è direttamente
correlata all’ipertrascrizione dell’ oncogene
virale E7 degli HPV-HR.
•Rilevabile mediante indagini di IIC (MoAb)
IPER-ESPRESSIONE P16INK4a
• L'iper-espressione della P16ink4a può
essere
utilizzata
quale
marker
molecolare di lesione cervicale precancerosa e cancerosa associata ad
HPV-HR
• Permette di riconoscere lesioni di
basso grado HPV-HR ad alto rischio di
progressione
(marker
indiretto
di
progressione maligna).
Foto p16
Grazie !