Genetica ed immunità innata - Web server per gli utenti dell

Progetto per FONDAZIONE CARIPLO (2005)
Responsabile scientifico: Professor Mauro Podda
Titolo
GENETICA ED IMMUNITA’ INNATA: studio della variabilita’ genetica determinante l’attivazione
di cellule del sistema immunitario innato in pazienti con cirrosi biliare primitiva, nei loro
consanguinei ed in donatori di sangue
Il gruppo di ricerca sarà composto da
 due Unità Operative (UO) della Facolta’ di Medicina Universita’ di Milano:
UO n. 1 Cattedra di Medicina Interna II, Dipartimento di Medicina, Chirurgia e Odontoiatria –
Università di Milano (Prof. Mauro Podda – Responsabile scientifico)
UO n. 2 Cattedra di Genetica Umana, Dipartimento di Medicina, Chirurgia e Odontoiatria –
Università di Milano (Prof. Giuseppe Simoni)
 un partner estero
Division of Rheumatology, Allergy and Clinical immunology, University of California at Davis,
California, USA (Prof. M. Eric Gershwin)
Durata prevista del progetto: 2 anni
Valore complessivo del progetto: Euro 250.000 (Euro 125.000 richiesti alla Fondazione Cariplo)
Premessa e risultati preliminari
La cirrosi biliare primitiva (CBP) e’ una malattia colestatica cronica ad eziologia ignota che
colpisce nella maggioranza dei casi individui di sesso femminile dopo la menopausa e che conduce
a progressiva duttopenia con risultante insufficienza epatica [1]. Dati epidemiologici indicano che la
malattia presenta una prevalenza variabile nelle diverse aree geografiche e che questa puo’
raggiungere i 40 casi/100,000 abitanti nella popolazione generale [2]. Diverse osservazioni indicano
una patogenesi autoimmune; queste comprendono il riscontro di autoanticorpi anti-mitocondrio
(AMA) nel siero del 90% dei pazienti e di linfociti T autoreattivi [3]. In entrambi i casi, la specifica
autoreattivita’ e’ diretta contro proteine situate sulla membrana interna dei mitocondri, piu’
frequentemente la subunita’ E2 dell’enzima piruvato deidrogenasi (PDC-E2). La teoria piu’
accreditata sulla eziopatogenesi della CBP presuppone che uno stimolo ambientale scateni la
malattia in individui geneticamente predisposti [2]. La suscettibilita’ genetica allo sviluppo della
CBP e’ sostenuta dai dati riportati dal nostro gruppo sulla elevata concordanza osservata in coppie
di gemelli monozigoti [4] e da numerosi studi di associazione di polimorfismi genici [5]. A
differenza della maggior parte delle malattie autoimmuni, tuttavia, va sottolineato come la ricerca di
un’associazione tra la CBP e aplotipi del complesso maggiore di istocompatibilita’ (MHC) abbia
riportato finora risultati negativi o significativita’ deboli o limitate ad aree geografiche specifiche
[5]. Nel caso dell’Italia, ad esempio, il nostro gruppo ha di recente riportato un profilo MHC
pressoche’ unico in un’ampia popolazione di pazienti con CBP e controlli [6]. L’importanza di
fattori ambientali nell’insorgenza della malattia e’ indicata da dati geoepidemiologici (con una
maggiore prevalenza riportata nelle nazioni Scandinave e nel Regno Unito) [2], dal riscontro di
coppie di gemelli monozigoti discordanti per CBP [4] e da dati sperimentali. Questi ultimi hanno
suggerito che agenti infettivi, in particolare batteri, o composti chimici alogenati (xenobiotici)
possano essere responsabili dell’insorgenza dell’autoimmunita’ nella CBP. A questo proposito, la
teoria piu’ accreditata e’ quella della mimicry molecolare da parte di strutture proteiche simili agli
antigeni self.
L’immunita’ innata e quella adattativa costituiscono i due rami principali del sistema immunitario e
sono state a lungo considerate come totalmente indipendenti. L’immunita’ adattativa, rappresentata
dai linfociti T e B, presenta una cinetica di reazione lenta ma anche una funzione di memoria
specifica che consente un piu’ rapido riconoscimento degli antigeni non-self in seguito ad una prima
immunizzazione. Al contrario, l’immunita’ innata, rappresentata principalmente da
monociti/macrofagi, neutrofili polimorfonucleati (PMN) e cellule natural killer (NK), e’
caratterizzata da una cinesi di risposta piu’ rapida legata al riconoscimento di motivi costanti
presentati da agenti infettivi come il lipopolisaccaride (LPS) nei batteri Gram-negativi. Come detto,
queste due componenti sono state a lungo considerate come totalmente indipendenti fino a che piu’
di recente sono state identificate nuove vie di interazione che consentono una significativa influenza
reciproca tra le popolazioni cellulari coinvolte [7], in particolare mediata dalla secrezione di
citochine pro-infiammatorie [8].
Nel caso della CBP, la maggior parte degli studi immunologici sono stati dedicati alla reazione
adattativa che hanno prodotto la definizione degli autoantigeni della risposta autoimmune cellulare
ed umorale. Nel caso dell’immunita’ innata, viceversa, i dati sono limitati. Il gruppo americano
collaborante a questo progetto ha recentemente studiato dal punto di vista qualitativo e quantitativo
le cellule NK nel tessuto epatico e nel sangue periferico di pazienti con CBP e controlli. I risultati
hanno dimostrato come nella CBP esista una maggiore concentrazione di tali cellule a livello
epatico rispetto ai controlli [9]. Per quello che riguarda monociti e PMN, il nostro gruppo ha di
recente studiato la risposta di tali cellule ottenute da pazienti con CBP e controlli allo stimolo con
determinanti batterici come il LPS (dati non pubblicati). I risultati (Figura 1) mostrano come cellule
di CBP producano livelli piu’ elevati di citochine pro-infiammatorie (TNF-, IL-6, IL-8) rispetto
alle cellule di controlli sani. Altre evidenze includono il ruolo recentemente definito del toll-like
receptor 9 (TLR9) nel riconoscimento di sequenze batteriche e nello sviluppo degli elevati livelli di
IgM caratteristici della CBP [10]. Complessivamente, queste osservazioni, associate al possibile
ruolo di agenti infettivi nell’induzione dell’autoimmunita’ [11], indicano come le cellule del sistema
innato di pazienti con CBP possano essere piu’ suscettibili a determinati stimoli batterici e siano
pertanto ‘primed’ per lo sviluppo di una risposta immunitaria aberrante complementare alla
mimicry molecolare. Lo studio dell’immunita’ innata appare pertanto cruciale nella comprensione
della patogenesi della CBP, in modo simile a quanto osservato in altre malattie autoimmuni [12,
13].
Le cellule NK sono fondamentali mediatori tra i comparti innato ed adattativo del sistema
immunitario attraverso la produzione di specifiche citochine [14]. I geni che codificano per i
recettori simil-immunoglobuline delle cellule NK (KIR) costituiscono una famiglia di geni
caratterizzati da un elevato polimorfismo [15]. Sommariamente possiamo affermare che un modello
di diversita’ aplotipica del KIR sia basato su 6 diverse combinazioni. In particolare, la meta’
centromerica del KIR e’ composta da tre combinazioni principali mentre la meta’ telomerica puo’
assumere una forma corta con una variabile tra 2DS4 o KIR1D oppure una forma lunga con diverse
possibili combinazioni di geni KIR [16]. In modo simile a quanto osservato nel lupus eritematoso
sistemico [17], gli aplotipi dei KIR possono costituire una base genetica costitutiva e necessaria che
predisponga allo sviluppo di autoimmunita’ attraverso i meccanismi descritti in precedenza.
Il recettore per le IgG Fc (FcR) e’ espresso sulla membrana citoplasmatica di monociti/macrofagi
e PMN; esso lega, oltre alle IgG, anche un mediatore importante di fase acuta come la proteina C
reattiva (PCR) [18]. Un polimorfismo (His131Arg) del gene che codifica per FcRIIa puo’ alterarne
l’attivita’ di legame e quindi influenzare la risposta di tali cellule in corso di risposta acuta ad
infezioni [17].
Figura 1. Livelli di citochine proinfiammatorie indotte da LPS in monociti/macrofagi di pazienti
con CBP e controlli sani.
Obiettivo del Programma di Ricerca
Obiettivo generale del progetto è quello di verificare se la presenza di specifici genotipi di KIR e
FcRIIa siano legati ad un’aumentata suscettibilità a CBP o ad una malattia piu’ severa.
La ricerca sarà suddivisa in due fasi i cui obiettivi specifici saranno:
Fase 1 (primo anno)
 Valutare l’associazione tra specifici aplotipi di KIR e FcRIIb e la presenza di CBP in uno
studio trasversale di associazione caso-controllo
 Valutare l’associazione tra aplotipi di KIR e FcRIIb e le caratteristiche cliniche dei pazienti
con CBP
Fase 2 (secondo anno)
 Attraverso uno studio di linkage verificare l’associazione tra gli aplotipi determinati nella
fase 1 e la malattia in clusters familiari
Disegno dello studio
Fase 1 (primo anno)
La prima fase della ricerca è divisa in due parti che verranno condotte concomitantemente:
(1) La prevalenza dei genotipi KIR e FcRIIb sarà valutata utilizzando le metodologie
precedentemente descritte [16, 17] in 200 pazienti con CBP e 400 controlli sani appaiati ai pazienti
per sesso, eta’ e provenienza geografica come descritto altrove [6].
(2) Nei pazienti con CBP verranno analizzate le correlazioni tra gli aplotipi analizzati e le
caratteristiche cliniche. In particolare verranno utilizzate come variabili lo stadio istologico [19], la
presenza di complicanze di malattia avanzata (sanguinamento digestivo da impertensione portale,
scompenso ascitico, encefalopatia epatica, carcinoma epatocellulare), il punteggio di Mayo come
indice prognostico validato [20] e gli indicatori sierologici (presenza di autoanticorpi) e biochimici
(fosfatasi alcalina, tempo di protrombina)
Fase 2 (secondo anno)
La seconda fase della ricerca è divisa in due parti:
(3) Ci si propone di analizzare i genotipi KIR e FcRIIb in 300 consanguinei di pazienti con CBP.
(4) Verranno analizzati i genotipi KIR e FcRIIb in famiglie con almeno due membri affetti da
CBP usando un’analisi di associazione. Il gruppo delle famiglie con più di un consanguineo affetto
sarà costituito da 100 famiglie con CBP (in maggior parte fornite dall’UO #3 di questo progetto).
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