PROGETTO STRAIN-STRAtegie terapeutiche INnovative
Relazione Finale
La psoriasi è una patologia infiammatoria della pelle e di altri organi ancora poco studiata, essa
colpisce circa il 2-3% della popolazione mondiale.
Per la sua natura cronica ed incurabile, la psoriasi ha un impatto sulla comunità principalmente sociale
ed economico. Inoltre, è una malattia specifica dell’uomo, dato che non è stata osservata in nessun altro
animale. Quindi, l’assenza di una malattia corrispondente in un animale modello ha probabilmente
fortemente rallentato la ricerca dei meccanismi molecolari che modulano la malattia.
Sebbene ci siano alcuni modelli murini che sviluppano una malattia della pelle simile alla psoriasi, un
topo modello che presenti tutti gli aspetti della psoriasi dell’uomo non è stato ancora generato.
E’ noto da molto tempo che questa patologia è sostenuta da fattori genetici, ma solo recentemente è
stato dimostrato che mutazioni nel gene CARMA2 causano la malattia in maniena dominante e con
un’alta penetranza. Mutazioni nel gene CARMA2 sono state anche trovate in famiglie affette pityriasis
rubra pilaris familiare, un disordine della pelle fenotipicamente relazionato alla psoriasi.
Da un punto di vista funzionale, le proteine CARMA sono coinvolte nella regolazione dell’attivazione
di NF-kB, una proteina che gioca un ruolo centrale nel controllo della risposta immunitaria ed
infiammatoria.
Tutti questi dati indicano che il gene CARMA2 rappresenta un interessante target molecolare per il
trattamento della psoriasi e/o di altre patologie infiammatorie derivate da una risposta infiammatoria
deregolata.
Nel seguente progetto, ci siamo proposti di:
1) Generare 3 linee murine geneticamente modificate che esprimano, in maniera condizionale, la
forma wild type e due forme mutanti di CARMA2, che, da dati di letteratura, sono note essere
tra le forme mutanti più attivanti1, 2;
2) Caratterizzare i meccanismi molecolari mediante cui è regolata l’attività di Carma2
Risultati
I passaggi fondamentali per la generazione di un topo knock-in condizionale sono essenzialmente tre:
Creazione di un “targeting vector”, contenente la modifica che si desidera apportare nel topo,
fiancheggiata da due braccia di omologia, che hanno il compito di mediare la ricombinazione
omologa nelle cellule staminali (ES), ed un gene che codifichi per la resistenza ad un
antibiotico, che permetterà di selezionare solo le cellule in cui il costrutto si è integrato;
Elettroporazione nelle cellule ES murine del targeting vector e screening dei cloni in cui è
avvenuta una corretta ricombinazione omologa;
Microiniezione in blastocisti di topo dei cloni ES contenenti la modifica per generare i topi
geneticamente modificati.
Per rendere condizionale l’espressione del nostro gene è stato usato il sistema Cre-Lox, che si asa
sulla capacità dell'enzima “cyclization recom inase” (CRE) del atteriofago P1 di catalizzare un evento
di ricombinazione tra coppie di siti LoxP. Nel nostro caso in sistema Cre-Lox è stato utilizzato per la
rimozione di un segnale di stop (SV40 PolyA) che indurrà l’espressione del gene di interesse
CARMA2.
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La strategia di targeting realizzata in questo progetto, si basa sull'inserimento delle sequenze codificanti
CARMA2sh all’interno del locus di ROSA26, che è ampiamente utilizzato per ottenere espressione
ubiquitaria nel topo. Il targeting nel locus di ROSA26 viene generalmente realizzato introducendo il
gene voluto (in questo caso, CARMA2sh, e due isoforme mutanti riportate in letteratura: E138A e
E142G) nel primo introne del locus. Il locus ROSA26 modificato è stato disegnato in modo da avere il
gene di interesse preceduto da un segnale di stop fiancheggiato da due siti LoxP. Il locus modificato
può essere trasmesso nella linea germinale, generando cos topi che hanno il gene di interesse integrato
sotto il controllo del promotore di ROSA26 ma non espresso per la presenza del segnale di stop. Topi
contenenti il gene in tal modo modificato saranno poi incrociati con topi che esprimono la Cre
ricombinasi nel tessuto desiderato, che rimuovendo il segnale di stop generano una espressione
inducibile del gene.
Generazione dei vettori targeting dei knock-in per i geni CARD2sh e i mutanti E138A/E142G
Per generare il nostro costrutto è stato utilizzato un targeting vector che comprende le braccia di
ricombinazione specifiche per il locus ROSA26 al 5’ e 3’ (rispettivamente di 3k e 10k ), con una
cassetta di selezione (sequenze codificante per resistenza alle neomicina senza promotore)
fiancheggiata da due siti FRT. Sono presenti inoltre segnali tripli di poliadenilazione fiancheggiati da
due siti LoxP. La sequenza del gene CARMA2sh e delle isoforme mutate è stata inserita nel vettore
tramite digestione con enzimi di restrizione presenti nel vettore e che sono stati incorporati per PCR
all’estremità della CDS da inserire (Fig. 1).
Figura 1
Targeting vector utilizzato per l’inserimento della sequenza codificante per CARMA2sh attraverso la
ricombinazione omologa con il locus WT di ROSA26.
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Per verificare la corretta generazione del targeting vector, sono stati fatti due tipi di controlli. Per
prima, il vettore è stato digerito con enzimi di restrizione per confermare lo struttura generale del
costrutto (Fig. 2)
Figure 2
Il targetting vector per i tre costrutti (CARMA2sh-wt, CARMA2sh-E138A, e CARMA2sh-E142G)
viene controllato per verificare la corretta composizione utilizzando gli enzimi di restrizione indicati.
Successivamente, sono state amplificate tramite PCR le regioni fra il vettore e la sequenza inserita, per
verificare che la sequenze siano state inserite in maniera corretta (Fig. 3)
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Figura 3
Verifica del targeting vector tramite PCR con coppia di oligonucleotidi specifica per il vettore (FWD1
e REV2) e il specifica per la CDS di CARMA2sh (FWD2 e REV1).
I costrutti sono stati elettroporati nelle cellule ES murine del ceppo Sv129. Per selezionare le colonie
positive è stata sfruttata la resistenza alla Neomicina. Solo le cellule dove è avvenuto un evento
ricombinazione, e che quindi esprimono il gene Neo, sopravvivono alla presenza dell’anti iotico. Per
discriminare tra i cloni nei quali è avvenuta la ricombinazione omologa rispetto a quelli che hanno
avuto un’integrazione aspecifica, sono stati messi a punto screening sia per PCR che per Southern Blot.
Per lo screening mediante PCR un primer specifico localizzato nel locus ROSA26 viene usato insieme
con un primer specifico del targeting vector; solo nei cloni dove la ricombinazione è avvenuta in modo
omologo il DNA verrà amplificato (Fig. 4).
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Figura 4
L’Integrazione del targeteting vector nelle ES è stata verificata tramite PCR utilizzandoun oligo interno
al vettore (internal primer) ed uno sul locus ROSA26 locus (external primer).
In più, i cloni risultati positivi per PCR vengono confermati tramite Southern Blot, utilizzando una
probe marcata con digossigenina sul braccio di omologia al 5’ e digerendo il DNA genomico con
EcoRV. Nelle cellule con la corretta ricombinazione, saranno presenti due bande, una corrispondente al
locus WT di circa 10kb, e un’altra che corrisponde all’allele ricom inante di circa 4kb (Fig. 5).
Figura 5
Analisi mediante Southern blot dei cloni positivi alla PCR.
Gli step successivi per ottenere i topi knock-in per CARMA2sh e le due isoforme mutanti sono stati
quelli di utilizzare le cellule ES modificate, risultate positive sia per PCR che per Souther Blot, per la
microiniezione nelle blastocisti murine. Le blastocisti sono state impiantate in femmine pseudo-gravide
che, portando a termine la gravidanza, hanno dato vita ai topi chimerici. Questi ultimi sono stati, infine,
incrociati con topi wild-type per ottenere la linea germinale (Fig. 6).
Ad oggi è stata ottenuta trasmissione in germ line per solo una delle tre linee da generare.
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Figura 6
Tutte le attività descritte sono state svolte a Biogem, sito in Ariano Irpino, un istituto di ricerca le cui
attività di ricerca sono incentrate sullo studio di geni e meccanismi coinvolti in gravi e diffuse patologie
umane utilizzando modelli animali, con l’o iettivo finale di contri uire ad individuare e realizzare
nuovi strumenti diagnostici e terapeutici.
1. Jordan et al., 2012. PSORS2 Is Due to Mutations in CARD14. The American Journal of Human
Genetics;
2. Jordan et al., 2012. Rare and Common Variants in CARD14, Encoding an Epidermal Regulator of
NF-kappaB, in Psoriasis. The American Journal of Human Genetic.
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