Tecniche di
Virologia
Prof. Amato
Definizioni:
Il sistema emolitico (S.E.) è formato da globuli rossi di montone più emolisina. E’ un
sistema immune (antigene + anticorpo) usato in analisi indiretta e il suo funzionamento
si può riassumere dicendo che se c’è l’immunocomplesso un nuovo sistema immune che
è composto da GR + emolisina colora il risultato. L’emolisina è un anticorpo che non è
capace di rompere i globuli rossi da se. C’è bisogno infatti della partecipazione del
complemento che è una proteina termolabile. Questo sistema viene impiegato nel test
di fissazione del complemento.
La fissazione del complemento (F.C.) è una tecnica applicata alla diagnosi indiretta.
In questo test 1 unità emolitica (U.E.) è la più alta diluizione di emolisina in grado di
produrre emolisi dopo 30’ a 37°C.
La diagnosi virologica diretta può essere conseguita mediante tecniche di isolamento
ed identificazione in colture cellulari.
Nel test dell’emoagglutinazione (H.A.) l’unità emoagglutinante indica la più alta
diluizione di emoagglutinina in grado di agglutinare emazia specifiche.
L’effetto citopatico (C.P.E.) in una coltura cellulare indica la presenza di un virus.
La TCIDD50 indica la dose infettante il 50% delle colture cellulari.
Nell’analisi diretta andiamo a individuare l’eventuale presenza del virus tramite
isolamento di esso da prelievi su colture cellulari. Ogni virus ha particolari esigenze
per quanto riguarda la sua coltivazione in determinate colture.
Pcr: con questa tecnica non vado ad isolare il virus ma vado a vedere se c’è il suo
menoma nel materiale di partenza.
Quando faccio un analisi indiretta ho bisogno necessariamente di 2 campioni, uno
prelevato ora e l’altro prelevato dopo un mese. Faccio un test e vado a vedere quanti
anticorpi specifici vi sono nei 2 campioni. Il test che utilizzeremo potrà essere uno tra
Fissazione del complemento, elisa, immunofluorescenza, inibizione
dell’emoagglutinazione o la sieroneutralizzazione. Se vi è una quantità uguale nei due
campioni allora c’è stata un infezione di quel virus ma in un tempo passato. Se invece vi
è un numero più alto ma uguale vuol dire che c’è stato un infezione recente. Nel caso
invece che vi è nel secondo campione una quantità di anticorpi 4 volte superiore allora
vi è una diagnosi positiva, il soggetto è affetto dal virus quindi. I test più usati
comunque sono il test elisa e l’immunofluorescenza indiretta.
Analisi
Diretta
PCR
Isolamento
Tipidi colture
Indiretta
Fissazione del complemento, elisa, immunofluorescenza, inibizione
dell’emoagglutinazione o la sieroneutralizzazione
Nel campo delle analisi la scelta degli strumenti più idonei è fondamentale e serve per
dare una risposta più possibile veritiera.
Il virus della rosolia produce una agglutinina, una proteina cioè che è capace di
agglutinare le emazia, in particolar modo quelle di piccione, oca o umane del gruppo O.
E’ visibile col test dell’inibizione dell’emoagglutinazione. L’emoagglutinina mette in
evidenza gli anticorpi di tipo G.
Le IgG permangono nel tempo mentre le IgM se non vi è più infezione del virus
scompaiono. La fissazione del complemento cerca le IgM. Precisamente ha bisogno di 1
IgM o di 3 IgG, quindi risulta più utile per rilevare le IgM.
Quindi i test per la ricerca del virus della rosolia risulteranno:
- fissazione del complemento : Negativa
Sieroneutralizzazione: il virus non da effetti in coltura
Test elisa o inib. dell’emoagglutinzione: li posso usare perché cercano le IgG.
Test della Fissazione del Complemento
In questo test il compione dopo il trattamento avrà due possibilità:
- LISI (assenza di anticorpi)
- NON LISI (presenza di anticorpi)
Mi servono per questo test il siero in cui vado a cercare gli anticorpi, l’antigene verso
cui cerco l’anticorpo, il complemento. Faccio un mix siero e antigene e se nel siero vi
saranno anticorpi si formerà l’immunocomplesso, esso è capace di fissare il
complemento. Per vedere se si son legati tutti e tre metto un altro sistema immune,
che si chiama sistema emolitico o sistema rivelatore. HO una componente in esso
solida (GR) e antiGR chiamata emolisina. Dal comportamento di questo io determino
cosa è successo prima, poiché esso si lega al complemento. Questo poi deve essere in
quantità precisa perché se ve ne fosse troppo avremmo falsi positivi, se ve ne fosse
troppo avremmo falsi negativi.
Bisogna titolarlo: 1 unità di C ( massima diluizione che è capace di determinare la lisi
del sistema emolitico). Prima di mettere a contatto coll’ Antigene complemento e
sistema rivelatore devo preparare il SE (sapendo quanti milioni di GR ho che
determino con camera di Burcher, metto un numero uguale di emolisine).
FC: porzione capace di catturare il complemento e si attiva quando esso forma
l’immunocomplesso con l’antigene. Per la preparazione del complemento faccio diluizioni
seriali (scalari). Vado a vedere la più alta diluizione del siero che fa evitare l’emolisi.
