PRODA
Istituto di Diagnostica Clinica
Sezione di Citogenetica e Genetica Molecolare
Responsabile Dott Guglielmo Sabbadini
Specialista in Genetica Medica
Caratterizzazione molecolare delle Distrofie Muscolari di Duchenne (DMD) e
di Becker (BMD): diagnosi di malattia e studi familari
L’Istituto di Diagnostica Clinica Proda esegue le indagini molecolari per le Distrofie muscolari
di Duchenne (DMD) e di Becker (BMD), finalizzate alla:
1. Diagnosi di malattia
2. Diagnosi di portatrice
3. Diagnosi prenatale per le gravidanze a rischio.
Le distrofie muscolari di Duchenne (DMD) e di Becker (BMD - variante allelica benigna) sono
malattie degenerative della muscolatura scheletrica ad eredità recessiva legata al sesso: gli
individui maschi che ereditano il cromosoma X affetto, manifestano sintomi clinici, mentre le
femmine sono eterozigoti portatrici (asintomatiche almeno nel 90% dei casi).
Il gene responsabile della patologia è localizzato nel braccio corto del cromosoma X (regione
Xp21): è un gene molto grande che si estende per circa 2.500 kb con un’organizzazione molto
complessa di 79 esoni -introni. Il suo prodotto proteico è una proteina strutturale del muscolo: la
distrofina. Questa proteina, ad alto peso molecolare (427 kDA) è generalmente assente nel
muscolo dei soggetti DMD ed è invece presente ma alterata sia a livello qualitativo che
quantitativo, nel muscolo dei soggetti BMD.
La mutazione più frequente (65-70%), responsabile di entrambi i quadri clinici, è la delezione
intragenica di tratti più o meno estesi di DNA (da decine di bp a centinaia di kb), che comporta
la perdita di un numero variabile di esoni. Nella forma clinicamente più grave, la DMD, le
delezioni causano uno slittamento del modulo di lettura, per cui la distrofina non viene prodotta
o viene rapidamente degradata; nella BMD, al contrario, le delezioni mantengono il modulo di
lettura consentendo la produzione di una proteina più corta, ma semifunzionale.
Il rimanente 30-35% dei casi è dovuto a mutazioni diverse dalla delezione: in particolare il 5%
circa è dovuto a duplicazioni di regioni intrageniche mentre l’altro 25-30% è causato da
mutazioni puntiformi, piccole delezioni o inserzioni non identificabili con i metodi diagnostici
comunemente utilizzati, a causa delle enormi dimensioni del gene.
Da qualche anno le delezioni possono essere identificate nei soggetti affetti, sia per mezzo
dell’amplificazione simultanea di numerosi esoni del gene della distrofina con oligonucleotidiprimers specifici (Multiplex PCR), sia per mezzo di Southern Blot e ibridazione con varie sonde
di cDNA che coprono l’intera lunghezza (14 kb) dell’ RNA messaggero della distrofina.
Se nell’individuo certamente affetto non viene riscontrata la delezione (come succede nel 3035% dei casi), si può comunque effettuare la diagnosi di malattia con l’uso di marcatori
polimorfici intragenici che permettono una diagnosi indiretta di DMD/BMD attraverso
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l’identificazione dell’aplotipo associato alla malattia da utilizzare per lo studio familiare. In
questi casi, per poter effettuare lo studio familiare, la diagnosi di malattia deve essere
preventivamente confermata mediante biopsia muscolare e lo studio immunocitochimico.
L’analisi del DNA in queste patologie assume quindi una notevole importanza diagnostica e si
affianca ai rilievi immunoistochimici biochimici e clinico-genealogici.
L’analisi molecolare risulta inoltre fondamentale per la corretta diagnosi (od esclusione) dello
stato di portatrice di Distrofia muscolare DMD/BMD, per la quale i test biochimici tradizionali
(in particolare dosaggio delle Creatinkinasi seriche) hanno un valore limitato.
La diagnosi molecolare di portatrice può essere effettuata quando sia presente un caso di malattia
nella famiglia che richiede l’estensione dello studio, oltre che ai soggetti affetti, agli altri
componenti del nucleo familiare. Essa si avvale di tecniche di analisi di polimorfismi intragenici
e studi di linkage, analisi quantitativa di ibridazione con sonde di cDNA, ecc.
Nelle famiglie in cui si è accertato che la malattia è dovuta a delezione del gene, la diagnosi o
l’esclusione dello stato di portatrice può arrivare ad avere un’affidabilità del 100% ; nei casi in
cui la malattia è invece dovuta a mutazione diversa dalla delezione, lo studio della segregazione
dell’aplotipo associato alla malattia, combinato con i rilievi genealogici ed enzimatici, permette
la diagnosi di portatrice con un’affidabilità variabile tra il 90 e il 99%. Questa minore affidabilità
è dovuta sia all’alto tasso di ricombinazione intragenica tra i marcatori polimorfici e la malattia
(5-12%) sia alla difficoltà di identificare le nuove mutazioni che per questo gene si ritiene siano
molto frequenti (circa 1/3).
Nelle gravidanze identificate a rischio anche la diagnosi prenatale può essere effettuata con
tecniche molecolari una volta completato lo studio in tutto il nucleo familiare. Il DNA da
analizzare viene estratto da un campione di villi coriali (CVS) prelevato alla decima settimana di
gestazione o di liquido amniotico prelevato di norma tra la sedicesima e la diciottesima settimana
di gestazione: dopo determinazione del sesso, in caso di individuo maschio viene effettuato il
test diagnostico. Anche per la diagnosi prenatale, se si tratta di un caso di malattia dovuto a
delezione, l’affidabilità del risultato è del 100%, mentre per i casi da non delezione il
ritrovamento o meno dell’aplotipo a rischio dà un risultato di affidabilità compresa tra il 90 e il
99%.
Protocollo diagnostico
L’ analisi molecolare verrà effettuata solo in quei casi in cui il medico specialista (neurologo)
abbia posto diagnosi di Distrofia muscolare DMD/BMD sulla base di dati clinico-genealogici,
biochimici ed istopatologici o abbia riscontrato nel paziente un sospetto di malattia compatibile
con una distrofinopatia eventualmente confermabile dall’indagine molecolare stessa. Nei casi da
non delezione un eventuale studio familiare può essere intrapreso solo se viene confermata la
diagnosi di malattia attraverso studi immunocitochimici su biopsia muscolare.
Lo studio genetico, sia nei soggetti affetti che nel resto del nucleo familiare, viene eseguito su
appuntamento e solo dietro presentazione di una certificazione che attesti la diagnosi o il
sospetto clinico.
Esoni amplificati
Esoni amplificati per la ricerca di eventuali delezioni intrageniche (multiplex PCR) secondo
Chamberlain et al.,1988 e Beggs et al., 1990; L’uso congiunto dei due metodi permette di
evidenziare più del 95% delle delezioni fino ad oggi individuate (coè più del 60% di tutte le
mutazioni DMD/BMB):
PM,3,4,6,8,12,13,17,19,43,44,45,47,48,50,51,52,60
In casi particolari potrebbe essere presa in considerazione l’amplificazione aggiuntiva dei
seguenti esoni : 2, 7, 21, 46, 53, 55.
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Marcatori polimorfici
Marcatori polimorfici interni e fianchreggianti il gene della distrofina (del tipo STR; CA
repeats) utilizzati per la diagnosi (od esclusione) dello stato di portatrice di DMD/BMD:
5’ DYS I (3.5kb dal promotore),*5’ DYS II (1.2Kb dal promotore),*5’ DYS III ( 1°
introne),*STR-44 ( intragenico),STR-45, STR-49,*STR-50, *3’ CACA repeat (3’ non tradotto
del gene)
Per la diagnosi dello stato di portatrice vengono utizzati un minimo di 5 marcatori (a partire da
quelli contrassegnati con l’asterisco * : uno al 5’ del gene, tre intragenici ed uno al 3’ del gene).
Il protocollo diagnostico comprende:
- Colloquio iniziale con il Medico Genetista per la raccolta dei dati anamnestici, clinici e
genealogici;
- Prelievo di 20 cc di sangue periferico da effettuarsi presso il nostro Istituto ;
- Estrazione del DNA genomico dai leucociti ;
- Amplificazione del DNA con il metodo della PCR (Polymerase Chain Reaction) con
oligonucleotidi-primers specifici per almeno 18 esoni del gene della distrofina (Chamberlain et
al.,1988;Beggs et al.,1990) per la ricerca di eventuali delezioni intrageniche;
- Visualizzazione dei frammenti amplificati con elettroforesi sul gel di agarosio con EtBr;
- Amplificazione con la tecnica della PCR con oligonucleotidi-primers specifici, del DNA di
sequenze ripetute polimorfiche interne o fiancheggianti il gene della distrofina (STR, CACA
Repeats;almeno cinque) allo scopo di identificare l’aplotipo associato alla malattia e di seguirne
la segregazione nell’intero ambito familiare. Questo approccio è valido sia per i casi di delezione
che per quelli da non delezione ed è finalizzato alla ricerca delle portatrici ed alla diagnosi
prenatale della malattia.
- Visualizzazione delle sequenze amplificate con elettroforesi su gel di poliacrilamide con EtBr.
Qualora le metodiche menzionate non fornissero dati sufficientemente informativi lo studio può
proseguire con:
- Digestione del DNA genomico con gli appropriati enzimi di restrizione;
- Elettroforesi del DNA digerito su gel di agarosio;
- Trasferimento del DNA denaturato su membrana di nylon ( Southern Blotting);
- Ibridazione della membrana con sonde specifiche di cDNA della distrofina o con sonde
genomiche polimorfiche marcate con digossigenina dUTP;
- Autoradiografia.
- Colloquio finale con il Genetista medico e consegna del referto scritto.
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Consenso informato per test diagnostico per la Distrofia Muscolare di
Duchenne/Becker su maschio affetto
A) in caso di soggetto afffetto con biopsia muscolare eseguita e quadro istopatologico
diagnostico per DMD/BMD
Il/la sottoscritto/a ........................................................................................
padre/madre
di...........................................................................................,chiede che
venga effettuato il test per la ricerca delle delezioni del gene della distrofina responsabili
della Distrofia Muscolare di Duchenne/Becher sul DNA di mio figlio.
Chiede inoltre che il risultato del test sia consegnato (barrare la modalità prescelta:
una o entrambe)
al/alla sottoscritto/a
al Dottor..............................................................................................
Il/la sottoscritto/a dichiara contestualmente di essere stato/a informato/a che il test
può fornire uno dei seguenti risultati:
- accertare la presenza di una delezione specifica ( con una probabilità del 65%
circa )
- non evidenziare la presenza di una delezione ( con una probabilità del 35% circa )
Data
Firma
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Consenso informato per test diagnostico per la Distrofia Muscolare di
Duchenne/Becker su maschio affetto
B) In caso di soggetto afffetto non sottoposto a biopsia
Il/la sottoscritto/a ........................................................................................
padre/madre
di...........................................................................................,chiede che
venga effettuato il test per la ricerca delle delezioni del gene della distrofina responsabili
della Distrofia Muscolare di Duchenne/Becher sul DNA di mio figlio.
Chiede inoltre che il risultato del test sia consegnato (barrare la modalità prescelta:
una o entrambe)
al/alla sottoscritto/a
al Dottor..............................................................................................
Il/la sottoscritto/a dichiara contestualmente di essere stato/a informato/a che il test
può fornire uno dei seguenti risultati:
- accertare la presenza di una delezione specifica che consente di confermare il
sospetto diagnostico di Distrofia Muscolare di Duchenne/Becker
- non evidenziare la presenza di una delezione specifica e quindi non confermare
il sospetto diagnostico di Distrofia Muscolare di Duchenne/Becker
Data
Firma
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Consenso informato per il test diagnostico di eterozigote (portatrice) per la Distrofia
Muscolare di Duchenne /Becker [su parente di maschio affetto con diagnosi
confermata]
La sottoscritta.........................................................................................................................
madre/sorella .............................................…….(cancellare la voci che non interessano)
di ......................................................................................................................, per il quale
è stata posta diagnosi di Distrofia Muscolare di Duchenne/Becker mediante metodi
immunoistochimici o con l’individuazione della delezione specifica, chiede che venga
effettuato il test per la diagnosi di eterozigote (portatrice) per la
Distrofia Muscolare di Duchenne/Becker sul proprio DNA.
La sottoscritta dichiara contestualmente di essere stata informata che la diagnosi
non può essere eseguita senza lo studio del DNA degli altri membri della famiglia che
verranno indicati dal responsabile della Sezione di Genetica Molecolare di questo istituto
e che lo studio familiare condotto mediante specifici marcatori può fornire uno dei
seguenti trisultati:
- accertare o escludere la condizione di eterozigote (portatrice) con una probabilità
non inferiore al 90%
- non permettere di definire la presenza/assenza della condizione di portatrice a
causa della non informatitività dei marcatori genetici della famiglia.
Data
Firma
6
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Consenso informato per lo studio familiare con marcatori molecolari associati al
gene della distrofia muscolare di Duchenne/Becker
Il/la sottoscritto/a .......................................................................................... acconsente
che venga effettuato sul proprio DNA l’analisi dei marcatori molecolari associati al gene
della Distrofia muscolare di Duchenne/Becker per la diagnosi di portatrice (eterozigote)
per la Signora .................................................
Data
Firma
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Consenso informato per test diagnostico in gravidanza, su feto maschio, per la Distrofia
muscolare di Duchenne/Becker
La sottoscritta....................................................................................................................................
chiede che venga effettuato il test per la ricerca delle delezioni del gene della distrofina responsabili della
Distrofia Muscolare di Duchenne/Becker su campione di DNA fetale estratto da liquido amniotico.
La sottoscritta dichiara contestualmente di essere stata informata che:
• Il test consiste nella amplificazione simultanea di numerosi esoni nel gene della distrofina con
oligonucleotidi primers-specifici (Multiplexs PCR, secondo Chamberlain et al., 1988 e Beggs et
al.,1990); questo metodo consente di evidenziare più del 95% delle delezioni fino ad oggi individuate
nel gene della distrofina.
• Il test permette di accertare esclusivamente la eventuale presenza di delezioni intrageniche specifiche
(le mutazioni più frequenti) in almeno 18 esoni del gene della distrofina (PM, 3, 4, 6, 8, 12, 13, 17,
19, 43, 44, 45, 47, 48, 50, 51, 52, 60); le delezioni analizzate sono responsabili del 65% circa dei casi
di DMD/BMD.
• Il test non consente di evidenziare il 30-35% dei casi DMD/BMD dovuti a mutazioni diverse dalla
delezione (duplicazioni intrageniche, mutazioni puntiformi piccole delezioni ed inserzioni non
identificabili con il presente test ma con altri metodi), o delezioni in mosaico.
• Se l’analisi del DNA con il presente test non evidenzia alcuna delezione negli esoni considerati
(negatività al test), ciò non permette di escludere che il campione di DNA fetale possa portare una
mutazione diversa dalla delezione non evidenziabile con il test effettuato.
• Sono consapevole che raramente l’analisi può fornire un risultato errato ma che, comunque, la
probabilità di un errore diagnostico è inferiore all’1%.
• Il test è effettuato solo in presenza di feto di sesso maschile.
Dati anagrafici del paziente
Cognome:
Nome:
Data e luogo di nascita
Indirizzo:
Recapito telefonico:
e-mail:
Roma,
Firma del paziente
Firma del Medico che ha raccolto il consenso
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