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Protocollo diagnostico per la caratterizzazione molecolare della Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) e di
Becker (BMD) attraverso multiplex PCR ed elettroforesi capillare
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S. Gambardella , R. Marini , R. Cascella , G. Barrano , M. Di Gregorio , A. Sabino , A.M. Nardone , A. Mesoraca , E.
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Giardina , G. Galluzzi , L. Seminara , G. Sabbadini
1
Dip. di Biomedicina e Prevenzione, Università Tor Vergata, Roma, Italia
2
Orga Bio Human srl, Roma, Italia
3
UOSD di Genetica Medica, Ospedale San Pietro Fatebenefratelli, Roma, Italia
4
Lab. di genetica molecolare UILDM Sezione Laziale - IRCSS Fondazione Santa Lucia, Roma, Italia
5
Dip. di Medicina di Laboratorio, Azienda Ospedaliera Universitaria Policlinico di Tor Vergata, Roma, Italia
6
Artemisia Medical Group, Roma, Italia
7
Istituto di diagnostica clinica PRODA, Roma, Italia
Le distrofie muscolari di Duchenne (DMD) e di Becker (BMD) sono malattie degenerative della muscolatura scheletrica
ad eredità recessiva legata al sesso. Il gene responsabile della patologia mappa sul braccio corto del cromosoma X, ed è
organizzato in 79 esoni codificanti per una proteina strutturale del muscolo, la distrofina.
La mutazione più frequente (65-70%) è la delezione intragenica di tratti più o meno estesi di DNA, mentre il rimanente
30-35% dei casi è dovuto a mutazioni diverse da delezioni.
La diagnosi molecolare DMD/BMD viene oggi effettuata utilizzando metodiche complesse, di difficile interpretazione e poco
automatizzate. Per far fronte a tale necessità abbiamo sviluppato DMD/BMD Detection kit (CE), che utilizza un protocollo
diagnostico rapido ed efficace per l’identificazione di più del 95% delle delezioni nel gene della distrofina (65% circa dei
casi di DMD/BMD).
Il test consiste nella amplificazione simultanea di 18 esoni più il promotore del gene della distrofina con primers fluorescinati
in 6’ FAM o in 5’ HEX (Chamberlain et al., 1988 e Beggs et al.,1990), con successiva separazione in elettroforesi capillare.
Per la validazione del kit è stato condotto uno studio multicentrico. Sono stati reclutati 30 pazienti con diagnosi clinica e
molecolare di DMD/BMD e 100 soggetti di controllo.
Il kit ha permesso di identificare tutti i pazienti con delezioni nei 19 esoni considerati (23 dei 30 pazienti). I restanti 7 pazienti
non caratterizzati erano portatori di mutazioni non identificabili con il kit (duplicazioni, delezioni in esoni non considerati
nel kit). Oltretutto, il kit non ha consentito di evidenziare delezioni in femmine portatrici, mostrando la sua accuratezza
diagnostica solamente in soggetti di sesso maschile.
Lo studio multicentrico ha permesso di stabilire come la sensibilità e la specificità del test sia ≥ 99,9%, ed ha dimostrato che
il kit, considerate attentamente le sue prestazioni ed i suoi limiti, è in grado di evidenziare il 95% delle delezioni osservate
in pazienti DMD/BMD.
Pertanto, il kit può essere utilizzato, in sinergia con altre metodiche, per la diagnosi molecolare di DMD e BMD.
