Il ruolo del sistema maggiore di
istocompatibilità:
dal laboratorio alla clinica
Marco Andreani
LIBT - Roma
• Genetica e funzione del sistema maggiore di istocompatibilità
• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni
• Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche
Variabilità nella Genetica Umana
Cosa ci rende unici
La variabilità inter-individuale in 3 miliardi di
bp nel genoma umano è dello 0.5%
Variabilità nella Genetica Umana
Cosa ci rende unici
Single Nucleotide Polymorphisms (SNP)
Copy Number Variations (CNV)
• 0.1% of inter-individual variability
• 30 x 106 SNP are known
• 1% are functional (3x105)
• 0.4% of inter-individual variability
• Insertion, Deletion, Inversion, Duplication
Sistemi genetici polimorfici
Ruolo Biologico e Clinico
Polimorfismo
Rilevanza Biologica
Rilevanza Clinica
Geni HLA class I e II
classici
• Presentazione dell’antigene
• Alloreattività
• Immunità Innata
• Evoluzione
• Trapianti
• Autoimmunità
• Malattie Infettive
• Gravidanza
Geni HLA non classici
(HLA-G)
Tolleranza Immunologica
• Trapianti
• Gravidanza
Antigeni Minori di
Istocompatibilità
Alloreattività
• Trapianti
• Gravidanza
Natural Killer Receptors
(KIR)
Immunità Innata
• Trapianti
• Malattie Infettive
Geni delle citochine e dei
loro recettori
Risposta Immunitaria
• Trapianti
• Autoimmunità
• Malattie Infettive
Gruppi sanguigni
Immunità Naturale
• Medicina Trasfusionale
Molecole di Adesione
(CTLA-4)
Risposta Immunitaria
• Trapianti
• Autoimmunità
• Malattie Infettive
Altri (PTX3, PTTN2, etc.)
• Attivazione cellulare
• Trasduzione del Segnale
• Autoimmunità
• Malattie Infettive
• Genetica e funzione del sistema maggiore di istocompatibilità
• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni
• Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche
Regione HLA
HLA di Classe I (A,B C)
HLA di Classe II (DR, DQ, DP)
Cromosoma 6
Insieme di proteine di membrana che
consente ai linfociti di riconoscere le cellule
come proprie (self) oppure come estranee
HLA Classe I (A, B, C)
Location of amino acid variability that results in
multiple different HLA class I molecules
Leader
Exon 1
α1
α2
Exon 2
α3
Exon 3
Exon 4
HLA Classe II (DRB1, DQB1, DPB1)
Location of amino acid variability that results in
multiple different HLA class II molecules
Leader
Exon 1
β1/α1
β2/α2
Exon 2
Exon 3
Processazione e presentazione dell’antigene
Insieme dei processi che hanno come risultato:
Antigeni endogeni
per HLA classe I
Antigeni esogeni
per HLA classe II
• frammentazione delle proteine antigeniche
• associazione dei frammenti proteici (peptidi) alle molecole MHC
• trasporto del complesso peptide-MHC sulla superficie cellulare dove può
essere riconosciuto dal recettore dei linfociti
Presentazione dell’antigene da parte
di molecole HLA
Riconoscimento diretto e indiretto
Antigen Presentation
Maturazione ed espansione
delle cellule T
Attivazione delle cellule B
Interazione tra HLA e cellule NK
Caratteristica del sitema HLA
Diversità allelica
Sequenze di alcuni alleli HLA*A
Annual Increase of the Number of HLA Antigens/Alleles
http://hla.alleles.org/inc/images/graph_hires.png
Per contrastare la flessibilità degli
agenti patogeni
Obiettivo: protezione della popolazione dall’estinzione,
utilizzando due strategie:
Più di un tipo di molecola
MHC in ciascun individuo
Sistema POLIGENICO
Estese differenze nelle
molecole HLA tra individui
Sistema POLIMORFICO
Difference from class I HLA molecule
The classical HLA class Ia molecules are highly polymorphic
HLA-A10
HLA-B12
HLA-Cw5
HLA-A3
HLA-B5
HLA-Cw7
HLA-A23
HLA-B12
HLA-Cw1
HLA-A11
HLA-B16
HLA-Cw8
HLA-A25
HLA-B40
HLA-Cw2
HLA-A26
HLA-B8
HLA-Cw5
HLA-A2
HLA-B27
HLA-Cw6
HLA-A28
HLA-B17
HLA-Cw5
HLA-A19
HLA-B14
HLA-Cw8
HLA-A19
HLA-B15
HLA-Cw2
HLA-A25
HLA-B12
HLA-Cw1
HLA-A24
HLA-B8
HLA-Cw4
• Genetica e funzione del sistema maggiore di istocompatibilità
• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni
• Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche
• Genetica e funzione del sistema maggiore di istocompatibilità
• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni
• Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche
Variazioni HLA nelle popolazioni
L’alto grado del polimorfismo del sistema HLA
fornisce strumenti per lo studio della diversità
nelle varie popolazioni:
•
•
•
•
•
Storia
Migrazioni
Evoluzione
Genetica
Suscettibilità o resistenza alle malattie
Variazioni HLA nelle popolazioni
The Hardy-Weinberg Equilibrium
Utilizzarono l’algebra per spiegare come le frequenze alleliche
possono predire le frequenze genotipiche e fenotipiche
Una popolazione resta in equilibrio solo se in essa si verificano alcune
condizioni restrittive:
• non devono verificarsi mutazioni
• non deve verificarsi una migrazione netta di alleli verso l´interno
della popolazione (immigrazione) o verso l´esterno (emigrazione)
• la popolazione deve essere ampia (teoricamente infinita)
• non si deve verificare selezione naturale, vale a dire tutti i genotipi
devono possedere le stesse capacità adattative e riproduttive
Two Allele Model
Alleles
Frequency
A
a
B
b
Phenotypes
Frequency
A
a*a
AB
2*a*b
B
b*b
A
B
A
a*a
a*b
B
a*b
b*b
Formularono indipendentemente questa
formula matematica
Software packages
•
•
•
•
•
Arlequin
Gene[rate]
Pypop
http://hla-net.eu
www.allelefrequencies.net
HLA population data storage and analysis
• Software should be able to handle ambiguous data,
e.g. Gene[rate]
Variazioni HLA nelle popolazioni
Progetto IME
Formidabile opportunità di studio
Possibilità di studio della segregazione aplotipica in
quanto disponiamo di dati relativi all’intera famiglia
Variazioni HLA nelle popolazioni
Variazioni HLA nelle popolazioni
Confronto tra la frequenza dell’allele
HLA-B*53 in diverse popolazioni
SYRIA
IRAQI KURDISTAN
NIGERIA
0.61%
2.1%
16.9%
Global Distribution of Frequent African
HLA-B Alleles
Image from Solberg et al.(2008) see www.pypop.org/popdata for more info
Variazioni HLA nelle popolazioni
Uno studio su bambini in Africa condotto da Hill A (Nature
1991) ha mostrato che gli alleli
HLA-B53
DRB1*1302-DQB1*0501
erano più frequenti in popolazioni provenienti dall’Africa
Occidentale rispetto a quanto osservato in altri etnie;
variabili indipendentemente associate alla protezione nei
confronti della Malaria
Variazioni HLA nelle popolazioni
0
*07
*08
*13
*14
*15
*18
*27
*35
*37
0,05
0,1
0,15
0,2
NIGERIA
HLA-B Frequency
0,25
Entrambi questi alleli sono
frequenti nella popolazione
Nigeriana
*38
*39
*40
*41
*42
*44
*45
NIGERIA
HLA-DRB1 Frequency
*46
*47
0
*48
*49
*50
*51
*52
*53
*54
*55
*56
*57
*58
*59
*67
*73
*78
*81
*82
*83
*01
*15
*16
*03
*04
*11
*12
*13
*14
*07
*08
*09
*10
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
• Genetica e funzione del sistema maggiore di istocompatibilità
• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni
• Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche
Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali
emopoietiche
Il laboratorio di Immunogenetica ha il compito di individuare un
donatore HLA compatibile per un paziente proposto al trapianto
Mother
Father
HLA-A: 01:01 29:01
HLA-A: 02:05 03:01
HLA-B: 08:01 35:03
HLA-B: 08:01 40:01
HLA-Cw: 07:01 04:01
HLA-Cw: 03:03 07:02
HLA-DRB1*: 07:01 03:01
HLA-DRB1*: 13:01 08:01
HLA-DQA1*: 02:01 05:01
HLA-DQA1*: 01:03 04:01
HLA-DQB1*: 03:03 02:01
HLA-DQB1*: 06:03 04:02
HLA-DPB1*: 09:01 04:01
HLA-DPB1*: 04:01 15:01
1
2
Child 1
3
Tipizzazione HLA ad alta
risoluzione di una famiglia
dove è possibile evidenziare
la segregazione aplotipica
4
Child 2
Child 3
Child 4
HLA-A: 29:01 03:01
HLA-A: 01:01 03:01
HLA-A: 29:01 03:01
HLA-A: 01:01 02:05
HLA-B: 35:03 40:01
HLA-B: 08:01 40:01
HLA-B: 35:03 40:01
HLA-B: 08:01 08:01
HLA-Cw: 04:01 07:02
HLA-Cw: 07:01 07:02
HLA-Cw: 04:01 07:02
HLA-Cw: 07:01 03:03
HLA-DRB1*: 03:01 08:01
HLA-DRB1*: 07:01 08:01
HLA-DRB1*: 03:01 08:01
HLA-DRB1*: 07:01 13:01
HLA-DQA1*: 05:01 04:01
HLA-DQA1*: 02:01 04:01 HLA-DQA1*: 05:01 04:01 HLA-DQA1*: 02:01 01:03
HLA-DQB1*: 02:01 04:02
HLA-DQB1*: 03:03 04:02
HLA-DQB1*: 02:01 04:02
HLA-DQB1*: 03:03 06:03
HLA-DPB1*: 04:01 15:01
HLA-DPB1*: 09:01 15:01
HLA-DPB1*: 04:01 15:01
HLA-DPB1*: 09:01 04:01
2
4
1
4
2
4
1
3
Ambiguità
Alleliche
Genotipiche
Ambiguità
Alleliche : Dovute a polimorfismi che si
trovano fuori della regione analizzata
HLA ambiguity results from the amplification and Sanger
sequencing based typing (SBT) of partial genes
Allele ambiguity
A*01:01:01:01 vs A*01:01:01:02N (Intron 2)
Exon 2
•DRB1*12:01 vs DRB1*12:06 (Exon 3)
Intron 2
Ambiguità
Genotipiche: Dovute a combinazioni uguali
di alleli diversi (cis-trans) in campioni
eterozigoti
HLA ambiguity results from heterozygous
sequencing by Sanger SBT
Genotype ambiguity - results from an inability to establish phase (cis/trans
ambiguity) between closely linked polymorphisms identified by the typing system
A*01:01:01:01+24:02:01:01 ------------- Y-------Y----- -------------R- ------Y------ -------------MS
A*01:14 + 24:46
------------- Y-------Y----- -------------R- ------Y------ -------------MS
A*24:02:01:01
A*24:46
-------------- C------T------ ------------A- ------C------ ------------AC
-------------- C------T------ ------------A- ------C------ ------------CG
Sample:
Reference:
702-11T
IMGT/B 3.3.0 2011-01-14
Summary
The allele pairs listed below are compatible with the consensus sequence.
B*18:01:01
B*18:01:01
B*18:01:01
B*18:09
B*18:12
B*18:17N
B*18:17N
B*18:17N
B*18:20
B*18:43
B*44:02:01:01
B*44:02:01:02S
B*44:19N
Exon 1
B*44:09
Exon 2
B*44:12
Exon 2
B*44:02:01:01 Exon 1
B*44:02:01:02SExon 1
B*44:19N
Exon 1
B*44:51
Exon 3
B*44:55
Exon 2
Ambiguità Genotipiche o Cis/Trans
The discovery of new HLA alleles has resulted in an
increase in heterozygous allele combinations that are
identical in the commonly sequenced regions
Allele
Allele 11
A*02010101
A*0201
A*02:01:01:01
A*0226
A*02:26
A*0234
A*02:34
A*02010101
A*02:01:01:01
A*02010102L
A*02:01:01:02L
A*02010102L
A*02:01:01:02L
A*02010101
A*02:01:01:01
A*02010102L
A*02:01:01:02L
A*0224
A*02:24:01
A*0290
A*02:90
A*02010103
A*02:01:01:03
A*02010103
A*02:01:01:03
A*02010103
A*02:01:01:03
A*020102
A*02:01:02
A*0323
A*03:23:01
A*02:01:52
A*02:35:01
A*02:237
Allele
Allele 22
A*03010101
A*0301
A*03:01:01:01
A*0307
A*03:07
A*0308
A*03:08
A*03010102N
A*03:01:01:02N
A*03010101
A*03:01:01:01
A*03010102N
A*03:01:01:02N
A*03010103
A*03:01:01:03
A*03010103
A*03:01:01:03
A*0317
A*03:17
A*0309
A*03:09
A*03010101
A*03:01:01:01
A*03010102N
A*03:01:01:02N
A*03010103
A*03:01:01:03
A*030112
A*03:01:12
A*9295
A*02:195
A*03:01:03
A*03:108
A*03:05
Year
2000
2005
2010
2011
IMGT Release
1.5
2.8
2.28
3.3.0
Year
2013
IMGT Release
3.9.01
550 combinations
(ex2+3)
20 combinations
(ex2-4)
Compatibilità HLA e Trapianto di CSA
Ambiguità Genotipiche attese
in base alla frequenza allelica
•
•
•
•
•
•
HLA-A:
HLA-B:
HLA-C:
HLA-DPB1:
HLA-DQB1:
HLA-DRB1:
62 %
58 %
58 %
56 %
25 %
60 %
Compatibilità HLA e Trapianto di CSA
Compatibilità HLA e Trapianto di CSA
The
updated
CWD
catalogue
designates 1122 alleles at
the HLA-A, -B, -C, -DRB1, DRB3/4/5, -DQA1, -DQB1, -DPA1
and -DPB1 loci as being CWD, and
represents 14.3% of the HLA
alleles in IMGT/HLA Database
release 3.9.0.
In particular, we identified 415 of
these alleles as being ‘common’
(having known frequencies) and
707
as being ‘well-documented’
on the basis of ̃140,000 sequencebased typing observations and
available HLA haplotype data.
Nuove tecnologie
Luminex 500 beads
Next Generation Sequencing
ILLUMINA
SEQUENZIAMENTO
PER SINTESI
THERMO FISHER
ION TORRENT
ION SEMICONDUCTOR
SEQUENCING
Compatibilità HLA e Trapianto di CSA
Rilevanza della compatibilità HLA
Rilevanza della compatibilità HLA
3857 MUD Tx from unrelated adult volunteer donors
Early Stage
Intermediate Stage
Late Stage
P<0.001
P<0.001
P=0.02
(Lee, Blood 2007)
Rilevanza della compatibilità HLA
3857 MUD Tx from unrelated adult volunteer donors
Early Stage
Intermediate Stage
Late Stage
P<0.001
P<0.001
P=0.02
(Lee, Blood 2007)
Rilevanza della compatibilità HLA
3857 MUD Tx from unrelated adult volunteer donors
Early Stage
Intermediate Stage
Late Stage
P<0.001
P<0.001
P=0.02
(Lee, Blood 2007)
Rilevanza della compatibilità HLA
Immunol Res (2008) 41:56–78
Genetics of allogeneic hematopoietic cell transplantation. Role of HLA matching, functional
variation in immune response genes
John A. Hansen Æ Effie W. Petersdorf Æ Ming-Tseh Lin Æ Steven Wang Æ Jason W. Chien Æ Barry
Storer Æ Paul J. Martin
Rilevanza della compatibilità HLA
Immunol Res (2008) 41:56–78
Genetics of allogeneic hematopoietic cell transplantation. Role of HLA matching, functional
variation in immune response genes
John A. Hansen Æ Effie W. Petersdorf Æ Ming-Tseh Lin Æ Steven Wang Æ Jason W. Chien Æ Barry
Storer Æ Paul J. Martin
T Cell Epitope Matching in Unrelated HSCT
Structural versus Functional
Structural Matching
Functional Matching
TCR / MHC
• Nucleotide Sequencing
• Shared T cell epitopes (TCE)
• Allelic Matching or Disparity
• TCE matching or disparity
• Sequence Identity for A,B,C,DRB1 (8/8)
• Functional Identity for TCE groups
• Classical Approach for SCT
• In use for Solid Organ TX
• Innovative for SCT
Rilevanza della compatibilità HLA
Combinazioni
alleliche permissive
Combinazioni alleliche permissive
Kawase, Blood, 2007 - October 1:110(7)
Combinazioni alleliche permissive
Identification of a permissible HLA mismatch in
hematopoietic stem cell transplantation
Marcelo A. Fernandez-Viña et al.
Key Points
Mismatches in alleles C*03:03/C*03:04 were most frequent (68.7%)
among the transplants with a single allele level mismatch in HLA-C
The 7/8 C*03:03/C*03:04 mismatch group was not significantly different
from the 8/8 HLA matched transplants in any transplant outcome.
Blood ; 2014 Feb 20: 123(8)
Combinazioni alleliche permissive
Impatto del DPB1
sul trapianto di cellule staminali
ematopoietiche
Combinazioni alleliche permissive
TCE3 Grouping
Others
The Algorithm: 60% permissive
40% non-perm.
Zino, Blood 2004
The DPB TCE Webtool
Anthony Nolan Registry
Analisi retrospettiva su 5428 UD-HSCT (10/10)
NRM
Non-permissive
TCE Mismatch
DPB1 Allele
Mismatched
Permissive
TCE Match
Allelic DPB1 Match
Fleishhauer Lancet Oncol 2012:13(4): 366-74
Compatibilità DPB1 e andamento del
trapianto di CSE nella talassemia
La compatibilità HLA è certamente rilevante per il
successo di un trapianto, ma non è tutto…!
La compatibilità HLA è certamente rilevante per il
successo di un trapianto, ma non è tutto…!
Polimorfismo
Rilevanza Biologica
Rilevanza Clinica
Geni HLA class I e II classici
• Presentazione dell’antigene
• Alloreattività
• Immunità Innata
• Evoluzione
• Trapianti
• Autoimmunità
• Malattie Infettive
• Gravidanza
Geni HLA non classici
(HLA-G)
Tolleranza Immunologica
• Trapianti
• Gravidanza
Antigeni Minori di
Istocompatibilità
Alloreattività
• Trapianti
• Gravidanza
Natural Killer
Receptors (KIR)
Immunità Innata
• Trapianti
• Malattie Infettive
Geni delle citochine
e dei loro recettori
Risposta Immunitaria
• Trapianti
• Autoimmunità
• Malattie Infettive
Gruppi sanguigni
Immunità Naturale
• Medicina Trasfusionale
Molecole di Adesione
(CTLA-4)
Risposta Immunitaria
• Trapianti
• Autoimmunità
• Malattie Infettive
Altri (PTX3, PTTN2, etc.)
• Attivazione cellulare
• Trasduzione del Segnale
• Autoimmunità
• Malattie Infettive
La compatibilità HLA è certamente rilevante per il
successo di un trapianto, ma non è tutto…!
Quante variabili genetiche si evidenziano
sequenziando con NGS le 3.5x106 bp della
regione MHC di un paziente e di un suo
potenziale MUD HLA 10/10 compatible..?
3025 posizioni diverse (patziente vs. donatore)
• 1492 in regioni intergeniche
• 1173 in introni
• 360 in esoni (59 genes)
Pröll et al. DNA Res. 2011; 18: 201
GENOME WIDE ANALYSIS SNP genotyping
Affimetrix Genome-wide, Human SNP 6.0 array
22
21
20
19
18
17
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
Allele BAT3
Allele BAT2
BAT2/BAT3
Haplotypes
AC
9/30 (30.0)
5/190 (2.6)
1.15 x10-8
0.007
GC
0/30 (0.0)
1/190 (0.50)
0.690
1.000
GT
21/30 (70.0)
184/190 (96.8) 5.94 x10-8
0.037
La compatibilità HLA è certamente rilevante per il
successo di un trapianto, ma non è tutto…!
Trapianto da donatore correlato HLA identico
Trapianto da donatore non correlato HLA identico
Trapianto da donatore correlato aploidentico
Utilizzo di cellule T regolatorie
Utilizzo di nuovi protocolli di condizionamento
Take Home messages
L’impatto della compatibilità HLA sull’andamento del trapianto resta
un elemento di grande rilevanza, anche se diversi elementi, come ad
esempio la progressione della malattia, devono essere considerati
nella scelta della strategia trapiantologica
E’ già possibile definire una compatibilità permissiva, attraverso il
concetto di “epitope matching”, con valore predittivo, per il DPB1
in un contesto 10/10 (9/10)
Valore predittivo per altri alleli (DRB1, DQB1 e di classe I) sono stati
in parte già evidenziati, ma certamente dovranno essere approfonditi
in futuro
La possibilità di esplorare regioni genetiche fino ad ora non coinvolte
nella “compatibilità” è elemento nuovo e stimolante per il futuro
