Micro e
Nanotecnologie per
la Vaccinazione Orale
Dr Paolo BLASI,
Dip. Chimica e
Tecnologia del Farmaco
Università degli Studi
di Perugia
Organizzazione della Presentazione
Introduzione
Somministrazione orale di farmaci e vaccini: Luci
ed ombre
Immunizzazione Orale
Immunizzazione Orale in Pescicoltura
Sistemi micro e nanoparticellari come carriers di
vaccini
Considerazioni Conclusive e Prospettive Future
Introduzione
Che cos’è un vaccino?
Quali sono le finalità della vaccinazione?
Quali sono le possibili vie di
somministrazione di un vaccino?
Perché la via orale è così appetibile?
Perché c’è bisogno delle micro e
nanotecnologie per lo sviluppo di un vaccino
ideale?
Introduzione
Che cos’è un vaccino?
Vaccini inattivati
Vaccini vivi attenuati
Vaccini basati sulla tecnologia
del DNA ricombinante
In ogni caso gli antigeni che devono essere
veicolati e stimolare la risposta sono
macromolecole biologiche, come peptidi,
proteine, glicoproteine o frammenti di materiale
genetico facilmente denaturabili...
Introduzione
Quali sono le finalità della vaccinazione?
Protezione dalla patologia
Memoria
Il vaccino ideale...
Sicuro, immunogenico e protettivo!
Vie di Somministrazione di Vaccini
Esseri Umani: fatta qualche eccezione
(polio) la via più utilizzata è quella
parenterale1
Pesci:2,3
Parenterale
Orale
Per immersione/spray
1. Li Wan Po A. et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 1995, 18, 101-109; 2. Ellis A.E., Fish Vaccination, Academic
Press 1988 ; 3. Gudding R., et al., Vet. Immunol. Immunopathol. 1999, 72, 203-212;
Strategie/Vie di Somministrazione per Vaccini
Parenterale
Immersione/spray
ü Bassa compliance (stress) ü Più rapida
ü richiede anestesia e
ü Richiede quantità di vaccino
manipolazione
più elevate
ü Costosa (~1000 fish/h)
ü Non adatta a tutte le
dimensioni (15g)
ü Ritenzione nella cavità
peritoneale
ü Molto efficace (adj) anche
se non conferisce Immunità
mucosale
ü Possibilità di
automatizzazione
ü Spray - più stressante
dell’immersione
ü Spray - meno efficace
dell’immersione
Ellis A.E., Fish Vaccination, Academic Press 1988 ; Gudding R., et al., Vet. Immunol. Immunopathol. 1999,
72, 203-212;
Perché la via orale è così appetibile?
Pro
ü Economica e rapida
ü Incluso nei mangimi
ü Permette l’utilizzo degli adiuvanti
ü stimola la risposta mucosale
Ellis A.E., Fish Vaccination, Academic Press 1988 ; Gudding R., et al., Vet. Immunol. Immunopathol. 1999,
72, 203-212;
Somministrazione orale di vaccini
Perché la via orale è così appetibile pur
essendo una delle più “sconvenienti”?
Contro
Degradazione da parte del pH
gastrico
Degradazione da parte degli Enzimi
Peristalsi
Adsorbimento su cibi non digeribili
Degradazione da parte della flora
batterica e dei loro prodotti
metabolici
Ma dove deve arrivare
l’antigene per esplicare
la sua azione?
Epitelio associato ai follicoli (FAE),
raffigurante la generica struttura in
sezione del tessuto linfoide associato
alla mucosa intestinale (GALT)
Le cellule M (microfolds) sono
cellule epiteliali specializzate in
grado di facilitare il trasferimento di
Materiale particolato dal lume verso
la componente immunoattiva delle
placche del Peyer
muco
via intracellulare
via
paracellulare
enterociti
cellule M e
placche del
Peyer
endocitosi
linfociti
Placche del Peyer:
macrofagi
Lamina basale
Sono raggruppamenti di tessuto linfatico (linfociti B
e C) localizzato nella sottomucosa dell' intestino
Fattori che Influenzano l’Uptake1
Dimensioni (<10 µm)2
In generale “the smaller the better”; 0,05 µm ~34% vs 1 µm ~5%
Caratteristiche superficiali: lipofilia3,4
Polistirene>PLA>PLGA>Cellulose
Caratteristiche superficiali: carica5
La carica negativa sembra aumentare l’uptake mentre la carica positiva sembra essere
meglio fagocitata
Caratteristiche superficiali: Presenza di specifici ligandi
Anticorpi monoclonali6, Yersinia pseudotuberculosis invasin7
Caratteristiche e volume del veicolo
Stato dell’animale
N.B. La lipofilia aumenta la
capacità delle particelle di
fungere da adiuvante8
1. Cohen, S., Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines. Marcel Dekker, New York;
2. Jani P.U. et al., J. Pharm. Pharmacol. 1990, 42, 821; 3. Eldridge I.H., et al., J. Control. Release 1990, 11,
205; 4. Jepson M.A. etal., J. Drug Target. 1993, 1, 245; 5. Tomizawa H et al., Pharm. Res. 1993, 10, 549; 6.
Pappo J. et al., Immunology 1991, 73, 277; 7. Hussain N. and Florence A.T. Pharm. Res. 1998, 15, 153; 8.
Kreuter J. et al., Vaccine 1988, 6, 253
Pareri Discordanti…
Studi effettuati su roditori... Traslabili all’uomo? ed ai pesci?
Influenza delle condizioni sperimentali...
Capacità di uptake...
Importanza dell’uptake da parte degli enterociti nel
processo di immunizzazione...
Starch microparticles as vaccine adjuvant: Only uptake in
Peyer’s patches decides the profile of the immune
response, Vaccine 2006, 24, 3661
Cohen, S., Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines. Marcel Dekker, New York
Differenze tra Pesci e Mammiferi
Sistema immunitario più rudimentale. Tuttavia i pesci sono gli
organismi più primitivi ad avere un’immunità adattativa
Nei pesci non sono presenti le Placche del Peyer e quindi le cellule
M deputate al trasporto dell’antigene! Tuttavia, la presenza di
enterociti che presentano una certa capacità di trasporto degli
antigeni e di molte cellule linfoidi e macrofagi tra le cellule
epiteliale e la lamina propria assicura funzioni simili a quelle delle
cellule M.
Poikilothermic (metabolismo e intensità della risposta
immunitaria dipendenti dalla temperatura)
Nel caso della vaccinazione per via orale (ed
anche per immersione) non sono ancora del tutto
chiari i meccanismi di uptake e presentazione
dell’antigene.
Riassumendo…
Il vaccino necessita di un carrier
adeguato che:
Gli consenta di superare indenne lo stomaco e la prima
parte dell’intestino
Consenta l’incapsulamento sia del vaccino che
dell’adiuvante o che funga da adiuvante
Faciliti o coadiuvi l’uptake dell’antigene da parte delle
cellule preposte e/o che rilasci l’antigene se
interamente fagocitato
Sistemi micro e nanoparticellari come
carriers di vaccini
Tipologie di particelle
MICRO- e NANOSFERE:
consistono di una matrice solida
polimerica contenente il principio
attivo che può essere disciolto
nel polimero (a), intrappolato tra
le maglie della matrice (b) e/o
semplicemente adsorbito sulla
superficie esterna della particella
(c).
a
c
b
MICRO- e NANOCAPSULE:
sono sistemi vescicolari (“reservoir”)
costituiti da una membrana di natura
polimerica, che racchiude un nucleo in
cui è disciolto o sospeso il principio
attivo (d). Quest’ultimo può anche
essere adsorbito alla superficie
esterna della membrana stessa (e).
d
e
Sistemi micro e nanoparticellari come
carriers di vaccini
Problemi “Biologici”
Individuazione dell’agente
eziologico
Produzione del vaccino
Individuazione del recettore
Problemi tecnologici
Progettazione e sintesi del
ligando
Scelta del polimero e del metodo
di incapsulamento
Scelta dell’adiuvante
Coniugazione del ligando
Stabilizzazione della
macromolecola durante il processo
Co-incapsulamento dell’adiuvante
Stabilità delle particelle
rilascio dell’antigene
e
Principali metodi di preparazione di
microparticelle
1.
Coacervazione di fase
2.
Polimerizzazione interfacciale
3.
Reticolazione in sospensione
4.
Gelificazione termica
5.
Evaporazione del solvente
6.
Essiccamento a spruzzo (Spray Drying)
7.
Fusione e raffreddamento
8.
Gelificazione ionica
9.
Raffreddamento a spruzzo
10.
Letto fluido
11.
Deposizione elettrostatica
Sostanze utilizzate nella preparazione di microparticelle
Proteine
Albumina
Gelatina
Collageno
Caseina
Polisaccaridi
Amidi
Cellulosa e derivati
Alginati
Pectine
Carragenani
Chitosani
Poliesteri
Ac. polilattico (PLA)
Ac. poliglicolico (PGA)
Ac. polilattico co-glicolico (PLGA)
Poli-ε-caprolattone
Poli-β-odrossibutirrato
Ortoesteri
Polianidridi
poli[bis(p-carbossi fenossi) propananidride ed il copolimero
con ac. sebacico
Polivinilici
Vinil alcool
Vinil acetato
Poliacrilati
Acrilati
Metacrilati
Co-polimeri acrilici metacrilici
Varie
Gliceridi
Cere
Esteri solidi
Rappresentazione schematica della
microincapsulamento per evaporazione di solvente
Fase disperdente +
agente emulsionante
Soluzione polimerica
+farmaco solubilizzato
o disperso
Emulsione O/A
Evaporazione
del solvente
Formazione di
microparticelle
Incapsulamento
Protegge peptidi e proteine dalla degradazione
Veicolare peptidi e proteine (e quindi vaccini) in
maniera sostenuta e/o direzionata
Denaturazione dovuta al processo di
microincapsulamento
Utilizzo di
solventi organici
Agitazione
Adsorbimento
“Ultrasonicazione” sulla matrice
polimerica
Schwendeman S.P., 1996. Stability of proteins and their delivery from biodegradable polymer microspheres.
In: Cohen, S. (Ed.), Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines. Marcel Dekker, New
York, pp. 1-50.
400 X
1000 X
Rappresentazione schematica di uno
spray-dryer da laboratorio
Aria compressa
Nebulizzatore
Camera di
essiccazione
Soluzione, sospensione,
emulsione da nebulizzate
Riscaldamento
Aria secca
filtrata
Aria calda
Ciclone
Collettore
Raccoglitore di
microsfere
Omogeneizzazione ad alta pressione a
caldo o a freddo
Emulsione O/A
Omogeneizzatore ad alta pressione
Gelificazione Ionica
Bisogno
Bisogno di
di una
una migliore
migliore comprensione
comprensione dei
dei vari
vari meccanismi
meccanismi
biologici
biologici alla
alla base
base della
della risposta
risposta immunitaria
immunitaria dopo
dopo vaccinazione
vaccinazione
orale
orale
Individuazione
Individuazione di
di target
target molecolari
molecolari per
per progettare
progettare vaccini
vaccini più
più
efficaci
efficaci
Necessità
Necessità di
di maggiore
maggiore interazione
interazione tra
tra le
le diverse
diverse discipline
discipline implicate
implicate
Enormi
Enormi potenzialità
potenzialità dei
dei vaccini
vaccini prodotti
prodotti con
con la
la tecnologia
tecnologia del
del DNA
DNA
ricombinante
ricombinante
Largo
Largo impiego
impiego delle
delle tecnologie
tecnologie di
di micromicro- ee nano-incapsulamento
nano-incapsulamento
nella
nella produzione
produzione di
di vaccini
vaccini
Marco Marani
Dott. Paolo Blasi
↓
Dott. Stefano Giovagnoli
↓
Dott. Luana Perioli
Dott. Cinzia Pagano
↓
Dott. Aurelie Scoubben
Dott. M. Cristina Tiralti
Prof. Valeria Ambrogi
Prof. Maurizio Ricci
Prof. Carlo Rossi
Grazie per l’attenzione!
