Chimica Biologica
A.A. 2010-2011
Inibizione Enzimatica
Marco Nardini
Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie
Università di Milano
Inibizione enzimatica
Macromolecole Biologiche
Inibitori:
sostanze che riducono l’attività enzimatica influenzando il legame del
substrato e/o il numero di turnover ⇒ influenza su KM e VMAX
(1) Inibitori reversibili
interazioni non covalenti di associazione/dissociazione
- (a) inibitori competitivi
- (b) inibitori incompetitivi
- (c) inibitori misti (o non-competitivi)
(2) Inibitori irreversibili (inattivatori)
alterazioni stabili (covalenti) dell’enzima
⇒ diminuzione della concentrazione dell’enzima attivo
Macromolecole Biologiche
Inibizione reversibile
Inibitori competitivi:
- competono con il substrato per il legame all’enzima
⇒ [S] grandi possono annullare l’effetto di I (se [S] aumenta, aumenta la
probabilità che S si leghi all’enzima invece dell’inibitore)
- somiglianza strutturale col substrato
(ma impossibilità a reagire con l’enzima come fa il substrato)
- spesso analogo dello stato di transizione
- inibizione da prodotto: il prodotto della reazione può competere col
substrato per il legame all’enzima (⇒ regolazione dell’attività enzimatica)
(da non confondere con l’inibizione “a feedback” di un percorso metabolico)
Macromolecole Biologiche
Inibizione reversibile
Inibitori competitivi:
Esempio:
il malonato è un inibitore competitivo della succinato deidrogenasi (ciclo
dell’acido citrico)
il malonato strutturalmente assomiglia al succinato ma non viene
deidrogenato dall’enzima (il cui sito attivo è predisposto a legare 2 gruppi
carbossilici)
Inibizione reversibile
Macromolecole Biologiche
Inibitori competitivi:
schema di reazione
E+S
+
I
k1
k-1
ES
k2
E+P
k-3 k3
EI + S
X
- EI = complesso enzima-inibitore cataliticamente inattivo
- il complesso ternario EIS è fisicamente impossibile
- EI non reagisce a dare E + P ( ⇒ I non è alterato da E)
- l’inibitore si lega in modo reversibile all’enzima e si porta in rapido
equilibrio con esso con costante di dissociazione
[E][I]
k
KI = -3 =
[EI]
k3
Inibizione reversibile
Macromolecole Biologiche
Inibitori competitivi:
⇒ l’inibitore riduce la concentrazione dell’enzima libero per legare il substrato
[E]T = [E] + [ES] + [EI]
KI =
⇒
⇒
[E][I]
[EI]
⇒
[EI] =
[E][I]
KI
[E][I]
[E]T = [E] + [ES] +
KI
= α [E] + [ES]
α=1+
[E] = [E]T - [ES]
α
Michaelis-Menten:
KM =
[E][S]
[ES]
assunzione stato stazionario
[I]
KI
v0= d[P]/dt = k2 [ES]
[S] elevato
Inibizione reversibile
Macromolecole Biologiche
Inibitori competitivi:
KM =
[E] = [E]T - [ES]
α
[E]T [S]
[S]
[E][S]
=
[ES]
α [ES]
α
[ES] = [E]T [S]
[S] + α KM
α=1+
v0= d[P]/dt = k2 [ES] ⇒ v0 =
[I]
>1
KI
k2[E]T [S]
V
[S]
VMAX [S]
= MAX
=
[S] + α KM
[S] + α KM
[S] + KMapp
α = 1 ⇒ nessuna inibizione
v0 =
VMAX [S]
KM + [S]
Inibizione reversibile
Macromolecole Biologiche
Inibitori competitivi:
v0 =
VMAX [S]
[S] + α KM
[I]
α=1+
>1
KI
- v0 è minore in presenza dell’inibitore
- se [S] → ∞ v0 → VMAX per
α
⇒ l’inibitore non influenza il turnover dell’enzima (kcat = VMAX/[ET])
- aumenta la KM apparente:
⇒ l’inibitore rende [S] più diluita (perché il legame di I ed S sono esclusivi)
⇒ KM sembra più grande di quello che è (KMapp=αKM)
Inibizione reversibile
Macromolecole Biologiche
grafico dei doppi reciproci (Lineweaver-Burk)
Inibitori competitivi:
α KM 1
1
1
=
+
v0
VMAX [S]
VMAX
- se [S] → ∞ (1/[S] → 0)
⇒ v0 → VMAX e tutto l’enzima è nella forma ES
- l’intercetta sulle x diminuisce all’aumentare di [I]
⇒ KM apparente aumenta
Criterio diagnostico: VMAX non è influenzata da [I] ⇒ inibizione competitiva
Inibizione reversibile
Macromolecole Biologiche
Inibitori competitivi:
KI può essere misurato
- se si misura KMapp ad una determinata [I] per un enzima di cui è noto KM
KM
app
= αKM
[I]
α=1+
KI
KI =
[I]
α -1
- per varie [I] si misura KMapp
KMapp = αKM = KM + KM
[I]
KI
(-KI) intercetta sull’asse x nel grafico KMapp vs [I]
=
[I]
KMapp/KM -1
Macromolecole Biologiche
Inibizione reversibile
Inibitori competitivi:
Esempio:
l’inibizione competitiva è il principio base dell’uso dell’etanolo nel trattamento
dell’avvelenamento da metanolo
- metanolo solo parzialmente tossico
- etanolo inibitore competitivo per la alcol deidrogenasi di fegato
- metanolo escreto attraverso le urine
H
|
metanolo H−C−OH
|
H
O
||
H−C−H
formaldeide
(altamente tossica
⇒ cecità, morte)
acetaldeide (facilmente metabolizzata)
etanolo
Inibizione reversibile
Macromolecole Biologiche
Inibitori incompetitivi:
schema di reazione
E+S
k1
k-1
ES
+
I
k2
E+P
k-3’ k3’
ESI
X
- l’inibitore si lega in modo reversibile al complesso enzima-substrato ES
ma non all’enzima libero
[ES][I]
k
KI’ = -3 =
- la costante di dissociazione è
[ESI]
k3
- l’inibitore non deve necessariamente assomigliare al substrato
(probabilmente provoca distorsione del sito attivo che rende l’enzima
inattivo ⇒ influenza la funzione catalitica, non il legame del substrato)
Inibizione reversibile
Macromolecole Biologiche
Inibitori incompetitivi:
[E]T = [E] + [ES] + [ESI]
KI’ =
⇒
⇒
[ES][I]
[ESI]
⇒
[ESI] =
[ES][I]
KI’
[ES][I]
[E]T = [E] + [ES] +
KI’
= [E] + α’[ES]
α‘ = 1 +
[E] = [E]T - α’[ES]
Michaelis-Menten:
KM =
[E][S]
[ES]
assunzione stato stazionario
v0= d[P]/dt = k2 [ES]
[S] elevato
[I]
KI’
Inibizione reversibile
Macromolecole Biologiche
Inibitori incompetitivi:
KM =
[E]T [S]
[E][S]
α’[S]
=
[ES]
[ES]
[ES] = [E]T [S]
α’[S] + KM
[I]
α’ = 1 +
>1
KI’
k2[E]T [S]
VMAX [S]
(VMAX/α’) [S]
v0= d[P]/dt = k2 [ES] ⇒ v0 =
=
=
α’[S] + KM
α’[S] + KM [S] + KM/α’
α’ = 1 ⇒ nessuna inibizione
v0 =
VMAX [S]
KM + [S]
VMAXapp= VMAX/α’
KMapp= KM/α’
Inibizione reversibile
Macromolecole Biologiche
Inibitori incompetitivi:
v0 =
VMAX [S]
KM + α’[S]
KM
1
=
v0
VMAX
α’ = 1+
[I]
KI’
1
α’
+
[S]
VMAX
- KMapp e VMAXapp diminuiscono ma il loro
rapporto (= KM/VMAX) rimane costante
- anche se [S] è grande non si
può superare l’effetto di inibizione
perché i’inibitore non si lega dove
si lega il substrato
grafico dei doppi reciproci (Lineweaver-Burk)
- tipo di inibizione significativo per enzimi multisubstrato
Inibizione reversibile
Macromolecole Biologiche
Inibitori misti:
schema di reazione
E+S
+
I
k-3 k3
EI
k1
k-1
ES
+
I
k2
E+P
k-3’ k3’
ESI
X
- l’inibitore si lega in modo reversibile sia all’enzima E sia al complesso
enzima-substrato ES
⇒ I si lega a siti dell’enzima che partecipano sia nel legame del substrato
che nella catalisi
⇒ influenza sia il legame del substrato che la funzione catalitica
- i siti di legame di I e S sono vicini o I causa un cambio conformazionale
in E che influenza il legame di S
Inibizione reversibile
Macromolecole Biologiche
Inibitori misti:
schema di reazione
E+S
+
I
k-3 k3
EI
k1
k-1
ES
+
I
k2
E+P
k-3’ k3’
ESI
X
- costanti di dissociazione:
(non necessariamente equivalenti)
k
KI = -3 =
k3
[E][I]
[EI]
KI’ =
k-3’
k 3’
=
[ES][I]
[ESI]
Inibizione reversibile
Macromolecole Biologiche
Inibitori misti:
VMAX [S]
app [S]
V
(V
/α’)
[S]
MAX
MAX
v0 =
=
=
α KM + α’[S]
KMapp + [S]
α/α’ KM + [S]
inibizione “mista”
presenza di α (inib. comp)
ed α’ (inib. incomp)
α KM 1
1
α’
=
+
v0
VMAX [S]
VMAX
- VMAXapp diminuisce, KMapp può aumentare
o diminuire (KMapp/VMAXapp non è costante)
a seconda del valore di α e α’
- a crescente saturazione di E ed ES
con I ([I] crescente) intersezione a
sinistra dell’asse 1/v0
grafico dei doppi reciproci (Lineweaver-Burk)
Inibizione reversibile
Macromolecole Biologiche
Inibitori misti:
-quando KI = KI’ si parla di inibizione non-competitiva (mista) pura (α = α’),
cioè l’enzima ed il complesso enzima-substrato legano I con la stessa affinità
⇒ intersezione linee sull’asse delle ascisse e a (-1/KM)
grafico dei doppi reciproci (Lineweaver-Burk)
Macromolecole Biologiche
Inibitori reversibili:
Inibizione reversibile
Macromolecole Biologiche
Inibizione irreversibile
Inibitori irreversibili:
- alterazioni stabili (covalenti) dell’enzima reale diminuzione della
concentrazione del’enzima attivo [E]T
⇒ diminuisce VMAX = k2 [E]T per qualsiasi [S] senza variare KM
- stesso andamento di 1/v0 come inibizione non-competitiva (mista) pura
(intersezione linee asse ascisse)
- distinzione da inibizione non-competitiva
1) inibizione non istantanea, ma dipende da t (aumenta man mano che si
forma EI)
2) dialisi o diluizione non dissociano EI e non si restaura attività enzimatica
Macromolecole Biologiche
Inibizione irreversibile
Inibitori irreversibili:
Esempio: Substrati suicidi:
analoghi del substrato che a seguito della reazione catalitica generano gruppi
reattivi che formano legami covalenti con gruppi funzionali del sito attivo,
inibendolo irreversibilmente
a) alta affinità e specificità di legame col sito attivo
b) etichettatura di un gruppo funzionale nel sito attivo
Es: penicillina (antibiotico)
- substrato suicida)
⇒ non si formano legami crociati fra peptidoglicani
⇒ cellule batteriche suscettibili a lisi osmotica crescita batterica bloccata
Inibizione irreversibile
Macromolecole Biologiche
Inibitori irreversibili:
Es: penicillina
- antibiotico secreto dalla muffa Penicilium notatum
gruppo variabile
- induce lisi dei batteri
- lega ed inattiva gli enzimi formano
i legami trasversali tra le catene dei
peptidoglicani
anello tiazolico
- in fase di crescita l’esposizione
alla penicillina è letale
- non tossica per l’uomo perché nessun
enzima umano lega in modo specifico
la penicillina
anello lattamico
legame amidico
reattivo
Macromolecole Biologiche
Inibizione irreversibile
Peptidoglicani
- reticolo di polisaccaridi legati in modo covalente e da catene polipeptidiche
- legami trasversali formati da 5 Gly che uniscono il gruppo C-terminale
di un tetrapeptide con il gruppo amminico ε di una Lys
Macromolecole Biologiche
Inibizione irreversibile
Peptidoglicani
- l'assemblaggio della parete cellulare è catalizzato dagli enzimi PBP
(penicillin binding proteins), localizzati nella membrana citoplasmatica.
- si distinguono due gruppi di PBP, a basso e ad alto peso molecolare (HMW)
- PBP HMW di classe A promuovono la transpeptidazione (cross-linking) dei
peptici della parete
⇒ nella rimozione proteolitica della D-Ala alla
estremità C-terminale del pentapeptide
⇒ formazione di un nuovo legame ammidico tra
l'aminogruppo del peptide trasversale e il gruppo
carbonilico della D-Ala in posizione 4.
Questa reazione è il bersaglio degli antibiotici
beta-lattamici che mimano la struttura della D-ala-D-ala
Macromolecole Biologiche
Inibitori irreversibili:
Penicillina
- il legame peptidico reattivo dell’anello
β-lattamico si attacca covalentemente alla
Ser del sito attivo
- la conformazione della penicillina attorno
al legame peptidico reattivo assomiglia
allo stato di transizione
- legame irreversibile
Inibizione irreversibile
Macromolecole Biologiche
Inibizione irreversibile
Inibitori irreversibili:
Penicillina
- batteri resistenti secernono una penicillasi che inattiva la penicillina
rompendo il legame amidico dell’anello lattamico
