RUOLI BIOLOGICI DELLE PROTEINE Biochimica GLI ENZIMI I) Gli enzimi sono potenti biocatalizzatori § Determinano tutte le trasformazioni chimiche cellulari e mediano l’interconversione tra diverse forme di energia. § Aumentano la velocità delle reazioni che catalizzano per un fattore di almeno 106 § NON sono modificati dalle reazione che catalizzano. § NON alterano l’equilibrio delle reazioni. § Però possono accoppiare reazioni energeticamente sfavorevoli (∆G positivo) con l’idrolisi di ATP (∆G globale negativo, equilibrio prodotto) § Normalmente agiscono in un arco ristretto di condizioni (pH, temperatura). II) Gli enzimi sono altamente specifici (… se serve). § Catalizzano solo un tipo di reazione (es. idrolisi, redox, ecc.) § Riconoscono un reagente specifico (il SUBSTRATO) [es. proteine/peptidi, acidi nucleici, polisaccaridi (o specifiche parti di essi), acidi grassi/lipidi, metaboliti vari ] § Possono riconoscere il substrato con una specificità elevatissima, oppure in maniera relativamente non specifica, secondo le necessità biologiche. III) Gli enzimi possono avere uno o più siti attivi Possono essere composti da - una sola subunità con un solo sito attivo (enzima monomerico e monofunzionale) (A) - più subunità identiche ciascuna con lo stesso tipo di sito attivo (enzima multimerico ma monofunzionale) (B) - più subunità diverse con diversi tipi di siti attivi (enzima multimerico e multifunzionale) (C) - un’unica catena con diversi domini strutturali ciascuno con un diverso tipo di sito attivo (enzima monomerico ma multifunzionale) (D). (A) (B) (C) (D) IV) Architettura generale degli enzimi SITO ATTIVO - sito di legame - sito catalitico (amminoacidi/cofattori) substrato - sito per stabilizzare l’intermedio di reazione impalcatura proteica SITI REGOLATORI - Modificazione covalente irreversibile PO4 - Modificazione covalente reversibile (fosforilazione) - Controllo allosterico (“eterotropico”) controllo allosterico “omotropico” protomero protomero (di un enzima multimerico) Interfaccia per l’oligomerizzazione V) Caratteristiche del sito attivo il sito attivo è una zona relativamente ristretta e ben definita della proteina • ha una precisa struttura tridimensionale che coinvolge relativamente pochi residui nella struttura primaria • questi residui sono vicini nella struttura terziaria ma non necessariamente vicini nella struttura primaria. • il sito attivo è composto da: - il SITO DI LEGAME, generalmente un solco o una cavità nella superficie dell’enzima, con una elevata complementarità di forma con il substrato (o intermedio di reazione), che permette di instaurare interazioni multiple [legamiH (direzionali), interazioni elettrostatiche (utili per docking), forze di vdW (complementarità); interazioni idrofobiche (favoriscono l’associazione)]. - il SITO CATALITICO, che può essere composto solo da residui amminoacidici, oppure può coinvolgere anche GRUPPI PROSTETICI (cofattori o coenzimi). - SITI per la STABILIZZAZIONE DI INTERMEDI della reazione catalizzata VI) L’attività di molti enzimi è regolata da fattori esterni § CONTROLLO ALLOSTERICO -omotropico: il legame del substrato stesso stimola il legame di un’altra molecola di substrato in un altro sito attivo (+ +) -eterotropico: il legame di una molecola diversa dal substrato, ad un sito diverso dal sito di legame, modula l’attività catalitica (± ±) § MODIFICAZIONI COVALENTI REVERSIBILI - attivazione/disattivazione mediante fosforilazione/defosforilazione (± ±) § MODIFICAZIONI COVALENTI IRREVERSIBILI - attivazione mediante taglio proteolitico della catena enzimatica (+ +) § INIBIZIONE COMPETITIVA (− −) una sostanza simile al substrato blocca il sito di legame § CONTROLLO GENICO (+ +) l’enzima è prodotto solo quando serve, e nelle quantità che servono § CONTROLLO per COMPARTIMENTLIZZAZIONE VI) modelli d’azione - la complementarietà di forma due modelli descrivono l’interazione enzima/substrato: Modello a chiave e serratura (Emil Fisher, 1890) Modello ad adattamento indotto (Daniel Koshland Jr., 1958) A Es.: le chinasi In questo modello, il sito attivo ha una forma complementare a quella del substrato La selettività è data da questa Complementarietà di forma In questo modello, il sito attivo cambia forma In seguito al legame del substrato, la forma diventa più complementare a quella del substrato, (si adatta) e l’enzima si attiva VII) Catene e cascate enzimatiche CATENA S1 + E1 S2 + E2 S3 + E3 S4 + E4 TRASFORMAZIONE CASCATA iE= aE 1+ iE aE 2 2+ aE inattivo iE iE aE 3 1 aE= aE 2 iE 3+ iE 4 aE attivo aE iE 3 aE 4 S S P AMPLIFICAZIONE 2 3 4+ 4 P VIII) Principi fondamentali dell’azione enzimatica Stabilizzazione dello stato di transizione nella reazione — Effetti sterici e di prossimità - posizionamento / deformazione — Catalisi generale acido-basica - addizione/rimozione di protoni — Catalisi covalente - legame transiente con catene laterali nucleofile — Effetti elettrostatici - distribuzione favorevole alla reazione della carica (densità elettronica) nel sito attivo IX) Componenti del sito catalitico Il sito catalitico può utilizzare solo la reattività chimica delle catene laterali di alcuni amminoacidi (negli enzimi semplici): Asp & Glu (-COOH ); Ser & Tyr (-OH ) Cys (-SH ); Lys (-NH2 ); His (-NH) In molti casi però, gli enzimi utilizzano la reattività chimica aggiuntiva di altre specie chimiche (enzimi coniugati): 1) COFATTORI - ioni metallici che formano legami di coordinazione multipli e che agiscono da catalizzatori elettrofilici, che facilitano spostamenti di densità elettronica 2) COENZIMI - molecole organiche derivate da vitamine idrofile o lipofile che catalizzano reazioni tipo redox o di trasferimento o riarrangiamento di gruppi chimici Proteine semplici Proteine coniugate solo AA gruppi prostetici ENZ IMI Metalli e ioni metallici FeII, FeIII, CuII ZnII, MgII, MnII, Mo, Se L’enzima coniugato con il suo gruppo prostetico e noto come oloenzima ed è attivo In assenza del gruppo prostetico è noto come apoenzima ed è inattivo COENZIMI NAD, FAD, FMN, CoA derivati di vitamine X) Gli enzimi trasformano energia (accoppiando reazioni) S P ∆G = ∆E - T ∆S (1) Keq = [P]/[S] ∆G = ∆G°’ + RT ln [P]/[S] ad equilibrio, ∆G = 0, (2) ∆G°’ = - RT ln[P]/[S] (3) ∆G°’ = - RTlnK eq = -2,303RT log10eqK K eq = 10[-∆G°’/(2,303RT)] = 10-∆∆G°’/5,6 (4) [R = 8,315x10-3, T = 298K (25°C)] Più negativo diventa ∆G°’ più aumenta Keq Questo avviene se l’enzima accoppia la reazione con l’idrolisi di ATP Ogni variazione di 5,6 kJ/mol (-1.36 kcal/mol) in ∆G comporta un aumento di 10 volte in Keq XI) Gli enzimi diminuiscono l’energia dello stato di transizione S P V= d[S] dt (M s-1) reaz. 1° ordine V = k [S] k = costante di velocità (s-1) 1) posizionano e/o distorgono il substrato/i 2) stabilizzano gli intermedi di reazione (S‡) 3) spesso il sito di legame ha una forma più complementare allo stato di transizione (TS) che al substrato stesso k= c· ‡ -(∆ ∆ G /RT) exp Quindi, se ∆G ‡ S1 + S2 k V P reaz. 2°ordine V = k [S1][S2] k = costante di velocità (M-1 s-1) IX) Classificazione degli enzimi (numero EC)(Enzyme Commission N°) 1) Ossidoriduttasi - reazioni redox (trasferimento O, H o e-) 2) Transferasi - trasferimento intermolecolare gruppi funzionali (−CH3, RCO−, NH3+−, PO42-− ) 3) Idrolasi - reazioni di idrolisi (scissione legame) 4) Liasi/sintasi - addizione o rimozione non idrolitica di gruppi (rottura non idrolitica di legami) 5) Isomerasi - riarrangiamenti intramolecolari 6) Ligasi (sintetasi) - formazione di legami (ATP dipendente) n.b. l’EC non specifica l’enzima ma la reazione che catalizza es. Idrolasi - 3.1 - 3.2 - 3.4 - idrolisi di legami estere e fosfoestere - idrolisi di legami glicosidici - idrolisi di legami peptidici hydrolase serine endopeptidases tripsina EC 3.4.21.4 trypsins acting on peptide bond (peptidase)