Next Generation Sequencing for the study of ALS
and other Motor Neuron Diseases
C. Gellera1, B. Castellotti1, V. Pensato1, S. Magri1, D. Di Bella1, E. Dalla Bella2,
G. Lauria2, N. Ticozzi3, F. Taroni 1
Unit of Genetics of Neurodegenerative and Metabolic Diseases, IRCCS - Fondazione Istituto Neurologico
Carlo Besta, Milano
2 Unit of Neurology, IRCCS - Fondazione Istituto Neurologico Carlo Besta, Milano
3 Department of Neurology and Laboratory of Neuroscience, IRCCS Istituto Auxologico Italiano, Milano
1
Introduzione
La SLA è una malattia del motoneurone progressiva e fatale a patogenesi prevalentemente
sconosciuta e presentazione generalmente sporadica (90% dei casi).
L'identificazione delle cause genetiche di circa il 50% dei casi familiari (FALS) ha notevolmente
contribuito alla comprensione di alcuni processi biologici alla base di questa malattia.
I metodi tradizionali di biologia molecolare rendono però ormai molto difficile l’identificazione di
nuove determinanti genetiche. Infatti, l'analisi di linkage è di difficile applicazione per le
difficoltà intrinseche legate alla carenza di nuovi pedigree informativi, mentre l'approccio dei
“geni candidati” può risultare ampiamente inefficace in quanto sono molteplici i meccanismi
cellulari coinvolti nella malattia (processi ossidativi, metabolismo del DNA e RNA, processi di
autofagia, meccanismi di controllo di qualità delle proteine, meccanismi di trasporto assonale).
Recentemente, la tecnica NGS (Next Generation Sequencing) si è dimostrata un approccio
vincente per l’identificazione di nuove cause genetiche di SLA familiare e di altre malattie
neurodegenerative (Wu et al, 2012; O’Roak et al, 2011).
Al fine di meglio definire il contributo della genetica nelle forme sporadiche e di colmare il gap
genetico delle forme familiari abbiamo impostato un progetto di ricerca basato sulla tecnologia
NGS.
La SLA familiare (FALS) e quella sporadica (SALS) sono indistinguibili dal
punto di vista clinico e neuropatologico
85% SALS GENETICAMENTE
NON DEFINITI
SALS 90%. Malattia multifattoriale con
eziopatogenesi ignota
C9ORF
Metodi
FUS
TDP43
Altri
Il nostro lavoro si articola nelle seguenti fasi:
1)Studio design di un pannello NGS per l’analisi di 37 geni malattia coinvolti nella patogenesi della
SLA e di altre malattie del motoneurone e studio di fattibilità in 26 casi: 13 FALS, 13 SALS;
2)Studio design di un pannello NGS per l’analisi di 80 geni malattia coinvolti nella patogenesi della
SLA e di altre malattie del motoneurone;
3)Analisi di pazienti con recente diagnosi clinica di SLA sia familiare che sporadica mediante
pannello NGS-80geni (circa 60 nuovi casi/anno);
4)Exome-sequencing di casi familiari negativi allo screening dei geni noti;
5)Sequenziamento target mediante Sanger delle varianti identificate con pannello genico o exome
sequencing;
6)Validazione biologica delle varianti patogenetiche e caratterizzazione degli effetti delle
varianti identificate in modelli cellulari.
Pannello NGS-37geni per lo studio pilota:
Il pannello è stato disegnato mediante tecnologia Illumina
TruSeq Custom Amplicon Studio Design Illumina ed include
37 geni malattia. Il processo di validazione ha evidenziato
che i geni sono stati tutti analizzati con una copertura >90%.
C9ORF
Gene
I dent if ied
Variant
(Prot ein
ef f ect )
rs
MAF (%)
FUS
TDP43
Altri
SOD1
FALS 10%. Malattia mendeliana monogenica
con eziopatogenesi nota
50% FALS GENETICAMENTE NON DEFINITI
Casistica: nella nostra banca DNA dal 1995 abbiamo raccolto
250 casi familiari e 1100 casi sporadici di SLA
Risultati:
Lo studio pilota con pannello NGS-37 geni è stato
condotto sul DNA di 26 pazienti SLA (13 FALS e 13
SALS).
Il 1° processo di filtraggio secondo i criteri di qualità
produce una media di 500 varianti per campione.
Il 2° processo di filtraggio che permette di escludere
varianti introniche non splicing e polimorfismi noti con
MAF>1%, genera una media di 20 varianti per campione.
La sucessiva analisi di elaborazione dei dati ha
permesso di identificare 7 soggetti con mutazioni di
possibile significato patologico (vedi tabella).
Si tratta di varianti estramente rare di cui una sola
precedentemente descritta in letteratura (p.R155C nel
gene VCP).
Pt #
SOD1
GENE
C9ORF72
SOD1
TARDBP
FUS
FALS ANALIZZATI
138
231
156
139
FALS MUTATI
35
37
13
8
FREQUENZA
25.36%
16.02%
8.33%
5.76%
GENE
C9ORF72
SOD1
TARDBP
FUS
SALS ANALIZZATI
376
880
161
260
SALS MUTATI
18
25
9
4
FREQUENZA
4.79%
2.84%
5.59%
1.54%
Pannello NGS-80 geni per lo studio di forme SLA/FTD e altre malattie del
motoneurone:
Polyphen- 2
1292
OPTN
p. A481V
rs37219791
0.0077
damaging
SALS
1294
SQSTSM1
p. K238E
rs11548633
0.2614
damaging
SALS
1204
GARS
p.R 101K
rs200887429
0.0168
damaging
FALS
1247
GARS
p. T268I
rs2230310
0.4831
damaging
SALS
1240
VCP
p. R155C
rs121909330
Damaging
FALS
Described in
ALS in Watts
(2004), Nature
Genetics
Conclusioni:
La messa a punto e la validazione di un pannello NGS
per lo studio di geni coinvolti nella patogenesi della
SLA e di altre malattie del motoneurone è di grande
utilità in quanto potrà essere applicato per analizzare
da un punto di vista genetico non solo le forme
familiari ma anche le forme sporadiche che in questa
patologia costituiscono più dell’ 80% delle casistiche.
Il pannello NGS potra essere applicato sia per fini
diagnostici (per l’analisi dei geni più comunemente
associati a queste patologie), che per scopi di ricerca
per l’identificazione di varianti rare che possano
contribuire a spiegare la quota di eredità mancante
nelle forme sporadiche.
L’utilizzo di un pannelloNGS, implementabile via via
che nuovi geni malattia saranno identificati
permetterà una migliore e più precisa definizione
diagnostica di queste forme anche nei loro fenotipi
non canonici, rendendo possibile l’ottimizzazione dei
disegni terapeutici di medicina molecolare rendendo
di fatto attuabile nella pratica clinica questo
approccio terapeutico.
1279
DCTN1
p. F652C
not reported
1300
SIGMAR1
p.R208W
rs11559048
0.7151
damaging
FALS
damaging
SALS
Alessia Castucci
Viviana Pensato
Barbara Castellotti
XLV CONGRESSO NAZIONALE
11-14 OTTOBRE 2014 – CAGLIARI
301
