Next Generation Sequencing for the study of ALS and other Motor
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Next Generation Sequencing for the study of ALS and other Motor Neuron Diseases C. Gellera1, B. Castellotti1, V. Pensato1, S. Magri1, D. Di Bella1, E. Dalla Bella2, G. Lauria2, N. Ticozzi3, F. Taroni 1 Unit of Genetics of Neurodegenerative and Metabolic Diseases, IRCCS - Fondazione Istituto Neurologico Carlo Besta, Milano 2 Unit of Neurology, IRCCS - Fondazione Istituto Neurologico Carlo Besta, Milano 3 Department of Neurology and Laboratory of Neuroscience, IRCCS Istituto Auxologico Italiano, Milano 1 Introduzione La SLA è una malattia del motoneurone progressiva e fatale a patogenesi prevalentemente sconosciuta e presentazione generalmente sporadica (90% dei casi). L'identificazione delle cause genetiche di circa il 50% dei casi familiari (FALS) ha notevolmente contribuito alla comprensione di alcuni processi biologici alla base di questa malattia. I metodi tradizionali di biologia molecolare rendono però ormai molto difficile l’identificazione di nuove determinanti genetiche. Infatti, l'analisi di linkage è di difficile applicazione per le difficoltà intrinseche legate alla carenza di nuovi pedigree informativi, mentre l'approccio dei “geni candidati” può risultare ampiamente inefficace in quanto sono molteplici i meccanismi cellulari coinvolti nella malattia (processi ossidativi, metabolismo del DNA e RNA, processi di autofagia, meccanismi di controllo di qualità delle proteine, meccanismi di trasporto assonale). Recentemente, la tecnica NGS (Next Generation Sequencing) si è dimostrata un approccio vincente per l’identificazione di nuove cause genetiche di SLA familiare e di altre malattie neurodegenerative (Wu et al, 2012; O’Roak et al, 2011). Al fine di meglio definire il contributo della genetica nelle forme sporadiche e di colmare il gap genetico delle forme familiari abbiamo impostato un progetto di ricerca basato sulla tecnologia NGS. La SLA familiare (FALS) e quella sporadica (SALS) sono indistinguibili dal punto di vista clinico e neuropatologico 85% SALS GENETICAMENTE NON DEFINITI SALS 90%. Malattia multifattoriale con eziopatogenesi ignota C9ORF Metodi FUS TDP43 Altri Il nostro lavoro si articola nelle seguenti fasi: 1)Studio design di un pannello NGS per l’analisi di 37 geni malattia coinvolti nella patogenesi della SLA e di altre malattie del motoneurone e studio di fattibilità in 26 casi: 13 FALS, 13 SALS; 2)Studio design di un pannello NGS per l’analisi di 80 geni malattia coinvolti nella patogenesi della SLA e di altre malattie del motoneurone; 3)Analisi di pazienti con recente diagnosi clinica di SLA sia familiare che sporadica mediante pannello NGS-80geni (circa 60 nuovi casi/anno); 4)Exome-sequencing di casi familiari negativi allo screening dei geni noti; 5)Sequenziamento target mediante Sanger delle varianti identificate con pannello genico o exome sequencing; 6)Validazione biologica delle varianti patogenetiche e caratterizzazione degli effetti delle varianti identificate in modelli cellulari. Pannello NGS-37geni per lo studio pilota: Il pannello è stato disegnato mediante tecnologia Illumina TruSeq Custom Amplicon Studio Design Illumina ed include 37 geni malattia. Il processo di validazione ha evidenziato che i geni sono stati tutti analizzati con una copertura >90%. C9ORF Gene I dent if ied Variant (Prot ein ef f ect ) rs MAF (%) FUS TDP43 Altri SOD1 FALS 10%. Malattia mendeliana monogenica con eziopatogenesi nota 50% FALS GENETICAMENTE NON DEFINITI Casistica: nella nostra banca DNA dal 1995 abbiamo raccolto 250 casi familiari e 1100 casi sporadici di SLA Risultati: Lo studio pilota con pannello NGS-37 geni è stato condotto sul DNA di 26 pazienti SLA (13 FALS e 13 SALS). Il 1° processo di filtraggio secondo i criteri di qualità produce una media di 500 varianti per campione. Il 2° processo di filtraggio che permette di escludere varianti introniche non splicing e polimorfismi noti con MAF>1%, genera una media di 20 varianti per campione. La sucessiva analisi di elaborazione dei dati ha permesso di identificare 7 soggetti con mutazioni di possibile significato patologico (vedi tabella). Si tratta di varianti estramente rare di cui una sola precedentemente descritta in letteratura (p.R155C nel gene VCP). Pt # SOD1 GENE C9ORF72 SOD1 TARDBP FUS FALS ANALIZZATI 138 231 156 139 FALS MUTATI 35 37 13 8 FREQUENZA 25.36% 16.02% 8.33% 5.76% GENE C9ORF72 SOD1 TARDBP FUS SALS ANALIZZATI 376 880 161 260 SALS MUTATI 18 25 9 4 FREQUENZA 4.79% 2.84% 5.59% 1.54% Pannello NGS-80 geni per lo studio di forme SLA/FTD e altre malattie del motoneurone: Polyphen- 2 1292 OPTN p. A481V rs37219791 0.0077 damaging SALS 1294 SQSTSM1 p. K238E rs11548633 0.2614 damaging SALS 1204 GARS p.R 101K rs200887429 0.0168 damaging FALS 1247 GARS p. T268I rs2230310 0.4831 damaging SALS 1240 VCP p. R155C rs121909330 Damaging FALS Described in ALS in Watts (2004), Nature Genetics Conclusioni: La messa a punto e la validazione di un pannello NGS per lo studio di geni coinvolti nella patogenesi della SLA e di altre malattie del motoneurone è di grande utilità in quanto potrà essere applicato per analizzare da un punto di vista genetico non solo le forme familiari ma anche le forme sporadiche che in questa patologia costituiscono più dell’ 80% delle casistiche. Il pannello NGS potra essere applicato sia per fini diagnostici (per l’analisi dei geni più comunemente associati a queste patologie), che per scopi di ricerca per l’identificazione di varianti rare che possano contribuire a spiegare la quota di eredità mancante nelle forme sporadiche. L’utilizzo di un pannelloNGS, implementabile via via che nuovi geni malattia saranno identificati permetterà una migliore e più precisa definizione diagnostica di queste forme anche nei loro fenotipi non canonici, rendendo possibile l’ottimizzazione dei disegni terapeutici di medicina molecolare rendendo di fatto attuabile nella pratica clinica questo approccio terapeutico. 1279 DCTN1 p. F652C not reported 1300 SIGMAR1 p.R208W rs11559048 0.7151 damaging FALS damaging SALS Alessia Castucci Viviana Pensato Barbara Castellotti XLV CONGRESSO NAZIONALE 11-14 OTTOBRE 2014 – CAGLIARI 301
