Apoptosi v Vogt, 1842: la morte cellulare è parte del normale sviluppo
v Lockshin and Williams, 1965: propongono il termine morte
cellulare programmata (Programmed Cell Death, PCD)
osservando che alcune cellule destinate a morire
durante la metamorfosi di anfibi e insetti sembrano essere
guidate da un programma intrinseco alla cellula stessa
v Kerr, Wyllie and Currie, 1972: introducono il termine
apoptosi (dal greco antico: come il cadere delle foglie) per
descrivere la morte cellulare associata con una serie di
caratteristiche morfologiche comuni e ben definite
v Horvitz and Sulston, fine degli anni 70: caratterizazione
genetica dei componenti critici che regolano i meccanismi
apoptotici utilizzando il nematode C.elegans (premio Nobel
per la medicina 2001)
Lo studio dell’apoptosi in C. elegans
v Durante lo sviluppo di C. elegans, si formano
1090 cellule: di queste, 959 resteranno a
far parte del verme adulto (postmitoticamente), e 131 vanno incontro ad
apoptosi.
v Ricerca di mutazioni in cui il pattern di
morte cellulare é alterato: identificazione
di regolatori apoptotici poi ritrovati anche
in mammiferi
Ø Ced-3 e ced-4: mutazioni che li
inattivano portano alla
conservazione di tutte e 131 le
cellule “condannate a morte”
Ø Ced-9: mutazioni che inattivano
ced-9 portano a morte cellulare
estesa a tutte le cellule, livelli
aumentati di espressione di ced-9
bloccano l’apoptosi.
Apoptosi
Ø é un “suicidio” che implica una reazione “attiva” della
cellula
Ø può verificarsi sia in seguito a stimoli esterni (agenti
chimici, fisici, ormoni, citochine, farmaci) che a
stimoli endogeni (turnover cellulare,
differenziamento terminale, rimodellamento
durante sviluppo e morfogenesi)
Evoluzione dell’apoptosi
v L’apoptosi esiste in tutti gli organismi pluricellulari
v Organismi monocellulari: presente in forme piú o
meno simili anche nei batteri, forse in difesa
contro infezioni virali (che a loro volta hanno
escogitato numerosi mezzi per inattivare il
programma apoptotico endocellulare)
Peculiarità del processo apoptotico:
Ø una cascata di reazioni si susseguono in un ordine
stereotipato al fine di “terminare” la vita cellulare
Ø molte di queste reazioni sono “bloccabili” in punti ben
precisi sia dall’esterno (agenti farmacologici o
inibitori di natura sintetica) che dall’interno
(modulazione di geni endogeni)
Ø i residui cellulari restano vengono eliminati
rapidamente da fagociti, professionali e non,
evitando l’innesco di una reazione infiammatoria
Un problema esistenziale:
Perché una cellula dovrebbe suicidarsi?
A volte la morte cellulare rappresenta un evento positivo per l’organismo
1. L’apoptosi é richiesta per un normale
sviluppo embrionale
2. L’apoptosi é necessaria per la distruzione
di cellule che rappresentano una minaccia
per l’integritá dell’organismo
Apoptosi, sviluppo embrionale e differenziamento
v Metamorfosi: il riassorbimento della coda
del girino
v Sviluppo: apoptosi delle cellule occupanti lo
spazio interdigitali, formazione delle
appropriate sinapsi neuronali;
v Differenziamento: turnover fisiologico delle
cellule “mature” in tessuti continuamente
proliferanti (p.es., cellule intestinali, neutrofili)
Apoptosi e “difesa” dell’organismo
v Contro cellule infettate da virus (ad opera
di linfociti T citotossici);
v Contro cellule del sistema immune
autoreattive;
v Contro cellule in cui si verifica un danno al
DNA;
v Contro cellule tumorali.
Caratteristiche morfologiche dell’apoptosi
Ø Diminuzione del volume cellulare (perdita di liquidi
intracellulari per processi attivi mediati dalle
pompe di membrana)
Ø Condensazione e marginalizzazione della cromatina e
frammentazione della stessa
Ø Formazione di protuberanze (blebs) citoplasmatiche,
delimitate da membrana (esposizione di PS) e
contenenti frammenti di cromatina condensata e
di organelli cellulari -> corpi apoptotici
La cellula in apoptosi subisce modificazioni
morfologiche e biochimiche che portano alla sua
frammentazione e ne favoriscono la fagocitosi
normali
apoptotiche
La “scale.a” di DNA frammentato di una cellula apopto8ca Normal Cell
Cell shrinkage away
from neighbouring cells
Plasma membrane blebbing
Cytoplasmic and nuclear condensation
Margination of condensed
chromatin
Nuclear and cellular
fragmentation
Apoptotic Bodies
Phagocytosis
Differenze morfologiche fra apoptosi e necrosi Membrane
breaks down
resulting in an
inflammatory
response!
Edema!
Membrane
intact until
phagocytosed !
Pyknosis!
Morphological Differences between Apoptosis and Necrosis
Apoptosis
vs
Necrosis
Nuclei
Dense Condensation of
Chromatin
Irregular Chromatin
Clumping
Cytoplasmic
Organelles
Morphologically Intact
Disrupted
Cell Membrane
Apoptotic Bodies,
Blebbing
Blebbing and Loss of
integrity
Cell Volume
Cells shrink
Cells swell
In Tissues
Single Cells Affected
Groups of Cells Affected
Tissue Response
None
Inflammation
Necrosi vs apoptosi Distruzione causata da una bomba (Nagasaki, 1945) Demolizione di un rudere Che cosa succede quando
l’apoptosi non funziona?
Il KO per Apaf-­‐1 arresta lo sviluppo embrionale Mancanza di apoptosi interdigitale Mancanza di aLvazione della caspasi 3 Diminuita apoptosi in vitro di cellule Apaf-­‐1 -­‐/-­‐ Ruolo dell’apoptosi nella tumorigenesi
Aumento della sopravvivenza cellulare e riduzione dell’apoptosi nell’oncogenesi
• mutatazione di geni oncosoppressori p53 (50% dei tumori umani )
• Iperespressione di Bcl-2 in alcune leucemie and linfomi B.
• Perdita di espressione del fattore attivante l’apoptosi (Apaf-1) nel melanoma
Malattie Associate a deregolazione dell’ Apoptosi
Aumento Apoptosi
AIDS
Malattie Neurodegenerative
malattia di Alzeheimer,
Morbo di Parkinson,
Malattia di Huntington
Inhibizione Apoptosi
Cancro
linfoma Follicolare
carcinomi con mutazione di p53
Malattie Autoimmuni
Lupus erytematoso Sistemico
Infectioni Virali
Herpesvirus, poxvirus, adenovirus
Ruolo dell’ apoptosi nelle Malattie Neurodegenerative
• Apoptosi fisiologica durante lo sviluppo embrionale del
cervello innescata dall’assenza di fattori di crescita
• Tossicità di aggregati di proteine con anomalie strutturali
possono innescare apoptosi nella malattia di
Alzeheimer, nel morbo di Parkinson, nella malattia di
Huntington (Caspasi 9 attivata nel cervello degli alzheimeriani)
amyloid-β
IC Ca2+
Oxidative stress
Neuronal
Receptors
Apoptosis
Aggregati -Huntington
FADD/
Caspase 8
Apoptosis
Le fasi del programma apoptotico
1. Decisione se iniziare o meno la procedura
di “suicidio” cellulare
2. Passaggio del “punto di non
ritorno” (“commitment”)
3. L’esecuzione
Via intrinseca Via estrinseca La decisione ed il passaggio del “punto
di non ritorno
v Proteine regolatorie hanno il compito di
“integrare” i segnali pro- ed anti-apoptotici, e a
seconda delle circostanze intra- ed extra-cellulari
avviare o meno l’esecuzione
1. Adattatori, in grado di trasdurre direttamente
segnali apoptotici agli “esecutori”
2. Regolatori della funzionalitá mitocondriale
(membri della famiglia Bcl-2)
Il mitocondrio
Ø Fasi precoci -> mantenimento della funzionalità
mitocondriale
Ø Rilascio di proteine normalmente residenti
all’interno del mitocondrio (citocromo c, Smac,
HtrA2/Omi, AIF)
Ø Caduta del potenziale di membrana mitocondriale
e perdita della permeabilità della stessa (caspasimediata)
Ø Collassamento e/o fissione dei mitocondri
Il citocromo c
Ø normalmente risiede nello spazio fra la membrana interna ed
esterna mitocondriale e funziona nel pathway respiratorio
mitocondriale
Ø viene rilasciato dai mitocondri nel cytosol dopo stimoli apoptotici
Ø forma un complesso con Apaf-1 (l’omologo di Ced-4) e procaspasi 9
(inattiva) in presenza di ATP -> apoptosoma, che porta ad autoattivazione della procaspasi 9 -> innesco della fase di esecuzione
Ø il rilascio precede i cambiamenti morfologici, è un fenomeno del
tipo “tutto-o-nulla” ed è rapidissimo e sincrono (meno di 5 minuti)
Ø varie ipotesi per la via d’uscita: Bax-channels, megacanale
mitocondriale (o PTP, permeability transition pore)
apoptosoma Apaf-1
WD-40 Repeats
CARD CED-4
dATP
*cytochrome c
dADP
Pro-caspase-3/-7
Apaf-1
unfolding
Pr
o
L
S
*
* *
S
L
CARD
CARD
*
L
Pro-caspase-9
S
Active
caspase-9
Active
caspase-3/-7
Altre proteine rilasciate dal mitocondrio
v Smac/Diablo
v HtrA2/Omi
v AIF: proteina dello spazio intermembrana ->
nucleo -> cambiamenti nella morfologia nucleare
associati all’apoptosi (caspasi-indipendente)
Coinvolto nell’apoptosi solo in seguito a particolari
stimoli (necessario per la cavitazione nei primi
stadi embrionali)
v EndoG: proteina dello spazio intermembrana ->
nucleo -> cambiamenti nella morfologia nucleare
associati all’apoptosi
CITOPLASMA NUCLEO ICAD ICAD CAD caspasi-­‐3
CAD Frammentazione DNA EndoG AIF HMW + oligonuclosomi Condensazione croma8na +HMW Regolazione mitocondriale da parte della Bcl2 family
membri pro-apoptotici si legano
al PTP —> apertura —> rilascio
del citocromo c
membri anti-apoptotici si legano
al PTP —| apertura
BH3-only inducono la
oligomerizzazione di Bax o Bak sul
mitocondrio —> canale —> rilascio
del citocromo c
membri anti-apoptotici —|
oligomerizzazione e formazione del
canale
La rimozione dei “cadaveri”
Pathways anti-apoptotici
Altre forme di morte cellulare Necroptosi, entosi La necroptosi • Innescata da s8moli che più frequentemente inducono apoptosi: – legame di un ligando ai death receptors (processo quindi regolato) • Non richiede fuoriuscita di citocromo C, nè aLvazione di caspasi nè coinvolge Bcl2 family • La membrana cellulare perde permeabilità, non c’è frammentazione nucleosomale del DNA, c’è perdita di funzionalità mitocondriale – tuL fenomeni simili alla morte per necrosi Possibili meccanismi molecolari • Danno cellulare che aLva s8moli pro-­‐
apopto8ci (p.es. aLvazione dei death receptors) – cellula che avvia il processo apopto8co • Contemporaneamente, il danno cellulare porta a disfunzione mitocondriale e perdita del pool di ATP – l’apoptosi non può procedere, e quindi la cellula prosegue il suo cammino verso la morte per necrosi L’adesione cellulare può portare alla inges8one di una cellula da parte della vicina Cara.eris8che dell’entosi • L’adesione intercellulare (mediata da caderine ed altre molecole) è regolata dall’interazione delle cellule epiteliali con la matrice extracellulare, che orienta e limita le interazioni cellula-­‐cellula • In par8colari condizioni in cui le cellule epiteliali non aderiscono alla matrice extracellulare, ci può essere un processo “estremo” di adesione che porta all’inges8one cellulare • Nelle prime fasi, il processo è reversibile e la cellula ingerita è vitale • La cellula ingerita (“entocita”) viene quindi degradata per fusione con i lisosomi dell’ospite • Un meccanismo di protezione an1-­‐metasta1co? Tra la vita e la morte L’Autofagia Cara.eris8che Autophagy is a response to nutrient stress to maintain adequate internal levels of nutrients (self-­‐
cannibaliza8on). Role in cell death is best revealed if apoptosis is disabled (bax/bak-­‐/-­‐, caspase inhibitors, Bcl-­‐xL++). In nutrient-­‐poor condi8ons (or equivalent effects on mTOR signaling), autophagy maintains survival. In nutrient-­‐rich condi8ons, autophagy promotes cell death in response to other types of stress. Sopravvivenza o morte cellulare? • Nella maggior parte delle circostanze, l’autofagia cos8tuisce un meccanismo di ada.amento allo stress • Le modalità con cui l’autofagia si trasforma in un processo di morte cellulare non sono chiare – anche dopo estensiva auto-­‐cannibalizzazione in assenza di fa.ori di crescita, le cellule possono recuperare se trasportate in condizioni adeguate • Non ci sono evidenze che geni coinvol8 nel processo di autofagia siano implica8 in processi di morte cellulare fisiologica (es. sviluppo embrionale) – nematodi KO per bec-­‐1, ortologo di ATG6/beclina 1 e topi KO per la beclina 1 hanno un numero maggiore di cellule apopto8che Autophagy/xenophagy • Autophagy “eat oneself” • Xenophagy “eat foreign maGer” • Highly conserved and regulated process that maintains cellular homeostasis and protects cells against starvaKon and microbe invasion 3 Stages • IniKaKon: nutrient starvaKon, growth factor-­‐mediated starvaKon • ExecuKon • MaturaKon Nature reviews microbiology 2004 2:301 Autophagic process • Cytoplasmic organelles and porKons of cytoplasm sequestered in double membrane-­‐
bound vacuoles • Source of membrane mulKfactorial (ribosome-­‐
free ER?) • Fuse with lysosomes Science 2004 306:990 Nature reviews microbiology 2004 2:301 Ultrastructural examples of apoptotic and autophagic cell death
Levine, B. et al. J. Clin. Invest. 2005;115:2679-­‐2688 Copyright ©2005 American Society for Clinical Investigation
Lum et al., 2005 IniKaKon:Signaling pathways •
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Trimeric G proteins Growth receptors PI3K (classes I & III) protein phosphatases mTOR ExecuKon • Requires covalent-­‐conjugaKon pathways • Requires Atg3, Atg7, Atg10 – Homologs of ubiquiKnylaKon proteins – Modifies pathway components but does not target them for degradaKon • ProducKon of PIP3 via hVPS34 (class III PI3K) – Inhibited by wortmanin, 3-­‐Methyladenine – Promotes proteolysis-­‐>producKon of amino acids • Complex formed between hVPS34, Atg14, & Atg6 (Beclin-­‐1) which is necessary for downstream recruitment and localizaKon of Atg5 & Atg12 • Covalent linkage of Atg5 and Atg12 on pre-­‐autophagosomal membrane • Protease cleavage of Atg8 (MAP1 Light chain 3 (LC3), followed by covalent lipidaKon to phosphaKdylethanolamine and translocaKon to autophagosome membrane Fusion • Autophagosomes fuse with endosomes • Acquire characterisKcs of lysosomes – LAMP1 & 2 – Accessible to DAMP – Cathepsins, acid phosphatases • Vesicle fusion mediated by Rabs (Rab24) Involved in many processes • ATG6/Beclin 1: tumour suppressor gene – Deleted in sporadic breast, ovarian, prostate CA •
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Dauer formaKon in C. elegans ATG5 & ATG7: Dictyostelium nitrogen starvaKon Prevent premature senescence Host defense against pathogen invasion Autofagia ed omeostasi cellulare • L’autofagia è coinvolta nella eliminazione di proteine danneggiate che se accumulate possono portare alla formazione di aggrega8 • Eliminazione di organelli malfunzionan8 • Mentre l’eliminazione di proteine può essere svolta anche da altri sistemi (proteasoma), l’autofagia è l’unico processo cellulare che può portare alla degradazione di interi organelli (mitocondri, perossisomi, ecc.) Autofagia e malaLe neurodegenera8ve • Autofagosomi si accumulano nel cervello dei pazien8 affeL da diverse malaLe degenera8ve – inizialmente, l’autofagia ritenuta come un meccanismo patogene8co e scatenante la morte cellulare – a.ualmente, almeno nei modelli animali è chiaro che l’autofagia rappresenta un meccanismo di difesa e l’accumulo di autofagosomi una risposta fisiologica e di tenta8vo di clearance delle componen8 cellulari danneggiate Microbes & autophagy • Diverse strategies – Host defense – Bacterial manipulate it to survive intracellularly Nature reviews microbiology 2004 2:301 Autofagia e cancro • La dimostrazione che il gene per la beclina è perso in diversi tumori e quindi è un candidato oncosoppressore ha portato ad ipo8zzare che l’autofagia sia un meccanismo prevalentemente di difesa contro i tumori • L’autofagia però può anche promuovere la sopravvivenza delle cellule tumorali in condizioni di stress (mancanza di nutrien8, tra.amen8 farmacologici) Modelli animali di studio del rapporto fra autofagia e cancro • Solo una copia di bec-­‐1 (beclina) è persa nei tumori mammari • Topi bec-­‐1 +/-­‐: diminuita autofagia, aumento della frequenza di diversi 8pi di tumori • Due altri gene oncosoppressori (PTEN e p53) s8molano l’autofagia inibendo la funzione di TOR Autofagia ed invecchiamento • Il digiuno intermi.ente promuove la longevità • La dieta (restrizione calorica) è un indu.ore di autofagia in tu.e le specie • La aumentata longevità indo.a da restrizion calorica non viene mantenuta se vi è inaLvazione dell’autofagia – modelli animali semplici (verme, moscerino) • Vi è una diminuita espressione dei geni “autofagici” con l’aumentare dell’età ALvazione dell’autofagia aumenta la longevità nei mammiferi Gli animali sono sta8 tra.a8 con rapamicina –inibitore di mTOR e quindi aLvatore dell’autofagia-­‐ a par8re da 600 giorni di età (adulta-­‐inizio della vecchiaia). I topi sopravvivono Più a lungo dopo tra.amento (meccanismi molecolari ancora da definire).
