Che cosa succede quando
l’apoptosi non funziona?
Il KO per Apaf‐1 arresta lo sviluppo embrionale
Mancanza di apoptosi interdigitale
Mancanza di attivazione della caspasi 3
Diminuita apoptosi in vitro di cellule Apaf‐1 ‐/‐
Ruolo dell’apoptosi nella tumorigenesi
Aumento della sopravvivenza cellulare e riduzione dell’apoptosi nell’oncogenesi
• mutatazione di geni oncosoppressori p53 (50% dei tumori umani )
• Iperespressione di Bcl-2 in alcune leucemie and linfomi B.
• Perdita di espressione del fattore attivante l’apoptosi (Apaf-1) nel melanoma
Malattie Associate a deregolazione dell’ Apoptosi
Aumento Apoptosi
AIDS
Malattie Neurodegenerative
malattia di Alzeheimer,
Morbo di Parkinson,
Malattia di Huntington
Inhibizione Apoptosi
Cancro
linfoma Follicolare
carcinomi con mutazione di p53
Malattie Autoimmuni
Lupus erytematoso Sistemico
Infectioni Virali
Herpesvirus, poxvirus, adenovirus
Ruolo dell’ apoptosi nelle Malattie Neurodegenerative
• Apoptosi fisiologica durante lo sviluppo embrionale del
cervello innescata dall’assenza di fattori di crescita
• Tossicità di aggregati di proteine con anomalie strutturali
possono innescare apoptosi nella malattia di
Alzeheimer, nel morbo di Parkinson, nella malattia di
Huntington (Caspasi 9 attivata nel cervello degli alzheimeriani)
amyloid-β
IC Ca2+
Oxidative stress
Neuronal
Receptors
Apoptosis
Aggregati -Huntington
FADD/
Caspase 8
Apoptosis
Malattie neurodegenerative e disfunzione mitocondriale
• Perdita progressiva di neuroni:
– disturbi della memoria, problemi motori, deficit cognitivi e comportamentali ‐>demenza ‐>morte
• Fattori di rischio: – età, ambiente (tossine, alcool), malattie genetiche
• In molte patologie, qualunque sia l’evento molecolare responsabile, la disfunzione mitocondriale risultante porta a morte cellulare ed al quadro di malattia
Iperattività del nucleo subtalamico/globus pallidus
Evidenze di disfunzione mitocondriale
• Anni ‘80: un gruppo di designer tossicodipendenti mostra PD dopo esposizione a MPTP, che contamina alcuni lotti di eroina:
– un metabolita del MPTP entra nei neuroni dopaminergici e inibisce la respirazione mitocondriale (complesso mitocondriale I):
• stress ossidativo da produzione di ROS, aumento dei livelli di Ca++ intracellulare, diminuita produzione di energia, danno neuronale e morte
• Il rotenone (che inibisce il complesso mitocondriale I) causa PD nei roditori;
• Mutazioni nel mtDNA causano morte neuronale
Identificazione di geni coinvolti in PD
• Rare forme di PD ereditario hanno portato alla identificazione di mutazioni geniche nei pazienti:
– alpha‐sinucleina
– parkine
– PINK1
– LRRK2
alpha‐Sinucleina
• Fibrille di a‐Syn sono la maggior componente dei corpi di Lewy anche nei pazienti affetti da PD classico (non ereditario)
• Mutazioni specifiche del gene per la a‐Syn sono state identificate in alcuni casi ereditari
• Funzione normale: coinvolta nella plasticità
sinaptica
Ruolo della a‐Syn nel PD
• Modelli animali:
– topo: difficile da studiare per la ridondanza fra due geni (alpha e beta), dati non consistenti
– Drosophila: iperespressione di a‐Syn porta a perdita di neuroni dopaminergici, inclusioni fibrillari intracellulari e sintomi locomotori
• a‐Syn sembra coinvolta nel normale funzionamento dell’ER/Golgi:
– la dopamina può generare ROS dopo ossidazione da parte delle monoaminoossidasi (MAO), per questo dopo la sintesi viene immediatamente immagazzinata in vescicole sinaptiche
– Difetti dell’ER/Golgi portano ad un aumento dei livelli di dopamina ed accumulo di ROS, causa di danno mitocondriale
Parkine
• Ubiquitina‐ligasi che catalizza la ubiquitinazione di proteine danneggiate e la loro degradazione da parte del proteasoma
• Perdita di funzione delle parkine: accumulo di proteine danneggiate (vari substrati identificati di cui alcuni mitocondriali)
– danno secondario al mitocondrio (i mitocondri appaiono severamente danneggiati), non chiari i meccanismi
PINK1
• Unica proteina associata a PD che localizza ai mitocondri, collegando chiaramente la sua funzione alterata a disfuzione mitocondriale
• è una chinasi recentemente identificata, in corso di caratterizzazione
• in Drosophila, mutazioni di PINK portano a perdita di neuroni dopaminergici ed aumentato stress ossidativo
Altre forme di morte cellulare
Necroptosi, entosi
La necroptosi
• Innescata da stimoli che più frequentemente inducono apoptosi:
– legame di un ligando ai death receptors (processo quindi regolato)
• Non richiede fuoriuscita di citocromo C, nè
attivazione di caspasi nè coinvolge Bcl2 family
• La membrana cellulare perde permeabilità, non c’è frammentazione nucleosomale del DNA, c’è
perdita di funzionalità mitocondriale
– tutti fenomeni simili alla morte per necrosi
Possibili meccanismi molecolari
• Danno cellulare che attiva stimoli pro‐
apoptotici (p.es. attivazione dei death receptors)
– cellula che avvia il processo apoptotico
• Contemporaneamente, il danno cellulare porta a disfunzione mitocondriale e perdita del pool di ATP
– l’apoptosi non può procedere, e quindi la cellula prosegue il suo cammino verso la morte per necrosi
L’adesione cellulare può portare alla ingestione di una cellula da parte della vicina
Caratteristiche dell’entosi
• L’adesione intercellulare (mediata da caderine ed altre molecole) è regolata dall’interazione delle cellule epiteliali con la matrice extracellulare, che orienta e limita le interazioni cellula‐cellula
• In particolari condizioni in cui le cellule epiteliali non aderiscono alla matrice extracellulare, ci può essere un processo “estremo” di adesione che porta all’ingestione cellulare
• Nelle prime fasi, il processo è reversibile e la cellula ingerita è vitale
• La cellula ingerita (“entocita”) viene quindi degradata per fusione con i lisosomi dell’ospite
• Un meccanismo di protezione anti‐metastatico?
Tra la vita e la morte
L’Autofagia
Caratteristiche
Autophagy is a response to nutrient stress to maintain adequate internal levels of nutrients (self‐
cannibalization).
Role in cell death is best revealed if apoptosis is disabled (bax/bak‐/‐, caspase inhibitors, Bcl‐xL++).
In nutrient‐poor conditions (or equivalent effects on mTOR signaling), autophagy maintains survival.
In nutrient‐rich conditions, autophagy promotes cell death in response to other types of stress.
Sopravvivenza o morte cellulare?
• Nella maggior parte delle circostanze, l’autofagia costituisce un meccanismo di adattamento allo stress
• Le modalità con cui l’autofagia si trasforma in un processo di morte cellulare non sono chiare
– anche dopo estensiva auto‐cannibalizzazione in assenza di fattori di crescita, le cellule possono recuperare se trasportate in condizioni adeguate
• Non ci sono evidenze che geni coinvolti nel processo di autofagia siano implicati in processi di morte cellulare fisiologica (es. sviluppo embrionale)
– nematodi KO per bec‐1, ortologo di ATG6/beclina 1 e topi KO per la beclina 1 hanno un numero maggiore di cellule apoptotiche
Autophagy/xenophagy
• Autophagy “eat oneself”
• Xenophagy “eat foreign matter”
• Highly conserved and regulated process that maintains cellular homeostasis and protects cells against starvation and microbe invasion
• 3 types: – macro‐autophagy
– Microautophagy
– chaperone‐mediated autophagy
Autophagic process
• Cytoplasmic organelles and portions of cytoplasm sequestered in double membrane‐
bound vacuoles • Source of membrane multifactorial (ribosome‐
free ER?)
• Fuse with lysosomes
Science 2004 306:990
Nature reviews microbiology 2004 2:301
Ultrastructural examples of apoptotic and autophagic cell death
Levine, B. et al. J. Clin. Invest. 2005;115:2679‐2688
Copyright ©2005 American Society for Clinical Investigation
Lum et al., 2005
3 Stages
• Initiation: nutrient starvation, growth factor‐mediated starvation
• Execution
• Maturation
Nature reviews microbiology 2004 2:301
Initiation:Signaling pathways
•
•
•
•
•
Trimeric G proteins
Growth receptors
PI3K (classes I & III)
protein phosphatases
mTOR
Execution
•
•
•
•
•
•
Requires covalent‐conjugation pathways
Requires Atg3, Atg7, Atg10
– Homologs of ubiquitinylation proteins
– Modifies pathway components but does not target them for degradation
Production of PIP3 via hVPS34 (class III PI3K)
– Inhibited by wortmanin, 3‐Methyladenine
– Promotes proteolysis‐>production of amino acids
Complex formed between hVPS34, Atg14, & Atg6 (Beclin‐1) which is necessary for downstream recruitment and localization of Atg5 & Atg12
Covalent linkage of Atg5 and Atg12 on pre‐autophagosomal membrane
Protease cleavage of Atg8 (MAP1 Light chain 3 (LC3), followed by covalent lipidation to phosphatidylethanolamine and translocation to autophagosome membrane
Fusion
• Autophagosomes fuse with endosomes
• Acquire characteristics of lysosomes – LAMP1 & 2
– Accessible to DAMP
– Cathepsins, acid phosphatases
• Vesicle fusion mediated by Rabs (Rab24)
Involved in many processes
• ATG6/Beclin 1: tumour suppressor gene
– Deleted in sporadic breast, ovarian, prostate CA
•
•
•
•
Dauer formation in C. elegans
ATG5 & ATG7: Dictyostelium nitrogen starvation
Prevent premature senescence
Host defense against pathogen invasion
Autofagia ed omeostasi cellulare
• L’autofagia è coinvolta nella eliminazione di proteine danneggiate che se accumulate possono portare alla formazione di aggregati
• Eliminazione di organelli malfunzionanti
• Mentre l’eliminazione di proteine può essere svolta anche da altri sistemi (proteasoma), l’autofagia è
l’unico processo cellulare che può portare alla degradazione di interi organelli (mitocondri, perossisomi, ecc.)
Autofagia e malattie neurodegenerative
• Autofagosomi si accumulano nel cervello dei pazienti affetti da diverse malattie degenerative
– inizialmente, l’autofagia ritenuta come un meccanismo patogenetico e scatenante la morte cellulare
– attualmente, almeno nei modelli animali è chiaro che l’autofagia rappresenta un meccanismo di difesa e l’accumulo di autofagosomi una risposta fisiologica e di tentativo di clearance delle componenti cellulari danneggiate
Microbes & autophagy
• Diverse strategies
– Host defense
– Bacterial manipulate it to survive intracellularly
Nature reviews microbiology 2004 2:301
Autofagia e cancro
• La dimostrazione che il gene per la beclina è perso in diversi tumori e quindi è un candidato oncosoppressore ha portato ad ipotizzare che l’autofagia sia un meccanismo prevalentemente di difesa contro i tumori
• L’autofagia però può anche promuovere la sopravvivenza delle cellule tumorali in condizioni di stress (mancanza di nutrienti, trattamenti farmacologici)
Modelli animali di studio del rapporto fra autofagia e cancro
• Solo una copia di bec‐1 (beclina) è persa nei tumori mammari
• Topi bec‐1 +/‐: diminuita autofagia, aumento della frequenza di diversi tipi di tumori
• Due altri gene oncosoppressori (PTEN e p53) stimolano l’autofagia inibendo la funzione di TOR
Autofagia ed invecchiamento
• Il digiuno intermittente promuove la longevità
• La dieta (restrizione calorica) è un induttore di autofagia in tutte le specie
• La aumentata longevità indotta da restrizion calorica non viene mantenuta se vi è inattivazione dell’autofagia – modelli animali semplici (verme, moscerino)
• Vi è una diminuita espressione dei geni “autofagici”
con l’aumentare dell’età
