Principi di genetica - Robert J. Brooker
Copyright © 2010 – The McGraw-Hill Companies srl
SOLUZIONI AI PROBLEMI DEL CAPITOLO 6
Domande concettuali
C1. Questi processi sono simili tra loro, nel senso che del materiale genetico viene trasferito da una
cellula batterica a un’altra. La differenza principale è il meccanismo alla base del trasferimento.
Nella coniugazione due cellule entrano in contatto e il materiale genetico viene replicato e trasferito
da una cellula all’altra. Nella trasduzione un virus infetta una cellula e produce nuove particelle
virali che possono contenere del materiale genetico del batterio; in seguito queste particelle sono
trasferite a una nuova cellula batterica. Infine, nella trasformazione dei segmenti di DNA sono
rilasciati da un batterio morto e incorporati in una cellula viva.
C2. Non si tratta di riproduzione sessuale, nella quale due parentali distinti producono gameti che si
uniscono per formare un nuovo individuo. Tuttavia, la coniugazione richiama la riproduzione
sessuale nel senso che il materiale genetico di due cellule viene mescolato in qualche modo. Nella
coniugazione non c’è mescolamento di due genomi (uno per gamete), ma si ha trasferimento di
materiale genetico da una cellula a un’altra. Questo trasferimento può alterare la combinazione dei
caratteri genetici nella cellula ricevente.
C3. Se nessuna cellula ha un vantaggio di crescita, ci attendiamo che alla fine la popolazione sia
rappresentata da cellule F+ . Questo perché a seguito della coniugazione tra una cellula F+ e una
cellula F– si ottengono due cellule F+. Perciò, la cellula F+ può convertire le cellule F– in F+, ma non
viceversa.
C4. Un ceppo F+ contiene un pezzo circolare di DNA separato dal cromosoma, e che possiede
un’origine di trasferimento. In un ceppo Hfr questa sequenza è integrata nel cromosoma batterico.
Un ceppo F+ può trasferire solo il DNA contenuto nel fattore F. Invece, se ha sufficiente tempo a
disposizione un ceppo Hfr può trasferire l’intero cromosoma batterico alla cellula ricevente.
C5. Il ruolo dell’origine di trasferimento è di fornire un sito di inizio per due eventi importanti: il
DNA viene inciso, e un’elica inizia il suo trasferimento in una cellula ricevente. La direzione del
trasferimento determinerà l’ordine di trasferimento dei geni. Per esempio, se l’origine si trova tra i
geni A e B, a seconda del suo orientamento sarà trasferito per primo il gene A oppure il
gene B.
C6. I pili sessuali promuovono il legame tra donatore e ricevente e forniscono una via per il
trasferimento del materiale genetico dal donatore alla cellula ricevente.
C7. Un segmento del cromosoma batterico normale può essere stato escisso accidentalmente in una
forma circolare. I fattori F possiedono una propria origine di replicazione e portano geni batterici.
C8. Sebbene le eccezioni siano comuni, il trasferimento genetico mediato dalla coniugazione non è
probabile perché le superfici cellulari non interagiscono correttamente. E’ anche improbabile il
trasferimento genetico interspecifico mediato dalla trasduzione, perché ogni specie batterica è
sensibile a fagi specifici. La risposta corretta è la trasformazione. Una conseguenza del
trasferimento genetico interspecifico è che da una specie batterica all’altra sono introdotti nuovi
geni. Per esempio il trasferimento genetico interspecifico può fornire al batterio ricevente nuovi
caratteri, come la resistenza a un antibiotico. Questo fenomeno viene definito dai biologi
evoluzionistici trasferimento genetico orizzontale, mentre il passaggio di geni da una generazione
alla successiva viene chiamato trasferimento genetico verticale.
Principi di genetica - Robert J. Brooker
Copyright © 2010 – The McGraw-Hill Companies srl
C9. In breve il ciclo litico prevede la produzione di nuove particelle virali. Il fago si appropria
dell’apparato sintetico della cellula batterica per produrre le nuove particelle virali. Infine le cellule
sono lisate, e vengono rilasciate le nuove particelle. Il ciclo lisogeno prevede l’integrazione del
DNA virale nel cromosoma della cellula ospite. Questo DNA integrato si chiama profago, e si
replica assieme al cromosoma batterico. Successivamente il profago può essere indotto ad avviare il
ciclo litico.
C10. La cotrasduzione è la trasduzione simultanea di due o più geni. La distanza tra questi geni
determina la frequenza dell’evento. Se due geni sono vicini la frequenza di cotrasduzione è
relativamente maggiore rispetto al caso di geni distanti.
C11. La maggior parte dei fagi P1 conterranno il materiale genetico del fago. Occasionalmente, un
fago conterrà una porzione del materiale genetico batterico.
C12. Se tra due geni si trova un sito che va spesso incontro a rottura, la frequenza di cotrasduzione
di questi due geni sarebbe molto inferiore all’atteso. Questo perché la rottura separerebbe i geni.
C13. Le varie fasi della trasformazione sono descritte nella Figura 6.11. Una cellula competente è in
grado di incorporare un frammento di DNA dall’ambiente. Diversi fattori influenzano la
competenza: temperatura, condizioni ioniche, condizioni nutrizionali.
C14. Il trasferimento di un plasmide coniugativo quale il fattore F.
C15. Un vantaggio dell’incorporazione di DNA esterno è che può rappresentare una fonte
nutrizionale. Le cellule batteriche possono usare i nucleotidi per la loro crescita e metabolismo.
L’integrazione del DNA nel cromosoma batterico (ossia la trasformazione) presenta il vantaggio di
conferire al batterio dei nuovi caratteri, che potrebbero essere favorevoli per la sopravvivenza. Per
esempio, se un batterio che non può metabolizzare il lattosio viene trasformato con geni lac+ esso
potrà sopravvivere in un terreno contenente lattosio come sola fonte di carbonio
C16.
A. Se ciò è avvenuto in un solo passaggio, la trasformazione è il meccanismo più probabile, perché
la coniugazione di solito non avviene tra specie diverse, in particolare specie poco correlate, e
specie differenti di solito non sono infettate dagli stessi fagi.
B. Potrebbe essere avvenuto in un solo passaggio ma è più probabile che ne siano stati coinvolti di
più.
C. L’uso degli antibiotici seleziona batteri che portano geni della resistenza. Se una popolazione
batterica viene esposta a un antibiotico, sopravvivranno solo quelli che portano i geni della
resistenza, e la loro proporzione aumenterà nelle generazioni successive.
C17. Il termine complementazione si riferisce al risultato fenotipico della combinazione di due
mutazioni in uno stesso individuo. Se due mutazioni difettive danno luogo a un fenotipo normale
quando combinate in uno stesso individuo, è avvenuta la complementazione. Ciò succede perché le
due mutazioni corrispondono a geni diversi e le varianti selvatiche sono dominanti. Se la
complementazione non avviene, allora le mutazioni difettive devono corrispondere allo stesso gene;
in questo caso, quando si combinano in uno stesso individuo manca la copia funzionale del gene.
C18. Il termine allele significa forme alternative dello stesso gene, perciò mutazioni nello stesso
gene portate da fagi diversi sono alleliche. Le mutazioni possono corrispondere a posizioni diverse
dello stesso gene. Quando viene mappata la distanza tra mutazioni dello stesso gene, si definisce la
Principi di genetica - Robert J. Brooker
Copyright © 2010 – The McGraw-Hill Companies srl
distanza tra mutazioni che creano differenti alleli dello stesso gene. Una mappa intragenica descrive
la posizione delle mutazioni dello stesso gene.
C19. Forse le mutazioni cadono esattamente nello stesso sito genico (ossia nello stesso nucleotide).
Per esempio, se un gene è composto da 500 nucleotidi i due ceppi potrebbero avere entrambi una
mutazione in corrispondenza del nucleotide numero 377.
Domande sperimentali
S1. Perché non si sono osservate colonie da 108 cellule dei ceppi met– bio– thr+ leu+ thi+ oppure
met+ bio+ thr– leu– thi– quando sono piastrati da soli.
S2. Mescola i due ceppi tra loro e piastrane alcuni su terreno contenente streptomicina, altri su
terreno che ne è privo. Se compaiono colonie su entrambe le piastre, allora significa che i geni thr+
leu+ thi+ sono stati trasferiti al ceppo met+ bio+ thr- leu- thi-. Se si osservano colonie solo sulla
piastra contenente streptomicina, allora sono stati trasferiti i geni met+ bio+ al ceppo met- bio- thr+
leu+ thi+. Questa risposta si basa sull’assunzione che esista una sola direzione di trasferimento da
donatore a ceppo ricevente.
S3. Il tubo a U consente di distinguere la coniugazione dalla trasduzione grazie alla dimensione dei
pori. Siccome i pori sono troppo piccoli per il passaggio dei batteri, questo impedisce il contatto
diretto dei due ceppi batterici. Tuttavia i virus possono attraversare i pori e infettare le cellule da un
parte all’altra del tubo a U. Per distinguere tra trasduzione e trasformazione ci vorrebbe un filtro
con pori troppo piccoli per i virus, ma in grado di far passare i frammenti di DNA. Questo non è
semplice, perché le differenze di dimensione tra frammenti di DNA e dei fagi non sono della stessa
entità di quelle tra batteri e fagi.
S4. Un esperimento di coniugazione interrotta è una procedura che consente a due ceppi batterici di
coniugare, interrompendo il processo a diversi intervalli di tempo. L’interruzione avviene agitando
la sospensione di batteri. Questo tipo di studio viene usato per la localizzazione genica. E’
necessario interrompere la coniugazione per dedurre l’ordine di trasferimento, sulla base della
durata della coniugazione stessa.
S5. Il tempo di ingresso è quello necessario per il trasferimento di un gene da un batterio all’altro.
Per determinarne il valore vanno condotte diverse misure a vari periodi di tempo, che sono poi
proiettate sull’asse delle x.
S6. Fai coniugare i due ceppi A e B con il ceppo F- resistente alla streptomicina e incapace di
metabolizzare il lattosio che hai in laboratorio. Questo avviene in due provette separate (ossia, il
ceppo A e il ceppo F- in una provetta, il ceppo B e il ceppo F- in una provetta diversa). Al termine
della coniugazione piastra le cellule su terreno contenente lattosio e streptomicina. Se ottieni
colonie, il ceppo ignoto era il ceppo A, che porta nel proprio fattore F i geni per il metabolismo del
lattosio.
S7.
Principi di genetica - Robert J. Brooker
Copyright © 2010 – The McGraw-Hill Companies srl
S8.
A. Se proiettiamo questi dati sull’asse delle x, il gene hisE interseca l’asse a circa 3 minuti, e il gene
pheA a circa 24 minuti. Questi sono valori relativi ai tempi di ingresso. Perciò la distanza tra i due
geni è di 21 minuti (24 meno 3).
B.
S9. Prima di tutto fai coniugare il ceppo resistente alla streptomicina con il ceppo che possiede i
geni per il metabolismo del lattosio. Puoi selezionare le cellule che hanno coniugato in un terreno
che contiene lattosio e streptomicina. Queste cellule inizialmente portano il gene di resistenza
all’antibiotico sul fattore F. Esponi queste cellule ad arancio di acridina in un terreno contenente
anche streptomicina. Questo permetterà la sopravvivenza delle rare cellule nelle quali il fattore F si
è integrato nel cromosoma batterico, divenendo cellule Hfr.
S10. Una possibilità è il trattamento del lisato P1 con la DNasi I, un enzima che digerisce il DNA
(nota: se si digerisce il DNA con DNasi I, viene distrutta la funzione di qualunque gene). Se il DNA
era contenuto nel fago P1, esso sarà protetto dalla digestione. Solo la trasformazione sarebbe inibita
dalla DNasi I, il che rende possibile distinguere tra i due processi. Una seconda possibilità è di
frazionare il lisato P1. Il DNA nudo è più piccolo del fago P1. Potresti filtrare il lisato per
rimuovere il DNA isolato, o potresti centrifugare il lisato e rimuovere la frazione più leggera che
contiene il DNA nudo.
S11. Puoi infettare E. coli con il fago lambda, e farlo crescere in condizioni che favoriscano il ciclo
lisogeno (ossia su terreno minimo). Puoi infettare il ceppo lisogeno di E. coli con il fago P1.
Occasionalmente il fago incorpora un frammento di DNA cromosomico batterico, e perciò anche il
DNA di lambda che era integrato nel cromosoma batterico. Il genoma di lambda infatti è
Principi di genetica - Robert J. Brooker
Copyright © 2010 – The McGraw-Hill Companies srl
sufficientemente piccolo da venire incorporato da P1. I fagi isolati dal ceppo lisogeno di E. coli
possono poi essere utilizzati per infettare un ceppo non lisogeno.
S12. Frequenza di cotrasduzione = (1 - d/L)3. Per il ceppo normale si ha (1 – 0,7/2)3 = 0,275 ossia
27,5%. Per il nuovo ceppo si ha (1 – 0,7/5)3 = 0,64 ossia 64,0%. Il vantaggio sperimentale è che
puoi mappare geni lontani più di 2 minuti.
S13. Frequenza di cotrasduzione = (1 – d/L)3 = (1 – 0,6 minuti/2 minuti)3 = 0,34, ossia 34%
S14. Frequenza di cotrasduzione = (1 - d/L)3.
0,53 = (1 – d/2)3
(1 – d/2)3 = 3√0,53
(1 – d/2) = 0,81
d = 0,38 minuti
S15. Concluderesti che i due geni sono distanti l’equivalente del 2% del cromosoma batterico.
S16.
A. Prima di tutto dobbiamo calcolare la frequenza di cotrasformazione, che equivale a 2/70 ossia
0,029.
Frequenza di cotrasformazione=(1 - d/L)3.
0,029=(1 – d/2)3
d=1,4 minuti
B. Frequenza di cotrasformazione=(1 - d/L)3.
0,029=(1 – 1, 4/4)3
d=0,27 minuti
Come potevi attenderti, la frequenza di cotrasformazione è molto più elevata quando la
trasformazione coinvolge frammenti più estesi di DNA.
S17. Una placca fagica di P1 contiene batteriofagi che hanno l’involucro e il DNA di P1.
Occasionalmente però un fago contiene un segmento di cromosoma batterico, compreso il materiale
dalle cellule di E. coli che sono state lisate.
S18. Benzer ha potuto usare questa osservazione per valutare se fosse avvenuta la ricombinazione
intragenica. Se due mutazioni rII producono un gene wild-type mediante la loro ricombinazione, il
fago dovrebbe produrre placche sul ceppo E. coli K12(λ).
S19. Tanto i mutanti rII quanto i fagi di tipo selvatico formano placche su E. coli B. Invece in E.
coli K12(λ) formano placche solo i rari ricombinanti wild-type. Se la preparazione fagica usata per
l’infezione di E. coli B non è stata diluita a sufficienza, verrà lisato l’intero tappeto batterico, per cui
risulterà impossibile contare il numero di placche.
S20. rIIA: L47 e L92; rIIB: L33, L40, L51, L62, L65, e L91.
S21. Dovresti seguire la strategia di Benzer descritta nella Figura AW6.1.1 dell’Approfondimento
web 6.1, anche se non ti servono due ceppi diversi di E. coli. Invece, dovresti fare crescere le cellule
a diverse temperature. Dovresti coinfettare il ceppo di E. coli con due dei fagi temperatura-sensibili
a farli crescere a 32°C. Dovresti reisolare i fagi come si vede nel passaggio 4 della Figura
AW6.1.1. Dovresti prendere un po’ di preparazione fagica, diluirla notevolmente (10–8), infettare E.
coli, e farla crescere a 32°C. Questo ti consente di quantificare la progenie fagica totale. Dovresti
inoltre prendere una parte della preparazione fagica, diluirla di poco (10–6), infettare E. coli, e farla
Principi di genetica - Robert J. Brooker
Copyright © 2010 – The McGraw-Hill Companies srl
crescere a 37°C. A questa temperatura crescerebbero solo i ricombinanti intragenici che
corrispondono a fagi wild-type.
S22. Benzer ha anzitutto determinato la natura individuale di ciascun gene, dimostrando che le
mutazioni dello stesso gene non complementano. In seguito egli mappò la distanza tra mutazioni
dello stesso gene, Le distanze di mappa definiscono ogni gene come un’unità lineare e divisibile
(dal crossing-over).
