Il ciclo cellulare
Giulia GuarguagliniIst. Biologia e Patologia Molecolari- CNR
[email protected]
04/05/2017
Organizzazione lezione -­‐ La divisione cellulare -­‐ Livelli di controllo del ciclo cellulare -­‐ La mitosi e i suoi livelli regola3vi -­‐ Alterazioni del ciclo cellulare e cancro Divisione cellulare La divisione cellulare: generare due cellule figlie iden4che alla madre Divisione cellulare La divisione cellulare nell’organismo: finalità ✓ Sviluppo ed accrescimento: da una singola cellula (oocita fecondato o zigote) all’individuo adulto SVILUPPO DELL’EMBRIONE ✓ Rinnovamento e riparazione dei tessu3: sos3tuzione delle cellule che muoiono per deterioramento o in seguito a even3 accidentali (frequenza variabile nei diversi 3pi cellulari) ✓ Gametogenesi: divisione meio3ca Divisione cellulare COME TRASMETTERE FEDELMENTE IL PATRIMONIO GENETICO ? Duplicare (senza errori!) prima di dividere 1 cellula (madre) 1 corredo cromosomico Replicazione del DNA divisione cellulare 2 corredi cromosomici iden3ci Segregazione dei cromosomi (Mitosi) 2 cellule figlie gene3camente iden3che alla madre 1 corredo cromosomico completo in ogni cellula figlia Divisione cellulare Due casi di divisioni non equivalen4 Meiosi II: segregazione dei cromosomi non preceduta da replicazione Divisione asimmetrica (cellule staminali): distribuzione non equivalente di componen3 cellulari Divisione cellulare Alterazioni della divisione cellulare: patogenesi (I) La perdita di controllo del ciclo di divisione cellulare è associata a tumorigenesi Divisione cellulare Alterazioni della divisione cellulare: patogenesi (II) Divisione cellulare “The Hallmarks of Cancer”
Hanahan and Weinberg, Cell 144:646 (2011)
Divisione cellulare Sistemi modello per lo studio del ciclo cellulare studi gene3ci Saccharomyces cerevisiae
Schizosaccharomyces pombe
studi biochimici Arbacia punctulata
Xenopus laevis
….. ed anche Drosophila melanogaster, C.elegans, zebrafish,…. Divisione cellulare Importanza delle colture cellulari nello studio della divisione cellulare Le cellule HeLa (cancro della cervice uterina) sono state le prime cellule umane immortalizzate (1951): capaci di dividersi in 24 ore in coltura, di crescere indefinitamente, resisten3 a spedizioni in ogni parte del mondo, hanno rivoluzionato la ricerca sulla divisione cellulare e le conseguenze delle sue alterazioni. La vita immortale di HenrieYa Lacks, Rebecca Skloot, Adelphi Divisione cellulare Colture cellulari 2D e 3D Le colture 2D, con adesione delle cellule alla superficie, non mantengono le caraYeris3che tridimensionali del tessuto. Sono quindi sta3 sviluppa3 metodi più complessi per crescere cellule umane in par3colari matrici che suppor3no la crescita 3D. Questo può essere par3colarmente importante per lo studio della crescita tumorale. Divisione cellulare Il ciclo di divisione cellulare: alternanza di Sintesi e Mitosi Controllo del ciclo cellulare Principi generale di regolazione del ciclo cellulare: -­‐ Monitoraggio delle condizioni extracellulari ed intracellulari -­‐ Azione coordinata di a`vatori e inibitori di processi specifici nel ciclo di divisione -­‐ Integrazione di livelli regola3vi mul3pli (espressione genica; modifiche post-­‐traduzionali; degradazione controllata) • Come decidere se entrare o meno in un ciclo di divisione? à Risposta a segnali esterni Divisione cellulare Controllo dell’entrata nel ciclo cellulare: il punto di restrizione Alla fine di ogni divisione cellulare la cellula figlia “decide” se entrare in un
nuovo ciclo di divisione o in una fase di “quiescenza” (talvolta associata con
processi di differenziamento).
I segnali esterni (fattori di crescita, stimoli proliferativi, presenza di cellule
circostanti) sono fondamentali per la scelta di dividersi.
Il punto di restrizione identifica il momento superato il quale la cellula
continua a dividersi indipendentemente dai segnali esterni.
• Come decidere se entrare o meno in un ciclo di divisione? à Risposta a segnali esterni • Come controllare la sequenza temporale del ciclo di divisione? à Meccanismi di checkpoint (segnali interni) Controllo del ciclo cellulare Il controllo del ciclo: meccanismi di checkpoint Checkpoint mito4co Integrità del fuso mito3co AYacco cromosomi-­‐microtubuli Checkpoint G2 Integrità del genoma (danno al DNA) Completa replicazione Go (Quiescenza) M (Mitosi) G2 (Gap2) S (Sintesi DNA) Checkpoint della fase S Problemi nella replicazione del DNA Punto di restrizione Condizioni ambientali e crescita cellulare G1 (Gap1) Checkpoint del danno al DNA Integrità del genoma I checkpoint del ciclo assicurano la correYa sequenza degli even3 ed arrestano la progressione del ciclo in presenza di errori, per permeYere alla cellula di completare il processo e/o riparare il danno. Se questo non è possibile, si a`verà un processo di morte cellulare programmata. • Come decidere se entrare o meno in un ciclo di divisione? à Risposta a segnali esterni • Come controllare la sequenza temporale del ciclo di divisione? à Meccanismi di checkpoint (segnali interni) • Come assicurare l’esecuzione delle fasi del ciclo di divisione? à Regolazione fine dell’a`vità dei faYori coinvol3 nei processi chiave Controllo del ciclo cellulare La progressione del ciclo cellulare: livelli regola4vi ✓ Espressione genica: a`vazione di geni specifici nel momento del ciclo in cui è richiesta la funzione del corrispondente prodoYo proteico ✓ Modifiche del prodoYo proteico (es. Fosforilazione): modulare la funzione di una proteina a seconda del momento del ciclo ✓ Degradazione proteica: eliminare in maniera controllata un faYore quando abbia espletato la sua funzione Controllo del ciclo cellulare Il controllo trascrizionale nel ciclo cellulare: l’esempio della famiglia dei faTori E2F Chen et al., Nat Rev Cancer. 2009 Geni che codificano per faYori richies3 in par3colari momen3 del ciclo sono espressi in maniera regolata durante il ciclo cellulare. Ad esempio mol3 geni necessari per la replicazione del DNA sono soYo il controllo di promotori che rispondono a faYori trascrizionali della famiglia E2F. Controllo del ciclo cellulare Due importan4 esempi di controllo dell’aUvità proteica Fosforilazione Cambiamen3 conformazionali: a`vazione Associazione con partner specifici Localizzazione Proteolisi Controllo del ciclo cellulare I complessi ciclina/cdk: una pietra miliare nello studio del ciclo cellulare Current Opinion in Cell Biology 25 Years Controllo del ciclo cellulare U4lizzo del lievito per iden4ficare regolatori del ciclo cellulare CaraYeris3ca 1: fasi del ciclo iden3ficabili morfologicamente CaraYeris3ca 2: facile isolamento di mutan3 Controllo del ciclo cellulare Screening di mutan4 cdc (cell division cycle) Mutan3 cdc si arrestano con una singola morfologia, che iden3fica il momento del ciclo. Controllo del ciclo cellulare Saggi di complementazione funzionale Lodish et al., 2004 Lee Hartwell nel 1970 trova che mutanti del lievito Saccharomyces cerevisiae sensibili alla
temperatura erano bloccati in punti specifici del ciclo e chiama questi mutanti cdc (cell division cycle
mutants); in particolare il mutante cdc28 arrestava il ciclo in un preciso punto che venne chiamato
Start, per superare il quale era necessario la proteina cdc28.
Controllo del ciclo cellulare U4lizzo del lievito per iden4ficare regolatori del ciclo cellulare (II) Paul Nurse negli stessi anni identifica mutanti cdc in Saccharomyces pombe,
in particolare cdc2 che corrisponde al mutante cdc28 di Cerevisiae. Inoltre:
- Nuova categoria di mutanti: wee (dallo scozzese “piccolo”) : se i mutanti
che non progrediscono nel ciclo sono grandi (crescita senza divisione)
quelli che si dividono più velocemente saranno piccoli. In questo modo
identifica regolatori negativi della divisione.
- forte conservazione dei regolatori: prova a complementare il lievito con una
library umana e riesce a trovare l’omologo di cdc2/cdc28: cdk1.
Controllo del ciclo cellulare Iden4ficazione dell’MPF in ooci4 di Xenopus Maturazione in vitro degli ooci3 di Xenopus Masui 1971: inieYa citoplasma di ooci3 di rana s3mola3 con progesterone in ooci3 non s3mola3. Ques3 ul3mi vengono s3mola3 alla maturazione del processo meio3co. Individua quindi un faYore citoplasma3co che viene chiamato MPF (Promo3ng Matura3on Factor) Controllo Divisione del ciclo cellulare cellulare AUvità che iden4ficano fasi diverse del ciclo in cellule di mammifero: gli esperimen4 di fusione cellulare di Johnson & Rao , 1970 A`vità in cellule mito3che che induce qualsiasi cellula ad entrare in mitosi A`vità in cellule S che induce replicazione in cellule G1 A`vità in cellule G2 che blocca r i -­‐ r e p l i c a z i o n e a n c h e i n presenza di nucleo in fase S Controllo del ciclo cellulare La scoperta delle cicline Embrioni di riccio di mare: materiale abbondante e “sincrono”: possibilità di fare esperimen3 biochimici Tim Hunt nel 1983 dimostra in embrioni di riccio di mare che la divisione cellulare richiede sintesi proteica e isola alcune proteine con andamento ciclico che comporta un processo di accumulo seguito da un processo di degradazione, da cui il nome di cicline Controllo del ciclo cellulare CaraTerizzazione molecolare dell’MPF Controllo del ciclo cellulare I complessi ciclina/cdk sono i motori del ciclo cellulare G0 MPF cdk1/ciclina B1 M punto di restrizione cdk4-­‐6/ciclina D1 G2 G1 S cdk2/ciclina A Hartwell, Nurse, Hunt cdk2/ciclina E Controllo del ciclo cellulare I COMPLESSI CICLINA/CDK: meccanismo regolativo
CICLINA
– subunità regolativa
– espressa periodicamente nel ciclo
COMPLESSO ATTIVO
– subunità catalitica
– inattiva senza la ciclina
– espressa costitutivamente nel ciclo
CHINASI CICLINADIPENDENTE (CDK)
Controllo del ciclo cellulare Integrazione dei livelli di controllo del ciclo cellulare: l’esempio dei complessi ciclina/cdk ✓ Le cdk sono chinasi a`ve in complesso con la subunità regola3va, la ciclina ✓ Le fluYuazioni dei livelli delle cicline sono dovute ad aUvazione trascrizionale e degradazione regolata ciclo-­‐dipenden3 ✓ Specifici complessi ciclina/cdk caraYerizzano le diverse fasi del ciclo e promuovono la transizione da una fase alla successiva mediante fosforilazione di substra3 chiave Controllo del ciclo cellulare Principi generale di regolazione del ciclo cellulare: -­‐ Monitoraggio delle condizioni extracellulari ed intracellulari (PUNTO DI RESTRIZIONE) -­‐ Azione coordinata di a`vatori e inibitori di processi specifici nel ciclo di divisione (CHECKPOINT; REGOLATORI POSITIVI) -­‐ Integrazione di livelli regola3vi mul3pli (ESPRESSIONE GENICA; MODIFICHE POST-­‐TRADUZIONALI; DEGRADAZIONE CONTROLLATA) I COMPLESSI CICLINA/CHINASI COME NODI CENTRALI NELLA PROGRESSIONE DEL CICLO CELLULARE Come si integrano ques3 livelli regola3vi? Controllo del ciclo cellulare Dai segnali esterni alla aUvazione trascrizionale La presenza di faYori di crescita induce una cascata di trasduzione del segnale nel citoplasma che culmina nell’a`vazione di faYori trascrizionali (nucleari) e nella trascrizione e successiva sintesi della ciclina D1 Controllo del ciclo cellulare Dai segnali esterni alla aUvazione trascrizionale pRb
repressione della trascrizione faTori mitogeni E2F
cdk4cdk6
Fosforilazione P
P
pRb
ciclina
D1
P
aUvazione della trascrizione (Geni per la sintesi del DNA) E2F
ciclina
E
A sua volta, a valle dell’a`vazione dei complessi cdk/cicline osserviamo ondate di a`vazione trascrizionale che guidano la progressione del ciclo Controllo del ciclo cellulare Integrazione dei livelli di controllo del ciclo cellulare: il repressore trascrizionale pRb a valle dei complessi ciclina/cdk Cell cycle control Integrazione dei livelli di controllo del ciclo cellulare (II): l’ubiqui4na ligasi APC/C-­‐Cdh1 e il punto di restrizione Controllo del ciclo cellulare Integrazione dei livelli di controllo del ciclo cellulare (III): i complessi ciclina/cdk sono bersagli dei checkpoint cellulari Controllo del ciclo cellulare Integrazione dei livelli di controllo del ciclo cellulare (IV): Modificazioni post-­‐traduzionali di pRb al crocevia tra diversi des4ni cellulari Munro et al., Oncogene, 2012 Controllo del ciclo cellulare Sintesi: la progressione del ciclo cellulare è regolata da fosforilazione e degradazione coordinate Lodish et al., 2004 Controllo del ciclo cellulare “Visualizzare” la progressione del ciclo cellulare: il sistema Fucci
Principio: proteine fluorescen3 fuse a sequenze di degradazione ciclo-­‐regolate La mitosi Il ciclo di divisione cellulare: alternanza di Sintesi e Mitosi Go (Quiescenza) M G2 (Gap2) (Mitosi) S (Sintesi DNA) G1 (Gap1) La mitosi • Come decidere se entrare o meno in un ciclo di divisione? à Risposta a segnali esterni • Come controllare la sequenza temporale del ciclo di divisione? à Meccanismi di checkpoint (segnali interni) • Come assicurare l’esecuzione delle fasi del ciclo di divisione? à Meccanismi regola3vi (geni, proteine) • Come distribuire il materiale gene4co duplicato? à La mitosi L’entrata in mitosi: modifiche cellulari La mitosi cdk1/ciclina B1 croma3di fratelli centromero Interfase MPF
Condensazione dei cromosomi Mitosi Cambiamen3 del citoscheletro RoYura dell’involucro nucleare La mitosi Le divisione mito4ca Profase Prometafase microtubuli
DNA Metafase Anafase Telofase Rieder and Khodjakov, 2003 Science 300: 91-­‐96 La mitosi La divisione mito4ca: un visione dinamica La mitosi La divisione mito4ca: schema4zzazione Interfase Centrioli (2 coppie) Prometafase Profase Croma3na
Fuso Centrioli
Frammentazione della Cromosoma membrana nucleare
mito3co
Nucleolo Membrana Membrana Membrana nucleare plasma3ca nucleare Decondensazione dei cromosomi
Piastra metafasica
Segregazione dei croma3di Metafase Anafase Telofase Riformazione dell’involucro nucleare
Il controllo della mitosi Interfase Croma3na
Centrioli (2 coppie) Nucleol
Membrana o nucleare (1) Profase Centrioli
Fuso Centromero
mito3co
Membrana nucleare Cromosoma Prometafase Frammentazione della membrana nucleare
(2) (2,3) Decondensazione dei cromosomi
Piastra metafasica
La mitosi Regolazione nello spazio: -­‐ condensazione dei cromosomi (1) -­‐ organizzazione del fuso mito3co (2) -­‐ contaYo microtubuli /cromosomi (3) -­‐ allineamento cromosomi (4) -­‐ separazione dei croma3di fratelli (5) -­‐ divisione del citoplasma nella regione centrale (6) -­‐ orientamento del fuso mito3co (7) Metafase Anafase Telofase (4) Segregazione dei croma3di (5) Riformazione dell’involucro nucleare
(6) Regolazione nel tempo: questa serie di even3 deve avvenire in maniera coordinata e in una precisa sequenza temporale Il fuso mitotico
Rebecca Heald, and Alexey Khodjakov J Cell Biol
2015;211:1103-1111
La mitosi La mitosi Il ciclo dei centrosomi è coordinato con il ciclo cellulare
P
Segregazione nelle cellule figlie
P
F1
Mitosi
P
F1
Separazione
F
P
F
F1
F
G1
Disorientamento
pre-replicativo
F
S
P
F1
F
Duplicazione
P
F1
The
ima
F
F1
Maturazione
G2
The
ima
Regolazione da complessi cyc-­‐cdk La mitosi I microtubuli del fuso
sono strutture fortemente dinamiche
Depolimerizzazione
Taglio
polimerizzazione
Nucleazione
Stabilizzazione
Da Gadde and Heald, 2004 Regolazione della mitosi Come passare dal citoscheletro interfasico al fuso? I regolatori
Mitosi
Interfase
Chinasi (MPF, Plk1,
Aurora-A)
Fosfatasi
GTPasi (Ran)
MAP (TPX2)
Chinesine
Regolazione della mitosi Fosforilazione e proteolisi controllano la mitosi
Attivazione di
chinasi
mitotiche
G2
SAC
NEK6/7/9
LATS1/2
Aurora-A
MYT1
CDK1
PLK1
Prophase
BUB1
BUBR1
Mps1
Haspin Aurora B
TLK1/2
Prometaphase
Metaphase
LATS1
PLK1
MYT1
Anaphase
Telophase
Degradazione
regolata
Pines, 2006 Regolazione della mitosi Il checkpoint mitotico:
separare i cromosomi solo quando sono allineati!
presenza di cromosomi non aYacca3 al fuso inaUvo tu` i cromosomi sono aYacca3 al fuso degradazione segregazione dei cromosomi aUvo Ina`vazione MPF Uscita dalla mitosi Kops et al., 2005 Divisione cellulare e cancro Alterazioni della divisione cellulare: patogenesi La perdita di controllo del ciclo di divisione cellulare è associata a tumorigenesi Divisione cellulare e cancro Alterazioni del pathway E2F/Rb nei tumori -­‐ Il gene RB-­‐1, che codifica per la proteina pRb, è mutato nei re3noblastomi (tumori infan3li della re3na) ed è mutato o funzionalmente ina`vo in un terzo dei tumori umani: tumor suppressor gene -­‐ Alterazioni a carico dei geni E2F sono osservate nei tumori Chen et al., Nat Rev Cancer. 2009 Divisione cellulare e cancro Mutazioni del gene RB-­‐1, punto di restrizione e tumorigenesi Il gene RB-­‐1, che codifica per la proteina pRb, è mutato nei re3noblastomi (tumori infan3li della re3na) Cellule con pRb non funzionale superano il punto di restrizione anche in assenza dei segnali esterni appropria3 Divisione cellulare e cancro Alterazione del pathway pRb/E2F e trasformazione cellulare: meccanismo molecolare Chen et al., Nat Rev Cancer. 2009 L’esempio dei virus oncogeni: le oncoproteine virali u3lizzano il pathway pRb/E2F come bersaglio Polager and Ginsberg, Nat Rev Cancer. 2009 Mitosi e cancro Perdita di controllo della mitosi: trasformazione neoplastica
- Il cancro è causato da alterazioni della divisione cellulare
- Il fuso mitotico è l’apparato deputato alla corretta segregazione dei
cromosomi
- I centrosomi sono i principali organizzatori del fuso mitotico in
cellule somatiche
Mitosi e cancro Le cellule tumorali sono fortemente aneuploidi
(perdita o guadagno di cromosomi)
Cellula normale Cellula tumorale Mitosi e cancro Anomalie centrosomali e tumorigenesi (I):
tessuti tumorali mostrano anomalie nel numero
e nella attività dei centrosomi
Epitelio del colon
Nigg, 2002
tessuto normale
tessuto tumorale
Mitosi e cancro Anomalie centrosomali e tumorigenesi (II)
- Anomalie centrosomali possono generare mitosi anomale e malsegregazione
dei cromosomi....
cellula normale
(prostata)
cellule trasformate
(prostata)
Nigg, 2002
... e contribuire quindi alla generazione di cellule aneuploidi
Mitosi e cancro Anomalie del fuso mitotico e mal-segregazione
Alterazioni nel numero dei poli del fuso non sono “sen3te” dal checkpoint mito3co e possono indurre dife` nella segregazione dei cromosomi Mitosi e cancro Visualizzare le anomalie del fuso mitotico
ed eventi di mal-segregazione in cellule vive
Mitosis and cancer La doppia faccia dell’aneuploidia: pro-­‐ o an4-­‐tumorigenica A. No genetic instability B. Moderate genetic instability C. Massive genetic instability Cell survival
tumorigenesis
Tumor suppression
(modified from Weaver and Cleaveland, 2007) Mitosi e cancro La mitosi come bersaglio terapeutico
✓ la mitosi cos4tuisce un bersaglio seleUvo perchè le cellule tumorali sono cellule in divisione (u4lizzo di farmaci direU contro i microtubuli nella chemioterapia) ✓ regolatori mito4ci sono espressi solo in cellule in divisione e spesso presentano livelli altera4 nelle cellule tumorali: disegno di inibitori specifici (Gascoigne and Taylor, 2009) Mitosi e cancro La mitosi come bersaglio terapeutico
✓ esempi di fattori mitotici bersaglio di molecole in via di sviluppo come
potenziali farmaci antitumorali
Chan et al., 2012 Giulia GuarguagliniIst. Biologia e Patologia Molecolari- CNR
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