20/9/2014 British Journal of Cancer - NGR-TNF, un agente mirato ai vasi sanguigni romanzo, non induce citochine reclutamento di cellule derivate dal…
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Traslazionale Therapeutics
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British Journal of Cancer (2.013) 109 , 360-369. doi: 10.1038 /
bjc.2013.347 www.bjcancer.com
Pubblicato online il 4 luglio, 2013
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Sommario
NGR-TNF, un agente mirato ai vasi sanguigni romanzo,
non induce citochine reclutamento di cellule derivate dal
midollo osseo proangiogenico
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P Di Matteo 1 , 2 , C Hackl 3 , C Jedeszko 3 , B Valentinis 1 , C Bordignon 1 , 2 , C
Traversari 1 , RS Kerbel 3 e GP Rizzardi 1
Ordine Ristampe
commerciali
1
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Diritti e
autorizzazioni
Astratto
MolMed SpA, Via Olgettina 58, 20132 Milano, Italia
Università Vita-Salute, Via Olgettina 58, 20132 Milano, Italia
3
Dipartimento di Biofisica Medica, Sunnybrook Research Institute, Sunnybrook Health Sciences
Centre, Scienze Biologiche Platform, Università di Toronto, 2075 Bayview Avenue, M4N 3M5
Toronto, Ontario, Canada
Materiali e metodi
Corrispondenza: Dr GP Rizzardi o Dr RS Kerbel, E-mail: [email protected] o; E-mail:
[email protected]
Riferimenti
Rivisto 12 giugno 2013; Accettato 12 giugno 2013
Advance pubblicazione on-line 4 lug 2013
Figure e tabelle
2
Inizio
Riferimenti
Metodi:
Risultati:
Ringraziamenti
Conclusione:
Materiali e metodi
Risultati
Note
Ringraziamenti
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Riferimenti Export
Discussione
Figure e tabelle
BACKGROUND:
La somministrazione di alcuni farmaci chemioterapici alla dose
massima tollerata, agenti-vascolari interrompere (VDAs) e irradiazione può
indurre mobilitazione e tumore homing delle cellule proangiogenetici
derivate dal midollo osseo (BMDCs). Incrementi di citochine e chemochine
contribuiscono a tale mobilitazione che alla fine promuove tumore (ri)
crescita. NGR-TNF è un agente mirato ai vasi sanguigni in sviluppo clinico
avanzato, accoppiando il angiogenico-nave homing peptide CNGRCG con
fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF). Abbiamo studiato se NGR-TNF
mobilita BMDCs host e fattori di crescita.
METODI:
Il sangue è stato ottenuto da Lewis carcinoma polmonare e 4T1 topi
portatori di tumore in diversi momenti dopo NGR-TNF, VDA o anti-VEGFR2 /
FLK-1 trattamento anticorpo. I livelli circolanti di fattori di crescita sono
stati valutati mediante test ELISA. BMDCs sono stati caratterizzati da FACS.
Cellule progenitrici endoteliali circolanti sono stati definiti come CD45 - /
CD13 + / FLK-1 + / CD117 + / 7AAD - , Tie2 esprimono come monociti CD45 +
/ CD11b + / Tie2 + e le cellule mieloidi soppressore-derivati
come CD45 + /
http://www.nature.com/bjc/journal/v109/n2/full/bjc2013347a.html
Discussione
Info integrativa
Astratto
Background:
Risultati
Carte di Di Matteo
Cartine per Rizzardi
Cartine per Kerbel
natura posti di
lavoro
Postdoc Posizione in
Biologia sintetica
per Nanotecnologia
del DNA
Karolinska Institutet (KI)
Direttore,
Dipartimento di
Fisiologia
Università Nazionale di
Singapore (NUS)
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CD11b + / GR1 + cellule.
RISULTATI:
NGR-TNF diminuisce tumore vaso sanguigno densità induce
l'apoptosi delle cellule tumorali e tumorali endoteliali. A differenza di VDAs,
o alte dosi di NGR-TNF, basse dosi di NGR-TNF, paragonabili a quelli
utilizzati negli studi clinici, né assumere né mobilitare al sito del tumore
BMDCs proangiogenetici o indurre fattori di crescita host.
CONCLUSIONE:
Basse dosi di NGR-TNF esercita attività antitumorale senza
indurre risposta dell'ospite proangiogenetici, concettualmente, importanti
per la prevenzione / superare la resistenza e la progettazione di strategie
terapeutiche combinate.
natura eventi
Patologia
Molecolare e
Diagnosi del Cancro
23 Novembre 2014 - 28
Novembre 2014
Cambridge, Regno Unito
UAE Cancer
Congress 2014
30 ott 2014 - 1
novembre 2014
Altri eventi scientifici
Parole chiave: targeting tumorale; NGR-hTNF; Il targeting vascolare; angiogenesi;
cellule derivate dal midollo osseo
Attualmente, ci sono due classi principali di farmaci-vascolari targeting per
applicazione in oncologia. Il primo (e principale) classe è composta di farmaci
antiangiogenici, di cui un certo numero sono finora approvati per uso clinico in
oncologia, per esempio, bevacizumab, l'anticorpo monoclonale umanizzato antiVEGF, e sunitinib, sorafenib, pazopanib axitinib e, tutto orale piccola molecola
inibitori della tirosin-chinasi (TKI), che prendono di mira un certo numero di TKI tra
cui recettori del VEGF. Indicazioni registrate, a seconda del farmaco, includono il
cancro a cellule renali (sunitinib, pazopanib, sorafenib, axitinib e bevacizumab),
carcinoma epatocellulare (sorafenib), tumori neuroendocrini pancreatici (sunitinib),
carcinoma midollare della tiroide (vandetanib), al seno, alle ovaie, non polmonare a
piccole cellule e carcinomi colorettali (bevacizumab) e glioblastoma (bevacizumab)
(vedi http://www.fda.gov ). Queste approvazioni, in particolare per i tumori
storicamente refrattari quali cellule renali e carcinomi epatocellulari, rappresentano
una vera e propria svolta nel trattamento oncologia medica. Tuttavia, la
sopravvivenza libera da progressione e la sopravvivenza globale (OS) benefici di
questi farmaci, in particolare del sistema operativo, quando ha successo, rimangono
modesti.
Agenti-vascolari interrompere (VDAs) definiscono la seconda classe di farmacivascolari targeting. Nessuno di questi è attualmente approvato per uso clinico, anche
se ci sono più di 10 in varie fasi di sviluppo clinico (vedi http://www.clinicaltrials.gov
). A differenza di molti farmaci antiangiogenici-neovascolarizzazione di targeting,
VDAs indirizzare direttamente ai vasi tumorali stabilita ma anormale, provocando la
loro distruzione molto rapida, che porta a profondi aumenti di ipossia tumorale e
necrosi intra-tumorale. Tuttavia, questo effetto potente è seguita da una rapida
ricrescita del tumore vitale residuo cerchione ( Shaked et al , 2006 ).
In questo contesto, NGR-TNF, un nuovo farmaco generato dalla fusione del peptide
CNGRCG al dominio N-terminale di umana (h) TNF ( Curnis et al , 2000 ), definisce
una nuova classe di agenti targeting vascolare. NGR-TNF è mirato alla
vascolarizzazione del tumore da parte del peptide motivo CNGRC ( Arap et al , 1998
; Curnis et al , 2000 ), che interagisce specificamente con il CD13 (aminopeptidasi
N) espressi dalle cellule endoteliali dei vasi angiogenici ( Pasqualini et al , 2000 ;
Curnis et al , 2002a ; Buehler et al , 2006 ). NGR-TNF è in grado di controllare la
crescita tumorale in diversi modelli tumorali, da solo o in combinazione con
chemioterapici ( Curnis et al , 2000 ; Sacchi et al , 2006 ; Gregorc et al 2009 ;
Santoro et al 2010 ; Gregorc et al , 2010b , 2011 ). In modelli preclinici, è stato
dimostrato che la curva dose-risposta di NGR-TNF è a campana ( Curnis et al ,
2002b ). È un dato di fatto, NGR-murina (m) TNF ha un effetto antitumorale a dosi
inferiori a 1 ng per mouse o uguale / superiore a 1 μ g per mouse. Ciò è dovuto ad
una induzione del contatore meccanismi di regolazione, tra cui TNF recettore
spargimento. A dosi superiori a 1 μ g per il mouse, NGR-mTNF supera questi
meccanismi di feedback negativi e dimostra ancora una volta la sua attività
antitumorale ( Curnis et al , 2002b ). In questo contesto, NGR-mTNF ha mostrato
una significativa attività antitumorale a dosi molto basse (0,1 ng per topo,
corrispondente a 5 ng per kg) ( Curnis et al , 2000 ), equivalente negli esseri umani
a una dose di 0,2 μ g m -2 , che era la dose iniziale selezionata per la fase I di
sviluppo clinico. Studi dose escalation sono stati effettuati senza raggiungere una
chiara MTD ( van Laarhoven et un l 2010 ; Zucali et al , 2013 ). Tuttavia, è stato
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osservato che la bassa dose di 0,8 μ g m -2 ha effetti antivascolari più pronunciati
rispetto a dosi più alte, ed è stato quindi considerato come la dose biologica ottimale
( Gregorc et al , 2010a ). NGR-TNF a basso dosaggio di 0,8 μ g m -2 è attualmente
in fase di sperimentazione in diversi di fase II e III degli studi clinici con fase II
promettenti risultati ( Gregorc et al , 2009 ; Santoro et al , 2010 ; Gregorc et al ,
2010a , Gregorc et al , 2010b , 2011 ). Cellule derivate dal midollo osseo (BMDCs) svolgono un ruolo importante nella
regolazione dell'angiogenesi durante la progressione tumorale. Nel corso degli ultimi
15 anni, un certo numero di differenti sottotipi di BMDCs proangiogenetici e
protumourigenic sono stati identificati, tra cui cellule progenitrici endoteliali circolanti
(CEP) ( Lyden et al , 2001 ; Shaked et al , 2006 ), macrofagi associati al tumore (
Lin et al , 2006 ), Tie2-esprimono monociti (TEM) ( De Palma et al , 2003 , 2005 ),
precursori delle cellule dendritiche ( Conejo-Garcia et al , 2004 ), i mastociti (
Coussens et al , 1999 ) e CD11b + GR1 + cellule , compresi neutrofili ( Nozawa et al
, 2006 ) e le cellule mieloidi soppressore-derivato (MDSCs) ( Yang et al , 2004 ;
Shojaei et al , 2007 ). Questi diversi tipi di cellule sono pensati per promuovere
l'angiogenesi tumorale da diversi meccanismi, per esempio, con la produzione di
fattori pro-angiogenici ( Murdoch et al , 2008 ; Qian e Pollard, 2010 ), così come la
loro differenziazione in cellule endoteliali nel caso del CEP ( Lyden et al , 2001 ;
Shaked et al , 2006 ). Inoltre, è stato dimostrato che diversi tipi di BMDCs, quali
funghi porcini, TEM o CD11b + GR1 + cellule, sono coinvolti nella formazione di
'nicchie premetastatic' ( Kaplan et al , 2005 ; Gao et al , 2008 ; Gingis- Velitski et al
2011 ). Vi è ora in evidenza che il trattamento con VDAs (ad esempio, Oxi4503) o di
alcuni farmaci chemioterapici somministrati alla dose massima tollerata (ad esempio,
paclitaxel, ciclofosfamide, 5-FU) o irradiazione locale possono rapidamente indurre la
mobilitazione e la successiva homing tumore di un numero di differenti BMDCs
proangiogenetici ( Shaked et al , 2006 ; Kerbel, 2008 ; Shaked et al , 2008 ; De
Palma e Lewis, 2011 ; Denardo et al , 2011 ; Welford et al , 2011 ), che esercitano
in alcuni casi effetti prometastatic ( Gengis-Velitski et al 2011 ). Induzione di diversi
fattori di crescita e chemochine accoglienza, come granulociti fattore stimolante le
colonie (G-CSF), derivato dalle cellule stromali factor-1 (SDF-1) e osteopontina
(OPN), contribuisce a questo farmaco-indotta BMDC mobilitazione e migrazione al
cerchio tumore vitale che rimane dopo il trattamento ( Shaked et al , 2008 , 2009 ;
Welford et al 2011 ). Questo processo promuovere l'angiogenesi e la rapida ricrescita
del tumore colpisce le attività complessive antitumorale dei trattamenti di cui sopra (
Shaked et al , 2008 , 2009 , De Palma e Lewis, 2011 ; Denardo et al , 2011 ;
Welford et al , 2011 ).
Sulla base di queste osservazioni, abbiamo deciso di valutare l'impatto di NGR-TNF
sulla BMDC mobilitazione e suoi effetti sulla indurre vari potenziali fattori BMDCmobilitazione. Abbiamo quindi testato due differenti dosi di NGR-TNF, un basso e una
dose elevata. Il razionale per questo punto si basa sui risultati di diversi di fase I e II
di sviluppo clinico con NGR-hTNF mostrando che basse dosi di farmaco, per esempio,
0,8 μ g m -2 ( Gregorc et al , 2010a ) (vale a dire, 18 ng per kg), sono più efficaci di
dosi più alte testate in fase I dose studi di escalation ( van Laarhoven et al , 2010 ;
Gregorc et al , 2010a ; Zucali et al , 2013 ). Abbiamo concluso che questo risultato
controintuitivo potrebbe essere spiegato, almeno in parte, dal fallimento della dose
inferiore di indurre una risposta reattiva ospitante BMDC in contrasto con la dose più
alta. Segnaliamo che NGR-mTNF, ripetutamente somministrato a basse dosi per topi
portatori di tumore, provoca una diminuzione di sangue del tumore densità nave e
induce apoptosi sia di tumore e le cellule endoteliali in vivo senza indurre una
risposta dell'ospite proangiogenico reattiva.
Inizio
Materiali e metodi
Background:
Riferimenti
Metodi:
Risultati:
Ringraziamenti
Conclusione:
Materiali e metodi
Risultati
Discussione
Figure e tabelle
Le cellule tumorali e modelli animali
Carcinoma del polmone mouse Lewis (LLC, ATCC, Manassas, VA, USA) e 4T1 cellule
di carcinoma della ghiandola mammaria (ATCC) sono state coltivate in condizioni
standard. Cellule LLC (5 × 10 5 ) erano per via sottocutanea (sc) iniettato in
singenici C57BL / 6 topi (Jackson) o C57BL / 6 topi precedentemente trapiantati con
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proteina fluorescente verde + (GFP + ), le cellule di midollo osseo da UBI-GFP /
donatori BL6 ( Jackson, Bar Harbor, ME, USA) dopo irradiazione letale (900 rad).
Cellule 4T1 (7 × 10 3 ) sono state iniettate in sc singenici BALB / c topi (Charles
River, Calco, Lecco, Italia). Trattamenti iniziato quando i tumori erano 200-300 mm
3
. I topi sono stati sacrificati quando le dimensioni del tumore ha raggiunto 1700
mm 3 , con l'approvazione e in conformità con le linee guida del comitato cura degli
animali del Health Sciences Centre e canadesi Consiglio di cura degli animali e del
Comitato Etico dell'Istituto Scientifico San Raffaele Sunnybrook (IACUC 492 ). I
nostri in vivo esperimenti soddisfano gli standard richiesti dalle linee guida UKCCCR (
Workman et al , 2010 ).
Preparazione e caratterizzazione di NGR-mTNF
Il cDNA codificante per NGR-mTNF è stato gentilmente fornito dal Dr. A Corti
(Istituto Scientifico San Raffaele, Milano, Italia). Espressione NGR-mTNF è stata
indotta a BL21 trasformato ( λ D3) Escherichia Coli (Novagen, Podenzano, PC, Italia)
da 1 mM IPTG (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Omogenato batterica è stata
chiarita dalla flocculazione con polietileneimmina (Sigma-Aldrich), e solubile NGRmTNF è stato purificato da tre fasi di cromatografia: cromatografia a scambio ionico
su Q-Sepharose XL (GE Healthcare, Milano, Italia), la cromatografia in modalità
mista su Capto Rispettare (GE Healthcare) e scambio ionico cromatografia su QSepharose HP (GE Healthcare) in condizioni di denaturazione. Il contenuto di
endotossina del purificato NGR-mTNF, misurata dal cromogenico quantitativa
Limulus test di lisato di amebociti (BioWhittaker, Lonza, Walkersville, MD, USA), è di
0,12 U μ g -1 . Trattamenti tumorali
NGR-mTNF è stato somministrato per via intraperitoneale (ip) sia ad alte dosi (1 o
10 μ g 100 μ l -1 per il mouse, utilizzato indifferentemente perché hanno dato gli
stessi risultati per quanto riguarda BMDCs e la crescita fattore di rilascio ed efficacia
sono interessati), singolo -bolus iniezioni, o a basso dosaggio (0,1 ng 100 μ l -1 per
topo), tre volte a settimana. Un topo monoclonale specifico per il mouse VEGFR-2 /
FLK-1 (DC101) è stato somministrato ip ad una concentrazione di 800 μ g 200 μ l -1
per topo. Un agente vascolare-microtubuli interrompere di seconda generazione,
Oxi4503 (indicato d'ora in poi come 'VDA'), è stato somministrato ip a 100 μ g g -1
come una singola dose. Il trapianto di midollo osseo
Proteina fluorescente verde + cellule di midollo osseo (10 × 10 6 ) isolati da femori di
UBI-GFP / topi donatori BL6 sono state iniettate nelle vene coda di 6 e le 8
settimane di età letale irradiati (900 rad) C57BL / 6 topi femmina . Dopo 6-8
settimane, i topi riceventi sono stati sanguinavano dal seno orbitale per valutare
l'efficienza del trapianto di midollo osseo in citometria a flusso. Quelle che aveva> 99
% GFP + cellule del sangue periferico sono stati successivamente utilizzati come
destinatari per iniezione sottocutanea di cellule LLC.
Analisi delle cellule circolanti mediante citometria di flusso
Il sangue è stato prelevato dal seno retro-orbitale di topi anestetizzati 4, 24 e 72 ore
dopo un singolo trattamento o 24 o 72 ore dopo ripetute (tre) trattamenti con NGRmTNF. Le sospensioni cellulari sono stati analizzati su un LSRII o un FACSCanto (BD
Biosciences, San Diego, CA, USA) dopo la lisi dei globuli rossi. Almeno 100 000
cellule per campione sono stati acquisiti, e le percentuali di cellule colorate sono stati
determinati e confrontati con opportuni controlli negativi. PEC vitali (vCECs) e CEP
vitali (vCEPs) sono stati contati con flusso a cinque colori citometria. In breve, gli
anticorpi monoclonali specifici per CD45 sono stati utilizzati per escludere CD45 +
cellule ematopoietiche, e PEC o PEC sono stati rilevati come espressione di marcatori
endoteliali murine chinasi fegato fetale 1 / recettore VEGF 2 ( FLK-1 / VEGFR-2),
CD13 e (solo ) per la CEP, CD117 (c-kit) (BD Biosciences). Dopo l'acquisizione di
almeno 100 000 cellule per campione, le analisi sono state considerate informativo
quando un numero sufficiente di eventi (cioè,> 25, tipicamente 50-150) sono stati
raccolti nel cancello CEP censimento nel animali di controllo non trattati ( Bertolini et
al , 2006 ) . La colorazione positiva è stata definita come maggiore di colorazione di
fondo aspecifica, e 7-aminoactinomycin D (7AAD) è stato utilizzato per distinguere le
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cellule apoptotiche e morte di cellule vitali ( Bertolini et al , 2006 ). TEM ( De Palma
et al , 2005 ) e CD11b + / Gr1 + MDSCs sono stati rilevati come positivi per CD45,
CD11b (BD Biosciences), Tie2 (eBioscience, San Diego, CA, USA) e CD45, CD11b,
Gr1 (Ly6G, BD Biosciences) marcatori, rispettivamente.
Valutazione dei livelli circolanti di fattore di crescita plasmatici da ELISA
I topi sono stati trattati quando i tumori erano 250-350 mm 3 . Il sangue è stato
prelevato da seni retro-orbitale di topi anestetizzati o mediante puntura cardiaca 4,
24 o 72 ore dopo il trattamento con NGR-mTNF o VDA. I campioni di plasma sono
stati ottenuti mediante centrifugazione (3000 giri al minuto (rpm), 5 min) e
conservati a -80 ° C. I livelli di G-CSF, SDF-1 e OPN sono stati valutati con
commercialmente disponibile DuoSet di R & S del sistema ELISA saggi seguito le
istruzioni del produttore. Curva standard per il G-CSF ha iniziato da 1000 pg ml -1
ed i campioni sono stati diluiti 1 : 2; una curva standard per SDF-1 iniziato da 1000
pg ml -1 ed i campioni sono stati diluiti 1 : 1; e una curva standard per OPN iniziato
da 2 ng ml -1 ed i campioni sono stati diluiti 1 : 450.
Tumore immunofluorescenza e immunoistochimica
Tessuti tumorali sono stati raccolti 72 ore dopo un singolo trattamento o 24 ore
dopo ripetute (tre) trattamenti, SNAP congelati e conservati a -80 ° C. Criosezioni
tumorali (15-20 μ m) sono state colorate per le navi con un anticorpo anti-CD31 (1 :
200, BD Biosciences) e il suo anticorpo secondario asino Dylight649-coniugato antitopo (1 : 200, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA , USA) o Cy3-coniugato
anticorpo asino anti-ratto (1 : 200, Jackson ImmunoResearch), per apoptosi con un
anticleaved caspasi-3 anticorpo (Cell Signaling Technology di Boston, MA, USA) e il
suo asino secondario Cy3-coniugato anti- anticorpi di coniglio (1 : 200, Jackson
ImmunoResearch) e per la GFP positività con isotiocianato di fluoresceina anti-GFP
(FITC) -conjugated anticorpo (1 : 500, BD Biosciences). Tutte le sezioni sono state
contrastate con DAPI per l'identificazione di nuclei. I controlli sono stati
immunostained con un solo anticorpo secondario. Per la rilevazione di ipossia, i topi
hanno ricevuto una iniezione ip di cloridrato pimonidazole (60 mg per kg) (Chemicon
International, Temecula, CA, USA) 90 min prima di eutanasia ( Daenen et al 2009 ).
I tumori sono stati poi rimossi, SNAP congelati e conservati a -80 ° C. L'ipossia
immunoistochimica è stata effettuata utilizzando l'anticorpo anti-pimonidazole
Hypoxyprobe-1 (1 : 200, Chemicon International) e il suo derivato ratto Cy3coniugato anticorpo anti-topo (1 : 200, Jackson ImmunoResearch). La necrosi è
stato rilevato come autofluorescenza nel canale FITC su sezioni (5 μ m) ottenuti da,
inclusi in paraffina tumori fissati in formalina ( Daenen et al , 2009 ). La
proliferazione è stata determinata da immunoistochimica con un anticorpo policlonale
di coniglio Ki-67 anticorpo (Vector, Burlington, ON, Canada) su sezioni (5 μ m)
ottenuto da tumori, inclusi in paraffina fissati in formalina. Dati istologici sono stati
prelevati in maniera cieca. Le immagini sono state catturate con una fotocamera
digitale Zeiss AxioCam collegato al microscopio utilizzando AxioVision software 3.0.
Almeno due diapositive non consecutive sono stati analizzati per tumore, e di almeno
10 immagini (ingrandimento × 100) sono stati prelevati per ogni diapositiva per
rappresentare l'intera sezione tumore. Le foto sono state analizzate con ImageJ e
Prisma. Per ogni colore (verde, rosso, blu e ciano), il numero di pixel per immagine è
stata divisa per il numero totale di pixel della zona tumorale. I risultati sono stati
espressi come fold aumento / diminuzione rispetto al gruppo di controllo (100 % ).
Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti almeno due volte. Foto mostrati sono
rappresentativi dei settori più frequentemente osservati per vetrino. Analisi statistica
GraphPad Prism versione 5.0b è stato utilizzato per valutare la significatività
statistica delle differenze nei valori medi. La Student a due code t -test o il test
Anova one-way è stato utilizzato per valutare la significatività della differenza media.
Differenza tra i gruppi designati rispetto al gruppo trattato con soluzione salina
(salvo diversa indicazione) è stato considerato significativo a valori di 0,05> P >
0.01 ( * ) o 0,01> P > 0,001 ( * * ) o P <0.001 ( * * * ). L'assenza di simboli indica
che non sono state riscontrate differenze statisticamente significative. I dati sono
espressi come media ± deviazione standard
Risultati
http://www.nature.com/bjc/journal/v109/n2/full/bjc2013347a.html
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Conclusione:
Materiali e metodi
Risultati
Discussione
Figure e tabelle
Basse dosi di NGR-TNF provoca una diminuzione della conta dei vasi
sanguigni tumorali e induce apoptosi
L'attività antitumorale di NGR-mTNF è stato riportato in diversi modelli tumorali in
seguito alla somministrazione di basse dosi di NGR-mTNF soli o in combinazione con
agenti chemioterapici ( Curnis et al , 2000 , 2002b ; Sacchi et al , 2006 ; Calcinotto
et al 2012 ). Per valutare se il tumore attività inibitoria di NGR-TNF può comportare
un effetto locale sui vasi tumorali, topi LLC-cuscinetto sono stati trattati con alte o
basse dosi di NGR-mTNF ( n = 4-6 topi per gruppo). Tessuti tumorali sono stati
raccolti 72 ore dopo un singolo trattamento o 24 ore dopo trattamenti ripetuti e
colorate per CD31 e spaccati caspasi-3 (ClCasp3) come marker di apoptosi. Il
trattamento a basso dosaggio e, in misura maggiore, il trattamento con alte dosi ha
causato una diminuzione del tumore-associato sangue densità vaso 72 h dopo il
trattamento ( Figure 1A e B ). Risultati simili sono stati ottenuti sui tumori raccolti
dopo la somministrazione del farmaco ripetute a basse dosi ( figure complementari
1A e B ). Come previsto, aumento dei livelli di espressione ClCasp3 sono stati rilevati
nei tumori sia ad alta dose e bassa dose-trattati ( Figura 1C ). Infatti, abbiamo
osservato livelli simili di apoptosi sia di cellule tumorali e cellule endoteliali tumorali,
suggerendo così che anche a basse dosi di NGR-TNF ha effetti antivascolari, che
potrebbero contribuire alla sua attività terapeutica antitumorale. Questa attività
biologica di NGR-mTNF si traduce in una riduzione della crescita tumorale (
complementare Figura 2A ). In particolare, 72 ore dopo il trattamento, VDA e alte
dosi di NGR-mTNF esercitano effetti antitumorali. Tuttavia, al momento del sacrificio
(di solito circa 22 giorni dopo l'iniezione del tumore, 12 giorni dopo il primo
trattamento), l'agente antitumorale più potente che abbiamo provato è a basso
dosaggio NGR-mTNF ( complementare Figura 2A ). Figura 1.
Basse dosi di NGR-mTNF diminuisce la densità vascolare e
induce l'apoptosi delle cellule tumorali e cellule endoteliali
tumorali. Tumori LLC state raccolte 72 ore dopo un singolo
trattamento e trattati come descritto nella sezione Materiali e
Metodi. ( A ) spaccati caspasi-3 (ClCasp3, rosso) e CD31 (ciano)
immunocolorazione di sezioni tumorali LLC. I nuclei sono stati
colorati con DAPI (blu). I risultati sono rappresentativi di tre
esperimenti indipendenti, e 4-6 topi per gruppo sono stati
analizzati. Per ogni tumore, sono stati analizzati 2-10 sezioni
non consecutive. Sono stati presi almeno 10 immagini per
vetrino. Ingrandimento × 100; barra della scala, 200 μ m. ( B e
C ) I grafici mostrano il rapporto medio di espressione CD31 e
ClCasp3 analizzato come la misura della densità vascolare e
apoptosi, rispettivamente. Figura completa e leggenda (217 K )
Basse dosi di NGR-TNF non induce la mobilitazione di BMDCs
proangiogenetici e fattori di crescita proangiogenetici
Poiché il trattamento VDA ha dimostrato di provocare l'induzione di molteplici
citochine ospitanti come G-CSF ( Shaked et al , 2009 ) o SDF-1 ( Welford et al ,
2011 ), che possono quindi agire di mobilitare diversi tipi di popolazioni BMDC,
abbiamo studiato se NGR-TNF può indurre citochine-driven reclutamento di BMDCs
proangiogenetici. Abbiamo analizzato il sangue di topi LLC-cuscinetto ottenuti in una
fase iniziale (4 e 24 ore) ( Shaked et al , 2006 ), o in una fase tardiva (72 h) ( Taylor
et al , 2012 ), dopo un singolo trattamento o 24 o 72 h dopo ripetute (tre)
trattamenti sia con NGR-mTNF o VDA o un anti-VEGFR2 / FLK-1 anticorpo ( n = 5-6
topi per gruppo) per la presenza in circolo BMDCs mediante FACS. In particolare,
vCECs sono stati definiti come CD45 - / CD13 + / FLK-1 + / 7AAD - , vCEPs come
CD45 - / CD13 + / FLK-1 + / CD117 + / 7AAD - , TEM come CD45 + / CD11b + / Tie2
+
e MDSCs come CD45 + / CD11b + / GR1 + cellule. Trattamento VDA indotto la
mobilitazione di vCEPs, vCECs, TEM e CD11b + GR1 + cellule ( Figura 2A ). Inoltre,
abbiamo osservato un aumento dei livelli circolanti di BMDCs proangiogenetici dopo il
trattamento con alte dosi di NGR-mTNF ( Figura 2A ), mentre sia singola ( Figura 2A
http://www.nature.com/bjc/journal/v109/n2/full/bjc2013347a.html
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) e ripetuta ( Figura complementare 3 ) trattamenti con NGR-mTNF a basso dosaggio
non ha indotto tale mobilizzazione delle cellule. Infatti, in quest'ultimo ambiente,
aumento dei livelli circolanti CD45 + / CD11b + / GR1 + cellule sono stati osservati
dopo somministrazione ripetuta di entrambi saline e NGR-mTNF a basso dosaggio,
probabilmente a causa della infiammazione e lo stress associato alle manipolazioni (
Everds, 2007 ). I risultati ottenuti sono stati confermati nel modello 4T1, dove sono
stati osservati aumenti circolanti BMDCs proangiogenetici dopo i trattamenti ad alte
dosi, ma non dopo basse dosi di NGR-trattamenti mTNF ( Figura 3 ). Per
caratterizzare in profondità il fenomeno, abbiamo anche cercato di circolazione
BMDCs proangiogenetici dopo il trattamento con dosi intermedie di NGR-mTNF, 1 e
10 ng per mouse ( figura complementare 4 ). Al 10 ng per il mouse, abbiamo
osservato il rilascio di BMDCs proangiogenetici in circolazione, suggerendo in tal
modo che questo fenomeno è già attiva nel campo nanogrammo ( figura
complementare 4 ). Figura 2.
Basse dosi di NGR-mTNF non modifica i livelli circolanti BMDCs
potenzialmente tumore-promozione e GF circolanti. ( A ) I livelli
circolanti di vCECs, vCEPs, TEM e CD11b + Gr1 + MDSCs in LLC
topi portatori di tumore ( n = 5) sono stati valutati mediante
analisi FACS 4 e 24 ore dopo il trattamento con i farmaci
indicati. ( B livelli) plasmatici di G-CSF, OPN e SDF-1 sono stati
ottenuti da LLC topi portatori di tumore ( n = 5), 4 e 24 ore
dopo il trattamento con i farmaci indicati.
Figura completa e leggenda (114 K )
Figura 3.
NGR-mTNF non aumenta i livelli circolanti BMDCs tumorepromozione in un modello murino di cancro al seno. Livelli di
vCEPs circolanti, vCECs, TEM e CD11b + Gr1 + MDSCs in 4T1
topi portatori di tumore ( n = 5) sono stati valutati mediante
analisi FACS 4 o 24 ore o 1 settimana dopo il primo trattamento
con i farmaci indicati.
Figura completa e leggenda (77 K )
Quindi, abbiamo valutato la presenza di fattori circolanti, già mostrato di essere
coinvolti in mobilitazione di CEP e di alcuni altri tipi di BMDC come la TEM (ad
esempio, G-CSF, SDF-1 e OPN) da ELISA. Trattamento VDA, così come alte dosi di
NGR-mTNF, indotto un significativo aumento del livello plasmatico di G-CSF, OPN e
SDF-1, che non è stato rilevato 4 o 24 ore dopo il trattamento con NGR-mTNF a
basso dosaggio ( Figura 2B ). L'aumento dei fattori di crescita è transitoria come 72
h dopo il trattamento tutti i fattori di crescita testati tornato a livelli basali (dati non
mostrati). Questi risultati suggeriscono che basse dosi di NGR-mTNF, paragonabile
alle dosi utilizzato negli studi clinici in corso (del mouse: circa 6 ng per kg; umano:
0,8 μ g m -2 corrispondenti a circa 18 ng per kg) ( Gregorc et al , 2010a ), non
provoca un rimbalzo dei fattori di crescita potenzialmente proangiogenetici circolanti
che abbiamo valutato, né la mobilitazione associato di BMDCs proangiogenetici. Basse dosi di NGR-TNF non reclutare BMDCs al sito del tumore
Per indagare la presenza di potenziale di crescita tumorale-promozione BMDCs
proangiogenetici presso il sito del tumore, abbiamo trattato LLC fruttiferi GFP +
midollo osseo topi chimerica sia con NGR-TNF o VDA o un anti-VEGFR2 / anticorpo
FLK-1 ( n = 4- 6 topi per gruppo). Tessuti tumorali sono state raccolte 72 ore dopo il
trattamento e analizzati per la presenza di GFP + BMDCs ( Figura 4A ). GFP + cellule
sono state osservate in tutti i gruppi a livelli variabili, con un aumento
statisticamente significativo rilevabile solo nei tumori VDA-trattati ( Figure 4A e B ).
In linea con la rapida ricrescita del tumore precedentemente descritto a verificarsi
http://www.nature.com/bjc/journal/v109/n2/full/bjc2013347a.html
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dopo la terapia VDA, abbiamo osservato GFP + BMDC localizzazione sul bordo
tumore vitale nei tumori VDA-trattati e, in misura minore, nel-alte dosi di NGR-mTNF
tumori trattati. Significativamente, nessun bordo tumore vitale è stato osservato
dopo la somministrazione di basse dosi di NGR-mTNF.
Figura 4.
Basse dosi di NGR-mTNF non supporta il cerchio tumore vitale e
proliferanti BMDC-indotta. Tumori LLC coltivate in GFP + midollo
osseo topi chimeriche sono state raccolte 72 ore dopo un
singolo trattamento e trattati come descritto nella sezione
Materiali e Metodi. ( A ) GFP + cellule BM-derivati
(verde) e
CD31 (rosso) di immunoistochimica di sezioni tumorali LLC. I
nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). I risultati sono
rappresentativi di due esperimenti indipendenti, e 4-6 topi per
gruppo sono stati analizzati. Per ogni tumore, 2-10 sezioni non
consecutive erano state prese analysed.At almeno 10 immagini
per vetrino. Ingrandimento × 100; barra della scala, 200 μ m. (
B ) La trama illustra quantificazione di GFP-tumore infiltrante +
cellule. Il grafico mostra il rapporto medio di GFP colorazione
analizzato. ( C ) Ki67 (marrone) immunocolorazione di sezioni
LLC tumorali in paraffina. I nuclei sono stati colorati con
ematossilina (blu). I risultati sono rappresentativi di due
esperimenti indipendenti, e 4-6 topi per gruppo sono stati
analizzati. Per ogni tumore, sono stati analizzati 2-10 sezioni
non consecutive. Sono stati presi almeno 10 immagini per
vetrino. Ingrandimento × 100; barra della scala, 200 μ m. Figura completa e leggenda (548 K )
Per approfondire lo studio degli effetti dei trattamenti sulla proliferazione delle cellule
tumorali, abbiamo analizzato i tumori LLC recuperato 72 ore dopo il trattamento per
la colorazione Ki67. In accordo con la localizzazione di GPF + BMDCs sul bordo
tumore vitale, proliferazione delle cellule tumorali è stata chiaramente osservata al
bordo di VDA- e di tumori ad alto dosaggio NGR-mTNF trattati, sostenendo
ulteriormente la presenza di una ricrescita vitale (ripopolamento) tumore cerchio (
Figura 4C ). Al contrario, il trattamento con basse dosi di NGR-mTNF modestamente
ridotta proliferazione delle cellule tumorali e, soprattutto, non ha portato alla
formazione di altamente proliferative cerchi tumorali vitali ( Figura 4C ), evitando o
minimizzando rapida ricrescita del tumore.
Basse dosi di NGR-TNF induce ipossia basso grado e necrosi
Diversi fattori possono contribuire alla mobilitazione VDA-mediata di BMDCs, tra cui,
gli effetti sull'ospite tumore-indipendenti che possono essere correlati a dirigere la
tossicità dei farmaci sulle cellule di midollo osseo, così come i livelli elevati di tumore
ipossia e necrosi delle cellule tumorali indotte da trattamento farmacologico ( Berger
e Hanahan 2008 ; Du et al , 2008 ). Per approfondire il meccanismo d'azione di
basse dosi di NGR-mTNF, abbiamo valutato la sua capacità di indurre ipossia
tumorale e necrosi nei tumori LLC, con colorazione pimonidazole come marker di
ipossia e di autofluorescenza come marker di necrosi ( Daenen et al 2009 ). Come
previsto, trattamenti con VDA o alte dosi di NGR-mTNF aumentate ipossia tumorale
e necrosi ( Figure 5A-C ). Basse dosi di NGR-mTNF solo leggermente aumentato
questi due parametri ( Figure 5A-C ), in accordo con l'osservazione che basse dosi di
NGR-TNF trattamento non riesce a indurre robusta citochine / fattori di crescita o
risposte BMDC.
Figura 5.
Basse dosi di NGR-mTNF effetti sulla ipossia tumorale e necrosi.
Tumori LLC state raccolte 72 ore dopo un singolo trattamento e
trattati come descritto nella sezione Materiali e Metodi. ( A ) Il
livello di ipossia è stata valutata come pimonidazole (rosso)
immunocolorazione. I risultati sono rappresentativi di due
esperimenti indipendenti, e 4-6 topi per gruppo sono stati
analizzati. Per ogni tumore, sono stati analizzati 2-10 sezioni
http://www.nature.com/bjc/journal/v109/n2/full/bjc2013347a.html
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non consecutive. Sono stati presi almeno 10 immagini per
vetrino. Ingrandimento × 100; barra della scala, 200 μ m. ( B )
Il livello di necrosi è stata valutata come autofluorescenza
(verde) di sezioni in paraffina. I risultati sono rappresentativi di
due esperimenti indipendenti, e 4-6 topi per gruppo sono stati
analizzati. Per ogni tumore, sono stati analizzati 2-20 sezioni
non consecutive. Sono stati presi almeno 10 immagini per
vetrino. Ingrandimento × 100; barra della scala, 200 μ m. ( C )
Pannello sinistro illustra la quantificazione del tumore ipossia. Il
grafico mostra il rapporto medio di immunoistochimica
pimonidazole analizzato; pannello di destra mostra la
quantificazione di necrosi tumorale. Il grafico mostra il rapporto
medio di pixel verdi / campo analizzati. Figura completa e leggenda (360 K )
Inizio
Discussione
Background:
Riferimenti
Metodi:
Risultati:
Ringraziamenti
Conclusione:
Materiali e metodi
Risultati
Discussione
Figure e tabelle
Diversi inibitori dell'angiogenesi rivolte al percorso VEGF hanno dimostrato provata
efficacia in entrambi i modelli tumorali preclinici e sperimentazioni cliniche. Tuttavia,
in entrambe le impostazioni degli effetti terapeutici sono transitori, e dopo una prima
fase di controllo della crescita del tumore, per esempio, la regressione del tumore in
alcuni casi, o induzione della malattia stabile, i tumori progrediscono. Come tale, vi è
un notevole interesse per chiarire i motivi per i loro benefici clinici transitori, ad
esempio, comprendere la base dei meccanismi di resistenza intrinseca o acquisita, e
di elaborare strategie per ritardare l'insorgenza di resistenza o trattare palese
malattia resistente recidivante con le terapie di seconda linea -incluso con nuovi e
diversi farmaci antiangiogenici o altri tipi di-vascolari di targeting agenti / strategie
come VDAs ( Berger e Hanahan, 2008 ; Ebos e Kerbel 2011 ). In questo contesto, il
reclutamento di cellule proangiogenetici BM-derivati
presso il sito del tumore è stato
identificato come una possibile ragione dell'efficacia transitoria di alcuni di questi
trattamenti, come VDAs, in modelli preclinici ( Shaked et al , 2006 , 2008 ; Welford
et al 2011 ). Inoltre, la rilevanza di questo meccanismo nei pazienti trattati con VDAs
è supportata da diversi studi clinici ( Farace et al , 2007 ; Shaked et al , 2009 ;
Taylor et al , 2012 ).
Le proprietà combinate di NGR-TNF definiscono una nuova classe di agenti targeting
vascolare. Ad esempio, a differenza di entrambi VEGF-pathway di targeting farmaci
antiangiogenici e VDAs, NGR-TNF non induce ipertensione non provoca proteinuria.
Come VDAs, può attaccare direttamente ai vasi tumorali, ma il bersaglio molecolare
per NGR-TNF espressa dalle cellule endoteliali - CD13 - è nota. A differenza VDAs o
inibitori VEGF pathway antiangiogenici, ha un ulteriore meccanismo di azione, vale a
dire, potente stimolazione dei antitumorali ospite meccanismi immunitari ( Curnis et
al , 2000 ; Sacchi et al , 2004 ; Balza et al , 2006 ; Calcinotto et al 2012 ) . Inoltre,
la terapia NGR-TNF è stato dimostrato di aumentare rapidamente la diffusione intratumorale di farmaci chemioterapici come doxorubicina come conseguenza del danno
inflitto l'integrità del sistema vascolare del tumore con conseguente aumento della
permeabilità vascolare ( Sacchi et al , 2006 ; Gregorc et al 2009 ).
Una delle proprietà di VDAs-vascolari di targeting diretto convenzionalmente dosati,
che è stato preclinico dimostrato di limitare la sua altrimenti potente efficacia
antitumorale iniziale, è il suo effetto sulla indurre una mobilizzazione sistemica
rapido BMDCs compresi CEP e / o TEM che poi a casa e colonizzare i tumori trattati
con farmaci ( Shaked et al , 2006 ; Welford et al , 2011 ; Taylor et al , 2012 ). La
risposta dell'ospite CEP può essere parzialmente bloccata da cotrattamento con
VEGF- o VEGF receptor-2-anticorpi neutralizzanti, che si traduce in effetti
antitumorali miglioramento mediati dalla VDA ( Shaked et al , 2006 ). Sulla base di
queste osservazioni, imitando le dosi utilizzate in ambito clinico, abbiamo studiato se
NGR-TNF, rispetto ad altri agenti di targeting vascolare, provoca un aumento di
citochine circolanti fattori ospite-derivati
o di crescita e di mobilita / recluta BMDCs al
sito del tumore . Abbiamo testato due differenti dosi di NGR-TNF, un basso e una
dose elevata. Studi clinici hanno dimostrato che basse dosi di NGR-hTNF, per
esempio, 0,8 μ g m -2 (cioè 18 ng per kg), sono più efficaci di dosi più elevate (
Gregorc et al , 2010a ; Zucali et al , 2013 ). I nostri risultati indicano infatti che la
http://www.nature.com/bjc/journal/v109/n2/full/bjc2013347a.html
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bassa dose di NGR-TNF né induce la robusta mobilitazione di diversi tipi di BMDCs,
tra cui funghi porcini, TEM e MDSCs, né aumenta i livelli di G-CSF, SDF-1 e OPN. Al
contrario, i trattamenti con alte dosi di NGR-TNF provocato BMDC mobilitazione e un
aumento dei livelli di fattori di crescita. Queste risposte sono simili in natura a quelli
osservati con VDAs convenzionalmente dosaggio o di alcuni farmaci chemioterapici
somministrati a dosi massime tollerate ( Bertolini et al , 2003 ; Shaked et al , 2006 ,
2008 ; Welford et al 2011 ). Sia che basse dosi di VDAs somministrate in una pianificazione modo metronomica
sarebbe anche evitare l'induzione di risposte BMDC e avrebbero mostrato simile o
addirittura maggiore efficacia antitumorale è attualmente sconosciuta, e vale la pena
indagare. Un'altra questione aperta, che merita più profonda indagine in modelli
tumorali adatti, è l'effetto che il trattamento NGR-TNF può avere sul processo
metastatico, che è noto per essere rafforzata da BMDC mobilitazione ( GengisVelitski et al 2011 ).
Abbiamo osservato che, come già riportato da altri ( Shaked et al , 2006 ; Taylor et
al 2012 ), i topi trattati con VDA ha mostrato un aumento significativo del-tumore
infiltrante GFP + BMDCs rispetto a quella nei topi trattati con soluzione salina.
Risultati simili, anche se non statisticamente significativo, sono stati osservati anche
in alte dosi gruppo di NGR-TNF, suggerendo una correlazione tra l'aumento di funghi
porcini, TEM e MDSCs rilevati nel sangue periferico e il livello di GFP + BMDCs
osservata nei tumori. D'accordo, i topi somministrato con basse dosi di NGR-TNF e
anti-VEGFR2, gli agenti che non mobilitano BMDCs proangiogenetici, hanno mostrato
l'incorporazione delicata di GFP + BMDCs nei tumori LLC, paragonabile a quella
osservata nei topi trattati con soluzione salina.
I nostri risultati aggiungono a un crescente corpo di prove che dimostrano i
potenziali benefici dell'utilizzo di farmaci citotossici, compresa la chemioterapia, nei
protocolli di pianificazione e di dosaggio più metronomiche-like. Inoltre, le proprietà
e meccanismi di azione di NGR-TNF suggeriscono che sarebbe una droga
particolarmente promettente di prendere in considerazione non solo per la terapia di
prima linea in combinazione con la chemioterapia, ma anche come terapia di
seconda linea quando la resistenza ai farmaci antiangiogenici, come bevacizumab o
piccole TKI molecolari ha sviluppato. In tali situazioni, l'uso di un agente mirato ai
vasi sanguigni molecolare ad azione diretta potrebbe essere particolarmente efficace
in quanto la sua azione non dipende VEGF o VEGF recettori come bersaglio e anche
perché sfrutta meccanismi antitumorali aggiuntivi, come la stimolazione
dell'immunità ospitante. In sintesi, i nostri risultati forniscono un razionale per
l'utilizzo di basse dosi orari amministrazione NGR-TNF ripetitivi nella clinica, oltre alle
tossicità ridotta attesi che ne deriverebbero per tali protocolli.
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Note
Questo lavoro è pubblicato sotto la licenza standard per pubblicare un accordo. Dopo
12 mesi il lavoro sarà liberamente disponibile e le condizioni di licenza si passa a
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Unported.
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