Impiego di Metapneumovirus aviare (AMPV) come vaccino vivo ricombinante
per l’espressione di proteine immunogene di virus respiratori del pollo.
XXVIII Ciclo di Dottorato
Dr. Andrea Laconi
Tutor: Prof.ssa Elena Catelli
INTRODUZIONE
Metapneumovirus aviare (AMPV) è un virus della famiglia Paramyxoviridae, il cui genoma, costituito da un singolo filamento di RNA a polarità negativa di circa
13.3kb, comprende 8 geni (3’-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5’) codificanti per 9 proteine. Da un punto di vista genotipico AMPV è suddiviso in 4 sottotipi (A, B, C, e D).
AMPV è responsabile nel pollame d’infezioni delle vie respiratorie superiori, spesso accompagnate ed esacerbate da infezioni batteriche secondarie.
La reverse genetics (RG) è un ramo della genetica che utilizza un approccio opposto a quello della genetica classica, prefiggendosi di valutare il fenotipo partendo
dalla sequenza nucleotidica. Con l'avvento delle tecnologie di ingegneria genetica è stato possibile alterare la sequenza nucleotidica dei geni bersaglio, verificando
l'effetto a livello di fenotipo. Nel 2004 Naylor et al. hanno messo a punto, presso l’Università di Liverpool (UK), un sistema di reverse genetics per il sottotipo A di
AMPV. Tale sistema prevede la modifica della sequenza nucleotidica virale inserita all'interno di un plasmide e, a seguito di trasfezione in cellule VERO,
l'ottenimento di cloni infettivi geneticamente modificati. Grazie a questo sistema è stato possibile a) ottenere informazioni sulla biologia virale di AMPV attraverso
la delezione o la soppressione di uno o più geni, b) valutare l'espressione genica, attraverso l'inserimento di geni reporter, c) inserire geni eterologhi e valutarne
l'espressione in vitro e in vivo (Falchieri et al., 2013). La capacità di AMPV di accettare ed esprimere geni eterologhi ha suggerito il suo possibile utilizzo come
vettore di proteine immunogene di virus respiratori del pollo per la produzione di vaccini vivi ricombinanti.
OBIETTIVO DELLA RICERCA
OBIETTIVO DEL PRIMO ANNO DI DOTTORATO
Sviluppare dei vaccini vivi ricombinanti polivalenti per la
Utilizzando la metodica di reverse genetics per AMPV messa a punto
profilassi delle infezioni da parte di AMPV, del Virus della
Bronchite Infettiva (IBV), del Virus della Laringotracheite
presso l’Università di Liverpool (UK), ottenere dei cloni infettivi del
Infettiva (ILTV)
ceppo di campo IT/ty/Vr240/87.
e del Virus della Malattia di Newcastle
(NDV).
MATERIALI E METODI
Primer RT
Sequenza (5'-3')
Posizione
Fb6-
GTTATGCTTGTCTGCTGCGGG
3837
1- AMPLIFICAZIONE DELL'INTERO GENOMA DI AMPV MEDIANTE PCR: anzitutto è stato necessario
GAB3neg
GTATCTCCCTGACAAATTGGTCCTG
6427
ottenere una copia della sequenza nucleotidica del ceppo IT/ty/Vr240/87. A tal scopo è stato sviluppato un
M2AB1+
GAATCCAGCAAATCTCATAAACAGTCTAA
5004
protocollo di Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) in grado di amplificare, tramite 4
PCR overlapping, l'intero genoma di AMPV (Figura 1). Gli amplificati sono stati ottenuti utilizzando 3
primer per la reazione di retrotrascrizione (Tabella 1) e 4 distinte coppie di primer per la PCR (Tabella 2).
GENOMA IT/ty/Vr240/87
Leader
Tabella 1: primer utilizzati per le reazioni di retrotrascrizione
Primer PCR
Sequenze (5’-3’)
Posizione
APV Lead
ACGAGAAAAAAACGCATTCAAGCAGG
1
Fb6-
GTTATGCTTGTCTGCTGCGGG
3837
FAB1+
GCTAAAACAATAAGATTAGAAGGGGAGGT
3315
GAB3 neg
GTATCTCCCTGACAAATTGGTCCTG
6427
G17+b
CAAGTATCCAGATGGGGTCAGAGC
6004
LAB4 neg
CCCCACACTTAATTCCCTTTCTTTTCC
9016
LAB3+
CGTGTACTAGAGTTTTACTTGAAGGATGC
8905
Lend B meg
CTTTATGGTCTATTTTGTGCTCAGTATGTACC
13352
Dimensione
3837 bp
3112 bp
Trailer
RT1
3012 bp
RT2
RT3
PCR1
4447
Tabella 2: primer utilizzati per le reazioni di PCR
PCR2
PCR3
PCR4
Figura 1: rappresentazione schematica della strategia utilizzata per ottenere la copia del genoma del ceppo IT/ty/Vr240/87
2- MODIFICA DELLA SEQUENZA GENOMICA TRAMITE SITE DIRECTED MUTAGENESIS
Plasmide
contenente la
sequenza del
vaccino vivo
attenuato
PCR1
(SDM): è stata utilizzata una metodica di SDM basata sull'amplificazione di un plasmide, fornitoci
dall’Università di Liverpool (UK,) contenente la sequenza di un vaccino vivo attenuato, utilizzando come
primer gli amplificati precedentemente ottenuti tramite PCR (PCR1, PCR2, PCR3 e PCR4). Appaiandosi alla
regione complementare del genoma vaccinale, gli amplificati della sequenza nucleotidica del ceppo di campo
promuovono la reazione di polimerizzazione a catena dell'intero plasmide, venendo incorporati nel filamento
5’
3’
3’
5’
di DNA in fase di accrescimento. Sono così stati ottenuti i plasmidi contenenti la sequenza del ceppo di
campo IT/ty/Vr240/87.
Sequenza in fase di
accrescimento
3- TRASFORMAZIONE: mediante trasformazione batterica, effettuata utilizzando le cellule competenti
Stbl2 (E. coli), è stato possibile selezionare ed amplificare i costrutti plasmidici ottenuti tramite SDM.
4- SCREENING: le colonie sono state sottoposte a PCR di screening, per confermare la presenza dei
costrutti modificati. Le colonie positive allo screening sono state raccolte e stoccate per il successivo
utilizzo.
Plasmide in cui è
stata incorporata la
sequenza del ceppo
di campo
amplificata con la
PCR1
NEI PROSSIMI MESI
Si procederà all'estrazione del DNA plasmidico dalle colonie risultate positive allo screening e al
Figura 2: rappresentazione schematica della strategia utilizzata per copiare il frammento del genoma
del ceppo IT/ty/Vr240/87 corrispondente alla PCR1 all’interno del plasmide contente la sequenza del
vaccino vivo attenuato.
sequenziamento del genoma inserito nel plasmide. Il confronto tra le sequenze nucleotidiche ottenute e quella
del vaccino vivo attenuato permetterà di confermare la presenza del genoma del ceppo IT/ty/Vr240/87
all'interno dei plasmidi.
A seguito di tale conferma, sarà possibile procedere alla trasfezione su cellule VERO, seguendo la metodica
messa a punto presso l'Università di Liverpool (UK), al fine di ottenere i cloni infettivi.
BIBLIOGRAFIA
Falchieri M., Lupini C., Cecchinato M., Catelli E., Kontolaimou M., Naylor C.
J. (2012). Avian Metapneumoviruses expressing Infectious Bronchitis virus
genes are stable and induce protection. Vaccine 31: 2565-71
Naylor C. J., Brown P. A., Edworthy N., Ling R., Jones R. C., Savage C. E..
Development of a reverse-genetics system for Avian Metapneumovirus
demostrates that the small hydrophobic (SH) and attachment (G) genes are not
essential for virus viability. J Gen Virol 2004; 85(November): 3219-27
