SENSORI & BIOSENSORI: Analisi dei Prodotti Gianfranco Greppi Laboratorio di Bionanotecnologie. Porto Conte Ricerche Università di Sassari Sommario l l l l Ricerca e Trasferimento Perché i biosensori La tecnolgia Le applicazioni Le Università costituiscono da sempre uno dei blocchi costituivi dei cosiddetti sistemi della ricerca e dell'innovazione Università building block Enti pubblici e Non-profit Imprese con i propri laboratori infrastrutture di base RECESSIONE E MANCATA RICERCA Nel 2003 investimenti in ricerca 16 miliardi Euro OCSE Francia 38 miliardi ULTIMO DEI PAESI DEL G7 Unico con oltre 50% finanziamento pubblico INVESTIMENTI IN CONOSCENZA 1,8 vs 4,5 Paesi OCSE PIA, POR, MIUR innovazione PRODUTTIVITA +0,8 Un percorso per il trasferimento tecnologico nel settore delle Biotecnologie Relatore: GIANFRANCO GREPPI- Il sistema della ricerca, della sperimentazione e del trasferimento dell innovazione Le Università costituiscono da sempre uno dei blocchi costituivi dei cosiddetti sistemi della ricerca e dell'innovazione Università building block Enti pubblici e Non-profit Imprese con i propri laboratori infrastrutture di base l Ogni istituzione può giocare molteplici ruoli: formazione, ricerca fondamentale e applicata, sviluppo tecnologico l - i legami tra gli attori del sistema si sono intensificati: le collaborazioni tra imprese, Enti e Università, non sono più eventi sporadici ma prassi comune; esse coinvolgono crescenti flussi di risorse finanziarie, di uomini e di conoscenze - la comparsa e l'affermazione del sistema finanziario come nuovo attore nei SI, con un ruolo del Venture Capital -Start-up nei settori di punta tecnologica, originate nelle Università e nei Centri di Eccellenza scientifica. l l RECESSIONE E MANCATA RICERCA Nel 2003 investimenti in ricerca 16 miliardi Euro OCSE Francia 38 miliardi ULTIMO DEI PAESI DEL G7 Unico con oltre 50% finanziamento pubblico INVESTIMENTI IN CONOSCENZA 1,8 vs 4,5 Paesi OCSE PIA, POR, MIUR innovazione PRODUTTIVITA +0,8 TRASFERIMENTO SPIN-OFF SPIN-OFF APPLICATA APPLICATA RICERCA DI BASE RICERCA DI BASE DIDATTICA DIDATTICA RECESSIONE E MANCATA RICERCA SPIN-OFF APPLICATA RICERCA DI BASE DIDATTICA BIOTECH & PMI (2003) I m p r e s e b i o t e c n o l o g i c h e p e r s e t t o r e m e r c e o l o g i c o 12 A mb i e n t e 11 C h i mi c o 22 A g r o a l i me n t a r e 58 C u r a d e l l a s a l u t e 0 10 20 30 40 50 60 70 Impiegano 1700 addetti e realizzano un fatturato di 250 milioni di euro. BIOTECH & PMI (2003) T ec nologie applic ate nelle impr es e biotec nologic he in Italia 12 B io info rmatic a 13 B io remediatio n 5 C ellule s taminali 10 C himic a c o mbinato ria G eno mic a e pro teo mic a 22 A ntic o rpi m o no c lo nali 22 23 C lo naggio in m ic ro rganis mi piante e d a nimali, D N A ric o mbinante 24 A c idi nuc leic i e s o nde 14 B io tras fo rmazio ni, e nzimo lo gia e bio c atalis i 28 F ermentazio ne, s eparazio ne dei pro do tti 42 PCR 0 5 10 15 20 25 30 35 40 n impr es e 45 BIOTECH & PMI 1990 vs 2010 Vecchi valori BASSI COSTI HIGH THROUGHPUT Nuovi valori QUALITA DEI DATI INTEGRAZIONE STANDARDIZZAZIONE DECENTRALIZZAZIONE INFORMAZIONE CURVA APPRENDIMENTO ACCELERATA BIOTECH & PMI 2006-2010 SCREENING NUOVI LEAD PROTEOMICA MICRO DIMENSIONI INFORMAZIONE DIGITALE NUOVE PIATTAFORME BASSI CONSUMI REAGENTI MISURE DIRETTE GENOMICA ARRAY BIOTECH & PMI TREND BIO-NANOTEC PER LA SALUTE E PER LA BIOSICUREZZA DEI PRODOTTI BIOTECH & PMI TREND BIOTECH & PMI PRODOTTI PIATTAFORMA BIOTECH RICERCA ANALISI BIOLOGICA IDENTIFICA IL TARGET PROTEOMICA VALIDA IL TARGET SVILUPPO ANALISI CHIMICA IDENTIFICA IL LEAD OTTIMIZZA LEAD Bioinformatica GENOMICA TEST PRE-CLINICI FARMACOGENOMICA TEST CLINICI DRUG DELIVERY Biotech & Fusion Technologies Genomics, Proteomics and Bioinformatics: Combinatorial –chemistry Peptide libraries- tea bags, beads Combinatorial –biology Directed evolution DNA Shuffling, Molecular Breeding High throughput analysis: Nucleic Acid based Sequencing Microarrays Protein based. 2-D, electrospray/nanospray MS: MALDI-TOF, LC/MS/MS, SELDI Bioinformatica Imaging/optical biology. Biosensors, Bioelectronics Bionetworks (Nanotechnology). MICROARRAY PROTEOMICA La conoscenza deve scorrere da quelli che sanno le cose a quelli che fanno cose Joel Mokyr Historical Origins of Knowledge Economy Princeton University 2002 Perchè i biosensori? l I biosensori sono degli strumenti analitici con potenzialità enormi, sia in termini di interesse scientifico, sia in termini di applicazioni commerciali: – – – – – – Capo medico diagnostico. Analisi dei pesticidi e contaminanti delle acque Analisi in remoto per contaminazioni batteriche nelle attività bioterrorismo. Analisi dei patogeni negli alimenti Analisi di routine dell’acido flico, biotina, vitamina B12 e acido pantotenico Analisi di antibiotici negli alimenti I biosensori l I BIOSENSORI sono degli strumenti analitici costituiti da un componente biologico e un trasduttore. trasduttore comp. biologico film protettivo PC Schema logico di un sensore Analite Bioreceptor Biological sensing element Unità di elaborazione Transducer Unità di memorizzazione Signal Interfaccia elettronica Perchè i biosensori? l Analisi degli alimenti – – – – – Analisi dei pesticidi e contaminanti delle acque Analisi dei patogeni Analisi diossine Analisi di routine dell’acido flico, biotina, vitamina B12 e acido pantotenico Analisi di antibiotici Cosa misura il biosensore? l L attività dell enzima: I trasduttori Trasduttori usati per la costruzione di biosensori: I generazione Trasduttori Elettrochimici Amperometrici II generazione III generazione Ottici Acustici Potenziometrici Elettrodi a vetro Termici Conduttimetrici ISE ISFET Trasduttori ottici It A = − log = ε ⋅ ⋅ C I0 l Un biosensore a trasduttore ottico misura i cambio di assorbanza di uno strato di reagente biologico che interagisce con l analita. Risonanza di superficie a plasmon l SPR Trasduttori acustici Δf = −k (Δm ) (eq. di Sauebrey) Trasduttori potenziometrici l pHmetro: – Glucosio ossidasi l – glucose + O2 à gluconolactone + H2O2 à gluconate + H+ Lipasi l lipide neutro + H2O à glicerolo + acidi grassi + H+ RT E=E + ln ai nF (eq. di Nernst) 0 Trasduttori potenziometrici l ISE al NH4+: – L-amino ossidasi l – L-amino acido + O2 + H2O à keto acido + NH4+ + H2O2 asparaginasi l L-asparagine + H2O à L-aspartate + NH4+ RT E=E + ln ai nF (eq. di Nernst) 0 Trasduttori potenziometrici l ISE al I-: – perossidasi l l H2O2 + 2H+ + 2I- à I2 + 2H2O ISE al CN-: – glucosidasi l amigdalina + 2H2O à 2glucose + benzaldeide + H+ + CN- RT E=E + ln ai nF (eq. di Nernst) 0 Trasduttori conduttimetrici substrato prodotto Enzima Lamina d oro o di platino 120.0 l Il prodotto di una reazione enzimatica cambia la conducibilità della soluzione in prossimità degli elettrodi. Trasduttori amperometrici L amperometria misura una corrente ad un potenziale applicato costante. Add 10µM steady-state Add 10µM ∂C i = nFAD ∂x (eq. di Nernst Plank) Current l steady-state background Time Amperometria Corrente e potenziale l l Su un metallo inerte, applico un potenziale anodico, o catodico, relativamente ad un elettrodo di riferimento. Il metallo misura una corrente anodica o catodica, in base al numero delle specie in soluzione che si possono ossidare o ridurre. Potenziale anodico e catodico e- +++++ Potenziale anodico: e- --------Potenziale catodico: La superficie è povera di elettroni. La superficie è ricca di elettroni. Una specie chimica capace di donare elettroni verrà ossidata Una specie chimica capace di ricevere elettroni verrà ridotta Biosensori amperometrici Substrato ox Substrato red H2O2 Working electrode elettroni O2 Biosensori amperometrici l Si classificano in I, II e III generazione Biosensori della I generazione l La prima classe di biosensori amperometrici riguarda la misura diretta del prodotto della reazione enzimatica: – – – Perossido di idrogeno NADH Consumo del cofattore (ossigeno) Substrato ox Substrato red H2O2 Working electrode elettroni O2 Biosensori della I generazione l Il primo biosensore fu ideato da Clark nel 1962. Esso si basava sulla misura dell ossigeno consumato durante la reazione enzimatica di un ossidasi, tramite un elettrodo di platino polarizzato a -700 mV, seguendo la reazione: O2 + 4H + 4e → 2H 2O + l − Il range dinamico di questo dispositivo è circa tra 50 µM e 1 mM. Biosensori della I generazione l Un alternativa al primo biosensore si basa: – – sulla imobilizzazione dell’enzima direttamente sulla superficie dell’elettrodo sulla misura del perossido di idrogeno prodotto durante la reazione enzimatica, tramite un elettrodo di platino polarizzato a +700 mV, seguendo la reazione: H 2O2 → 2H + O2 + 2e + − Biosensori della I generazione l Il perossido di idrogeno può anche venire ridotto all elettrodo di platino, secondo la seguente equazione: H 2O2 + 2H + 2e → 2H 2O + − Biosensori della I generazione l Alternativamente, è possibile misurare la produzione di NADH da NAD+ quando si usano enzimi tipo deidrogenasi: NADH → NAD + H + 2e + l + − Il NADH è ossidato all elettrodo, ma sono richiesti potenziali molto alti. Biosensori II generazione l I biosensori si sono evoluti, sostituendo il cofattore naturale dell enzima con una molecola capace di traghettare gli elettroni dal centro attivo dell enzima alla superficie del trasduttore amperometrico. Substrato ox Substrato red Mediatore red Working electrode elettroni Mediatore ox Cos è un mediatore? l I mediatori si possono classificare in: – – – – l Molecole organiche Complessi organici di metalli di transizione Molecole inorganiche Polimeri conduttori Idealmente, il mediatore dovrebbe essere piccolo da entrare facilmente nel sito attivo dell enzima, essere riciclabile, scambiare elettroni velocemente con l elettrodo. Cos è un mediatore? Cos è un mediatore? l Per un processo reversibile: i p = 2.69 ⋅105 n3 / 2 AD1/ 2Cv1/ 2 i pa =1 i pc E pa − E pc = 0.059 / n 0' E = E pa + E pc 2 Biosensori II generazione l Ulteriori sviluppi nell utilizzo dei biosensori della II generazione riguardano l impiego di polimeri conduttori: – – – l Polipirrolo Polianilina Politiofene Questi polimeri hanno la capicità di formare film conduttivi, che possono essere impiegati per immobilizzare enzimi e mediatori di vario tipo. Biosensori II generazione polianilina polipirrolo politiofene Il premio nobel per la Chimica nel 2000 fu attribuito a Alan J. Heeger, Alan G MacDiarmid, e Hideki Shirakawa per il loro lavoro sui polimeri conduttori. Biosensori III generazione Componenti bioattivi COMP. BIOATTIVI Enzimi biocatalitici microrganismi Cellule biorecettori Acidi Nucleici Anticorpi tessuti Biotecnologia Applicata: Analisi dei Prodotti Vegetali AA 2007 - 2008 Lezione 7 no enzyme present e n e r g y enzyme present Intermediate : enzyme/reactant 1 reactant 1 + reactant 2 + reactant 2 + enzyme products + enzyme Course of reaction Replay Close window Fattori che influenzano l attività Tecniche di immobilizzazione assorbimento fisico Fisica ritenzione incorporazione su gel su membrane pasta di carbone inchiostri polimerizzazione polimeri conduttori Chimica Legame covalente sull elettrodo su membrana