LEZIONE 2 Biosensori Greppi - Laboratorio di Bionanotecnologie

SENSORI & BIOSENSORI:
Analisi dei Prodotti
Gianfranco Greppi
Laboratorio di
Bionanotecnologie.
Porto Conte Ricerche
Università di Sassari
Sommario
l 
l 
l 
l 
Ricerca e Trasferimento
Perché i biosensori
La tecnolgia
Le applicazioni
Le Università costituiscono da sempre
uno dei blocchi costituivi dei cosiddetti
sistemi della ricerca e dell'innovazione
Università
building block
Enti pubblici e Non-profit
Imprese con i propri laboratori
infrastrutture di base
RECESSIONE E MANCATA RICERCA
Nel 2003 investimenti in ricerca 16 miliardi Euro OCSE
Francia 38 miliardi
ULTIMO DEI PAESI DEL G7
Unico con oltre 50%
finanziamento pubblico
INVESTIMENTI IN CONOSCENZA
1,8 vs 4,5 Paesi OCSE
PIA, POR,
MIUR innovazione
PRODUTTIVITA +0,8
Un percorso per il trasferimento tecnologico nel
settore delle Biotecnologie
Relatore: GIANFRANCO GREPPI-
Il sistema della ricerca, della sperimentazione e
del trasferimento dell innovazione
Le Università costituiscono da sempre uno
dei blocchi costituivi dei cosiddetti sistemi
della ricerca e dell'innovazione
Università
building block
Enti pubblici e Non-profit
Imprese con i propri laboratori
infrastrutture di base
l 
Ogni istituzione può giocare molteplici ruoli: formazione, ricerca
fondamentale e applicata, sviluppo tecnologico
l 
- i legami tra gli attori del sistema si sono intensificati: le
collaborazioni tra imprese, Enti e Università, non sono più eventi
sporadici ma prassi comune; esse coinvolgono crescenti flussi di
risorse finanziarie, di uomini e di conoscenze
- la comparsa e l'affermazione del sistema finanziario come nuovo
attore nei SI, con un ruolo del Venture Capital
-Start-up nei settori di punta tecnologica, originate nelle Università e
nei Centri di Eccellenza scientifica.
l 
l 
RECESSIONE E MANCATA RICERCA
Nel 2003 investimenti in ricerca 16 miliardi Euro OCSE
Francia 38 miliardi
ULTIMO DEI PAESI DEL G7
Unico con oltre 50%
finanziamento pubblico
INVESTIMENTI IN CONOSCENZA
1,8 vs 4,5 Paesi OCSE
PIA, POR,
MIUR innovazione
PRODUTTIVITA +0,8
TRASFERIMENTO
SPIN-OFF
SPIN-OFF
APPLICATA
APPLICATA
RICERCA DI BASE
RICERCA DI BASE
DIDATTICA
DIDATTICA
RECESSIONE E MANCATA RICERCA
SPIN-OFF
APPLICATA
RICERCA DI BASE
DIDATTICA
BIOTECH & PMI (2003)
I m p r e s e b i o t e c n o l o g i c h e p e r s e t t o r e m e r c e o l o g i c o
12
A mb i e n t e
11
C h i mi c o
22
A g r o a l i me n t a r e
58
C u r a d e l l a s a l u t e
0
10
20
30
40
50
60
70
Impiegano 1700 addetti e realizzano un fatturato di 250 milioni di euro.
BIOTECH & PMI (2003)
T ec nologie applic ate nelle impr es e biotec nologic he in Italia
12
B io info rmatic a
13
B io remediatio n
5
C ellule s taminali
10
C himic a c o mbinato ria
G eno mic a e pro teo mic a
22
A ntic o rpi m o no c lo nali
22
23
C lo naggio in m ic ro rganis mi piante e d a nimali, D N A ric o mbinante
24
A c idi nuc leic i e s o nde
14
B io tras fo rmazio ni, e nzimo lo gia e bio c atalis i
28
F ermentazio ne, s eparazio ne dei pro do tti
42
PCR
0
5
10
15
20
25
30
35
40
n impr es e
45
BIOTECH & PMI 1990 vs 2010
Vecchi valori
BASSI COSTI
HIGH THROUGHPUT
Nuovi valori
QUALITA DEI DATI
INTEGRAZIONE
STANDARDIZZAZIONE
DECENTRALIZZAZIONE
INFORMAZIONE
CURVA APPRENDIMENTO ACCELERATA
BIOTECH & PMI 2006-2010
SCREENING
NUOVI LEAD
PROTEOMICA
MICRO DIMENSIONI
INFORMAZIONE DIGITALE
NUOVE PIATTAFORME
BASSI CONSUMI REAGENTI
MISURE DIRETTE
GENOMICA
ARRAY
BIOTECH & PMI TREND
BIO-NANOTEC PER LA SALUTE E
PER LA BIOSICUREZZA DEI
PRODOTTI
BIOTECH & PMI TREND
BIOTECH & PMI PRODOTTI
PIATTAFORMA BIOTECH
RICERCA
ANALISI BIOLOGICA
IDENTIFICA IL
TARGET
PROTEOMICA
VALIDA
IL TARGET
SVILUPPO
ANALISI CHIMICA
IDENTIFICA IL
LEAD
OTTIMIZZA
LEAD
Bioinformatica
GENOMICA
TEST
PRE-CLINICI
FARMACOGENOMICA
TEST
CLINICI
DRUG DELIVERY
Biotech & Fusion Technologies
Genomics, Proteomics and Bioinformatics:
Combinatorial –chemistry Peptide libraries- tea bags, beads
Combinatorial –biology Directed evolution DNA Shuffling, Molecular
Breeding
High throughput analysis:
Nucleic Acid based Sequencing
Microarrays Protein based.
2-D, electrospray/nanospray MS: MALDI-TOF, LC/MS/MS,
SELDI
Bioinformatica
Imaging/optical biology.
Biosensors, Bioelectronics Bionetworks (Nanotechnology).
MICROARRAY
PROTEOMICA
La conoscenza
deve scorrere da
quelli che sanno
le cose
a quelli che fanno
cose
Joel Mokyr Historical Origins of Knowledge
Economy Princeton University 2002
Perchè i biosensori?
l 
I biosensori sono degli strumenti analitici con
potenzialità enormi, sia in termini di interesse
scientifico, sia in termini di applicazioni commerciali:
– 
– 
– 
– 
– 
– 
Capo medico diagnostico.
Analisi dei pesticidi e contaminanti delle acque
Analisi in remoto per contaminazioni batteriche nelle attività
bioterrorismo.
Analisi dei patogeni negli alimenti
Analisi di routine dell’acido flico, biotina, vitamina B12 e
acido pantotenico
Analisi di antibiotici negli alimenti
I biosensori
l 
I BIOSENSORI sono degli strumenti analitici
costituiti da un componente biologico e un
trasduttore.
trasduttore
comp. biologico
film protettivo
PC
Schema logico di un sensore
Analite
Bioreceptor
Biological sensing element
Unità di
elaborazione
Transducer
Unità di
memorizzazione
Signal
Interfaccia
elettronica
Perchè i biosensori?
l 
Analisi degli alimenti
– 
– 
– 
– 
– 
Analisi dei pesticidi e contaminanti delle acque
Analisi dei patogeni
Analisi diossine
Analisi di routine dell’acido flico, biotina,
vitamina B12 e acido pantotenico
Analisi di antibiotici
Cosa misura il biosensore?
l 
L attività dell enzima:
I trasduttori
Trasduttori usati per la costruzione di biosensori:
I generazione
Trasduttori
Elettrochimici
Amperometrici
II generazione
III generazione
Ottici
Acustici
Potenziometrici
Elettrodi a vetro
Termici
Conduttimetrici
ISE
ISFET
Trasduttori ottici
It
A = − log = ε ⋅  ⋅ C
I0
l 
Un biosensore a trasduttore ottico misura i
cambio di assorbanza di uno strato di
reagente biologico che interagisce con
l analita.
Risonanza di superficie a plasmon
l 
SPR
Trasduttori acustici
Δf = −k (Δm )
(eq. di Sauebrey)
Trasduttori potenziometrici
l 
pHmetro:
– 
Glucosio ossidasi
l 
– 
glucose + O2 à gluconolactone + H2O2 à gluconate + H+
Lipasi
l 
lipide neutro + H2O à glicerolo + acidi grassi + H+
RT
E=E +
ln ai
nF
(eq. di Nernst)
0
Trasduttori potenziometrici
l 
ISE al NH4+:
– 
L-amino ossidasi
l 
– 
L-amino acido + O2 + H2O à keto acido + NH4+ + H2O2
asparaginasi
l 
L-asparagine + H2O à L-aspartate + NH4+
RT
E=E +
ln ai
nF
(eq. di Nernst)
0
Trasduttori potenziometrici
l 
ISE al I-:
– 
perossidasi
l 
l 
H2O2 + 2H+ + 2I- à I2 + 2H2O
ISE al CN-:
– 
glucosidasi
l 
amigdalina + 2H2O à 2glucose + benzaldeide + H+ + CN-
RT
E=E +
ln ai
nF
(eq. di Nernst)
0
Trasduttori conduttimetrici
substrato
prodotto
Enzima
Lamina d oro o di platino
120.0
l 
Il prodotto di una reazione enzimatica cambia la conducibilità
della soluzione in prossimità degli elettrodi.
Trasduttori amperometrici
L amperometria misura una corrente ad un
potenziale applicato costante.
Add 10µM
steady-state
Add 10µM
∂C
i = nFAD
∂x
(eq. di Nernst Plank)
Current
l 
steady-state
background
Time
Amperometria
Corrente e potenziale
l 
l 
Su un metallo inerte, applico un potenziale
anodico, o catodico, relativamente ad un
elettrodo di riferimento.
Il metallo misura una corrente anodica o
catodica, in base al numero delle specie in
soluzione che si possono ossidare o ridurre.
Potenziale anodico e catodico
e-
+++++
Potenziale anodico:
e-
--------Potenziale catodico:
La superficie è povera di
elettroni.
La superficie è ricca di
elettroni.
Una specie chimica capace
di donare elettroni verrà
ossidata
Una specie chimica capace
di ricevere elettroni verrà
ridotta
Biosensori amperometrici
Substrato
ox
Substrato
red
H2O2
Working
electrode
elettroni
O2
Biosensori amperometrici
l 
Si classificano in I, II e III generazione
Biosensori della I generazione
l 
La prima classe di biosensori amperometrici riguarda
la misura diretta del prodotto della reazione
enzimatica:
– 
– 
– 
Perossido di idrogeno
NADH
Consumo del cofattore (ossigeno)
Substrato
ox
Substrato
red
H2O2
Working
electrode
elettroni
O2
Biosensori della I generazione
l 
Il primo biosensore fu ideato da Clark nel 1962. Esso
si basava sulla misura dell ossigeno consumato
durante la reazione enzimatica di un ossidasi,
tramite un elettrodo di platino polarizzato a -700 mV,
seguendo la reazione:
O2 + 4H + 4e → 2H 2O
+
l 
−
Il range dinamico di questo dispositivo è circa tra 50
µM e 1 mM.
Biosensori della I generazione
l 
Un alternativa al primo biosensore si basa:
– 
– 
sulla imobilizzazione dell’enzima direttamente sulla
superficie dell’elettrodo
sulla misura del perossido di idrogeno prodotto durante la
reazione enzimatica, tramite un elettrodo di platino
polarizzato a +700 mV, seguendo la reazione:
H 2O2 → 2H + O2 + 2e
+
−
Biosensori della I generazione
l 
Il perossido di idrogeno può anche venire
ridotto all elettrodo di platino, secondo la
seguente equazione:
H 2O2 + 2H + 2e → 2H 2O
+
−
Biosensori della I generazione
l 
Alternativamente, è possibile misurare la
produzione di NADH da NAD+ quando si
usano enzimi tipo deidrogenasi:
NADH → NAD + H + 2e
+
l 
+
−
Il NADH è ossidato all elettrodo, ma sono richiesti
potenziali molto alti.
Biosensori II generazione
l 
I biosensori si sono evoluti, sostituendo il cofattore
naturale dell enzima con una molecola capace di
traghettare gli elettroni dal centro attivo dell enzima alla
superficie del trasduttore amperometrico.
Substrato
ox
Substrato
red
Mediatore red
Working
electrode
elettroni
Mediatore ox
Cos è un mediatore?
l 
I mediatori si possono classificare in:
– 
– 
– 
– 
l 
Molecole organiche
Complessi organici di metalli di transizione
Molecole inorganiche
Polimeri conduttori
Idealmente, il mediatore dovrebbe essere
piccolo da entrare facilmente nel sito attivo
dell enzima, essere riciclabile, scambiare
elettroni velocemente con l elettrodo.
Cos è un mediatore?
Cos è un mediatore?
l 
Per un processo reversibile:
i p = 2.69 ⋅105 n3 / 2 AD1/ 2Cv1/ 2
i pa
=1
i pc
E pa − E pc = 0.059 / n
0'
E =
E pa + E pc
2
Biosensori II generazione
l 
Ulteriori sviluppi nell utilizzo dei biosensori
della II generazione riguardano l impiego di
polimeri conduttori:
– 
– 
– 
l 
Polipirrolo
Polianilina
Politiofene
Questi polimeri hanno la capicità di formare film
conduttivi, che possono essere impiegati per
immobilizzare enzimi e mediatori di vario tipo.
Biosensori II generazione
polianilina
polipirrolo
politiofene
Il premio nobel per la Chimica nel 2000 fu attribuito a
Alan J. Heeger, Alan G MacDiarmid, e Hideki
Shirakawa per il loro lavoro sui polimeri conduttori.
Biosensori III generazione
Componenti bioattivi
COMP. BIOATTIVI
Enzimi
biocatalitici
microrganismi
Cellule
biorecettori
Acidi Nucleici
Anticorpi
tessuti
Biotecnologia Applicata:
Analisi dei Prodotti Vegetali
AA 2007 - 2008
Lezione 7
no enzyme
present
e
n
e
r
g
y
enzyme
present
Intermediate :
enzyme/reactant 1
reactant 1
+
reactant 2
+
reactant 2
+
enzyme
products
+
enzyme
Course of reaction
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Fattori che influenzano l attività
Tecniche di immobilizzazione
assorbimento fisico
Fisica
ritenzione
incorporazione
su gel
su membrane
pasta di carbone
inchiostri
polimerizzazione
polimeri conduttori
Chimica
Legame covalente
sull elettrodo
su membrana