TUTTI GLI ENZIMI POSSONO ESSERE ANALIZZATI IN MODO DA
POTER QUANTIFICARE SIA LA VELOCITA’ DI REAZIONE CHE
LA LORO
EFFICIENZA ENZIMATICA
Lo studio della cinetica enzimatica inizia nel 1909 con
ADRIAN BROWN e i sui studi sulla velocità di IDROLISI del
SACCAROSIO catalizzata dall’enzima β-fruttofuranosidasi
SACCAROSIO + H2O
GLUCOSIO + FRUTTOSIO
Quando la concentrazione del saccarosio è molto più
elevata dell’enzima, la velocità di reazione diventa
indipendente dalla concentrazione del saccarosio
1
[E]
0
VV00 = =NUMERO
NUMERO
DI MOLI
DIDIMOLI DI
SUBSTRATO
P
RODOTTO
CHE SI CONSUMANO
CHE SI
FORMANO
IN
UN SECONDO
IN UN
AD SECONDO
UNA
AD
UNA CONCENTRAZIONE
CONCENTRAZIONE
FISSAFISSA
DI
DI
ENZIMA
ENZIMA
1
2
3
Il punto focale dell’ipotesi di
Michaelis e Menten sta nella
formazione di un
COMPLESSO ES SPECIFICO
come intermedio essenziale per
la catalisi
4
Leonor Michaelis e
Maud Menten nel 1913
proposero un semplice
modello matematico
per spiegare queste
caratteristiche
cinetiche
Velocità a differenti
concentrazioni di S
Michaelis e Menten
proposero che la
REAZIONE
ENZIMATICA
COMPLESSIVA
fosse costituita da
due REAZIONI
ELEMENTARI
COMPLESSO
ENZIMA-SUBSTRATO
E+S
K1
K3
ES
K2
P+E
La reazione
raggiunge
velocemente
l’equilibrio
2
Questi scienziati attraverso una serie di assunzioni
logiche vogliono determinare un equazione della velocità
che metta in relazione la velocità di reazione alla
concentrazione del substrato in una reazione catalizzata
da un enzima.
Vogliono cioè ricavare
l’equazione della velocità
che sia valida per una
qualsiasi reazione
catalizzata da un
qualsiasi enzima
LA PRIMA ASSUNZIONE ( assunzione dell' "equilibrio
rapido")
dice che il complesso ES è in equilibrio con l’E libero e il
S e che questa situazione di equilibrio non è disturbata
dalla formazione del P. In altre parole la velocità di
formazione del prodotto a partire da ES è molto piccola
rispetto alla velocità con cui ES si scinde per dare E+S
( k3 << k2 ).
La velocità di
catalisi è data
dalla formazione
del prodotto
(reazione più lenta)
V=
d[P]
dt
= K3[ES]
3
LA SECONDA ASSUNZIONE (assunzione della velocità
iniziale V0 )
la velocità della reazione viene valutata per un periodo di
tempo durante il quale la reazione inversa è fisicamente
trascurabile in quanto poco è il prodotto formatosi: la
velocità iniziale che può così essere determinata sarà la
massima velocità ottenibile.
In condizioni di velocità iniziale la reazione è di fatto
irreversibile (k4=0) e deve essere scritta nel seguente
modo:
Stato Prestazionario e Stato
Stazionario
4
LA TERZA ASSUNZIONE (assunzione dello "stato
stazionario“)
Stato Prestazionario e Stato
Stazionario
Dice che il complesso ES si mantiene in uno
stato stazionario durante tutto il periodo di tempo
in cui si possono misurare le velocità iniziali.
[ES] rimane costante per cui la
velocità con cui il complesso
ES si forma a partire da E+S
è uguale alla somma delle
velocità con cui si scinde per
dare E+P ed E+S.
5
ASSUNZIONE DELLO
STATO STAZIONARIO
[S] >> [E]
Velocità di sintesi di ES
rimane COSTANTE
equazione di conservazione
di massa per l'enzima:
COME SI ARRIVA
A L L’ E Q U A Z I O N E
DELLA VELOCITA’
V0 =K3[ES]
La concentrazione di ES deve essere scritta in
termini di concentrazioni note
v di SINTESI = v di CONSUMO
6
Svolgiamo l’equazione
portando le costanti tutte dalla
stessa parte
[E] [S]
=
[ES]
Velocità di
formazione
di ES
=
Velocità di formazione di ES
Velocità di scissione di ES
d[ES]
dt
=0
Velocità di
scissione di
ES
[ES]= K1[E] [S]
[ES]= (K2+K3) [ES]
K1 [E] [S] = K3 [ES] + K2 [ES]
(K3 + K2)
K1
(K3 + K2)
K1
= KM
K1 [E] [S] = K3 [ES] + K2 [ES]
COSTANTE DI
MICHAELIS
KM =
[E] [S]
[ES]
Per poter essere utilizzate le espressioni CINETICHE
devono essere formulate in quantità note
Poiché [E]T = [E] + [ES]
sostituendo
KM =
[E] = [E]T - [ES]
([E]T – [ES])[S]
[ES]
7
KM =
([E]T – [ES])[S]
Risolvendo rispetto a ES
[ES]
[ES] KM = [E]T [S]– [ES][S]
[ES] KM + [ES][S] = [E]T [S]
[ES] =
[ES] (KM + [S]) = [E]T [S]
[E]T[S]
KM + [S]
Poiché la velocità iniziale è data da
V0 =
d[P]
dt
= K3[ES]
Sostituendo a [ES]
l’equazione diventa:
[ES] = V0 / K3
V0 =
K3[E]T[S]
V0 =
KM + [S]
v0 =
VMAX [S]
QUANDO
[S]>> [E] TUTTO L’ENZIMA E’ SATURATO
[ES]
[ET]
V0= K3[ES]
V0= K3[ET]
KM + [S] VMAX = K3[ET]
Equazione di una iperbole
K3[E]T[S]
KM + [S]
8
Equazione di
Michaelis-Menten
v0 =
VMAX [S]
KM + [S]
quando
v0 =
VMAX [S]
VMAX
KM + [S]
2
Se VMAX è il valore dell’asintoto a cui
tende l’iperbole, a che valore
corrisponde la KM ?
V0 = VMAX/2
=
VMAX [S]
KM + [S]
VMAX (KM + [S]) = 2 VMAX [S]
VMAX diventa l’ asintoto
a cui tende l’iperbole
e KM ?
KM + [S] = 2 [S]
KM = [S]
La KM equivale alla concentrazione del substrato
quando la velocità è uguale a VMAX/2
9
Per concentrazioni di substrato
basse [S]<<Km
l'equazione di Michaelis-Menten
diviene l'equazione della retta:
v0 =
VMAX [S]
KM + [S]
Per concentrazioni di substrato
[S]>>Km
ANALISI DEI DATI CINETICI
L' equazione di Michaelis-Menten può
però essere manipolata per ottenere l'
equazione di una retta in cui Vmax e
Km siano delle intercette e non più
degli asintoti.
Grafico di Lineweaver e Burk o Grafico dei doppi reciproci
Trasforma l’equazione di un iperbole nell’equazione di una retta
v0 =
l'equazione di Míchaelis-Menten
si semplifica nella relazione:
1
V0
=
VMAX [S]
1
KM + [S]
KM
VMAX [S]
+
[S]
VMAX [S]
V0
=
KM + [S]
VMAX [S]
1
1 = KM 1 +
VMAX
V0
VMAX S
Equazione lineare rispetto a 1/v0 e 1/S
Y=mX+c
10
Equazione
di una retta
SVANTAGGI:
1)
la maggior parte delle misure sperimentali
di
[S] sono concentrate nella parte sinistra
del grafico.
2)
La KM ha un valore
unico per ciascuna
coppia ENZIMASUBSTRATO
piccoli valori di [S]
piccoli errori in v0
Grandi errori in
KM e VMAX
Grandi errori 1/v0
CORRISPONDE ALLA CONCENTRAZIONE DI
SUBSTRATO IN CUI LA VELOCITA’ DI REAZIONE E’
META’ DELLA VELOCITA’ MASSIMA
11
quando
KM =
(K3 + K2)
K1
K3 << K1
KM =
K2
K1
= KS
Capacità di incontrare
il substrato
Rappresenta la
capacità
dell’enzima di
legare il
substrato
alta affinità
A più alta (Km2) o
più bassa (Km1)
concentrazione di
substrato ottengo la
stessa V0 = VMAX/2
Costante di
EQUILIBRIO
KM = KS
Quando K1> K2
KM bassa
Quando K1<K2
KM alta
bassa affinità
La KM ha un valore unico per ciascuna coppia enzimasubstrato
12
Significato pratico della Km.
Il valore della Km è importante per varie ragioni:
q La Km rappresenta approssimativamente il valore
della concentrazione intracellulare del substrato.
q La Km è una costante specifica per ogni enzima, il suo
valore numerico ci fornisce un mezzo per comparare
enzimi provenienti da organismi diversi, da differenti
tessuti dello stesso organismo o dallo stesso tessuto a
differenti stadi di sviluppo: se due enzimi hanno valori
differenti di Km è probabile che siano due ISOENZIMI.
q c) Spesso ligandi differenti dal substrato provocano
modificazioni del valore della Km. Se la Km determinata in
vitro sembra essere troppo alta, allora è pensabile che in
vivo sia presente un inibitore che ne abbassi il valore ad
una livello 'fisiologico'.
q d) Se si conosce il valore della Km di un enzima, allora è
possibile misurarne la velocità di reazione in condizioni di
[S] di saturanti.
13
In realtà il valore della VMAX non è
una costante ma dipende dalla
quantità di enzima che è stata
messa per calcolare l’equazione
di Michaelis-Menten. MA poichè:
VMAX = K3[E]T
K 3=
KM
è anche chiamata:
Vmax
ET
= K cat
Quando
V0 =
moli/sec
moli
Misura la velocità di un processo
catalitico ( a carico di una molecola
enzimatica) ed ha le dimensioni: sec-1
NUMERO DI TURNOVER
Nella cellula la maggior parte degli enzimi non si trova mai a
concentrazione di substrato saturante ma a concentrazioni che
determinano una velocità che varia tra il 10-50% di quella massima
Numero di molecole di substrato trasformate da una
molecola enzimatica in un secondo
[S] << KM
Vmax [S]
V0 =
KM + [S]
Vmax
Kcat =
ET
[ES]molto piccolo
Vmax [S]
KM
Vmax = Kcat [ET]
[E] ≅ [E]T
La velocità diventa la
probabilità dell’enzima
di trovare il substrato e
il valore
V0 =
Kcat [E][S]
KM
Misura l’efficienza catalitica
di un enzima
Kcat/KM
14
A bassa
concentrazione di
substrato
V0 =
Kcat
KM
[E][S]
La TEORIA DELLA DIFFUSIONE dice che esiste un
valore teorico della capacità di incontro di due
molecole e questo valore è di 108 - 109 (moli/l)-1 s-1
La trioso isomerasi che catalizza la reazione di
isomerizzazione della G3P a DHAP possiede un valore di
Kcat/KM = 2,4 x 108 (mol/L)-1 sec-1.
Efficienza che si avvicina a quella massima
La maggior parte delle reazioni enzimatiche ha più substrati
per ognuno possiamo calcolare la l’efficienza catalitica
Da questi dati è abbastanza evidente che la
chimotripsina ha una predilezione ad operare
l’idrolisi in prossimità dei residui maggiormente
idrofobici
15
La velocità di reazione è limitata solo dalla velocità
con cui riescono ad incontrare il substrato in
soluzione.
I limiti imposti dalla
velocità di diffusione
possono essere
superati mediante
s t r u t t u r e
polienzimatiche
Complesso
multienzimatico
Possono essere divise in due classi : reazioni sequenziali
e reazioni a doppio spostamento
+
+
+
+
+
+
16
MECCANISMO ORDINATO
A
Prima tutti i substrati si
combinano con l’enzima
poi vengono rilasciati
come prodotti
P
B
MECCANISMO
CASUALE
A
B
E
Q
EAB—EPQ
B
Q
P
E
A
Q
P
Creatina chinasi
+
E
EA
EAB —EPQ
EQ
+
E
+
+
creatina ATP
piruvato NADH+H+
lattato
NAD+
E
E
E piruvato NADH —E lattato NAD+
E
Creatina P
E creatina ATP — E ADPcreatina P
ATP creatina
ADP
E
ADP Creatina P
17
Reazioni a doppio spostamento Reazioni a ping-pong
Uno o più prodotti vengono rilasciati dal complesso
prima che tutti i substrati si siano legati
P
A
B
Q
E
EA—FP
F
FB—EQ
+
+
Α-chetoglutarato
glutammato
E
In queste reazioni i reagenti non si incontrano mai sulla
superficie dell’enzima
+
+
E
Eglut-Fchetoglut
aspartato
ossalacetato
F
Fossal-Easpart
E
I meccanismi a due substrati, molto più complicate di
quelli a singolo, possono essere studiati con le misure
di cinetiche allo stato stazionario, contengono però 4
costanti cinetiche e possono essere utilizzate per
distinguere i vari meccanismi.
18
Gli studi di
CINETICA STAZIONARIA non danno
informazioni sulla velocità di formazione o quella di
scissione
né sulla natura del complesso ES né se
esistano uno o più complessi.
E + S D ES D EX D EP D E + P
OPPURE
EX
E + S D ES
EP D E + P
Unità di attività enzimatica e dosaggio degli
Enzimi
Catal (kat): è la quantità di enzima che converte 1
mole di reagente nel prodotto in 1 secondo nelle
condizioni di reazione standard (ottimali).
L’Unità internazionale (U): corrisponde alla quantità
di enzima che converte 1 µmole di reagente nel
prodotto in 1 minuto. Poiché 1 µmole /min = 1.67
×10-8 moli /s quindi U = 1.67 ×10-8 kat.
EY
Tuttavia se i DATI CINETICI non sono compatibili con un
certo meccanismo molecolare allora
quel meccanismo deve essere scartato
L’attività specifica: è il rapporto tra il numero di U o
di Kcat e la quantità totale di proteina espressa in
milligrammi.
19
Effetto del pH
L’attività enzimatica è influenzata dal pH. Ciò può derivare dai valori di pKa del
substrato e/o dell’enzima. Perciò il pH scelto e la selezione di un tampone
appropriato sono fondamentali per i saggi di attività enzimatica.
L’attività specifica è una misura del grado di purificazione
dell’enzima e il suo valore tende a raggiungere un massimo e
rimane poi costante quando tutte le molecole del campione in
esame sono molecole di enzima attivo.
20
Effetto della temperatura
temperatura
enzimatiche,
come le reazioni chimiche, dipendono
Le reazioni
dalla
temperatura, inoltre se la temperatura diventa troppo alta l’enzima può
denaturarsi e si avrà perdita di attività.
Misure sperimentali e Analisi dei dati cinetici
Per misurare la velocità di reazione abbiamo bisogno di un sistema per
seguire la formazione del prodotto o il consumo di substrato.
Via via che il substrato viene consumato la velocità diminuisce fino a
quando alla fine viene raggiunto l’equilibrio.
Di regola si preferisce predisporre una serie di esperimenti tutti alla stessa
concentrazione di enzima, ma a diverse concentrazioni di substrato e
misurare la velocità iniziale (V).
21
Esempio: misura dell’attività enzimatica della
fosfatasi alcalina
PNPP
Poiché la variazione di [S] rispetto a t è pressoché lineare nelle fasi iniziali è
possibile eseguire analisi accurate di V in funzione di [S].
PNP
La fosfatasi alcalina catalizza l’idrolisi di tutti I fosfomonoesteri. Si esegue il
saggio enzimatico con un composto non naturale sistetizzato chimicamente:
il p-nitrofenilfosfato (PNPP) che viene idrolizzato a p-nitrofenolo (PNP) e Pi.
La forma ionica del PNP è colorata (410 nm) quindi la reazione può essere
misurata spettrofotometricamente.
22
Le sostanze che alterano l’attività di un enzima
legandosi ad esso, sono chiamate INIBITORI
INIBIZIONE
Ogni sostanza che riduca la
velocità di una reazione
enzimatica è da considerarsi un
inibitore.
La formazione reversibile di un legame non covalente con
una molecola diversa dal substrato porta alla formazione di
complessi anomali, che non fanno parte del normale
processo catalitico.
Nella trattazione cinetica della inibizione enzimatica si
applicano le assunzioni di Michaelis-Menten anche
all'inibitore. Ci sono almeno tre tipi principali di inibizione.
REVERSIBILE
Legame non covalente tra
inibitore e enzima
IRREVERSIBILE
Legame covalente
tra inibitore e enzima
INATTIVATORI
Azione di tossine e veleni
specifici, molti dei quali
provocano inattivando
la morte
degli enzimi chiave.
23
INIBIZIONE
COMPETITIVA
Sostanza che compete
con il substrato per il
SITO ATTIVO
INIBITORE
COMPETITIVO
INIBIZIONE
NON COMPETITIVA
INIBIZIONE
INCOMPETITIVA
L’inibitore che somiglia al substrato lega l’enzima nel
SITO ATTIVO, ma diversamente dal substrato non è
capace di reagire per dare un prodotto di reazione.
K1
K3
E + S D KES " E + P
2
I
In presenza dell’INIBITORE l’enzima
+
Sostanza che si lega ad un
SITO DIVERSO dal sito attivo
INIBITORE
NON COMPETITIVO
INIBITORE
INCOMPETITIVO
KI
E
non può legare il substrato come di
consueto.
L’Enzima opera come se la sua KM per
il substrato fosse aumentata
[E]t = [E] + [ES] + [EI]
EI
Enzima
totale
Enzima
libero
Enzima legato
al substrato
Enzima legato
all’inibitore
24
U N
I N I B I T O R E
COMPETITIVO RIDUCE LA
CONCENTRAZIONE DI
E N Z I M A L I B E R O
DISPONIBILE PER LEGARE
IL SUBSTRATO
STESSA Vmax
DIVERSA KM
aumenta la KM
Per tutto il tempo che
l’inibitore occupa il sito
attivo, l’enzima non è
disponibile per la catalisi
25
Un inibítore competitivo è una sostanza che si lega
all'enzíma libero, impedendo così la formazione del
complesso enzima-substrato. Esso può essere un
analogo non metabolizzabile del substrato, un substrato
alternativo per l'enzima o un prodotto di reazione.
L'inibizione della succinico deidrogenasi da parte
dell'acido maloníco è un classico esempio di inibizione
competitiva da analogo non metabolízzabile:
26
Quando
l’inibitore si lega
ad un SECONDO
SITO sulla
superficie
dell’enzima
diverso dal SITO
ATTIVO
modificando la
Kcat
INIBITORE NON COMPETITIVO molecola che non
somiglia al substrato
L’inibitore si lega tanto ad E che
a ES e che S si lega sia ad E che
a EI. La presenza di uno di essi
non ha alcun effetto sulla
costante di dissociazione
dell'altro, ma il complesso ESI è inattivo, non è in grado
cioè di liberare il prodotto.
L’inibitore non competitivo si comporta come se
determinasse una rimozione di molecole enzimatiche attive
dalla soluzione
KM uguale
VMAX VARIA
27
L’inibitore si lega direttamente al complesso ES ma
non all’enzima libero K
K
1
2
E + S DK ES " E + P
+
L’inibitore incompetitivo, che non
I
deve necessariamente somigliare al
-1
substrato provoca una distorsione
nel sito attivo, rendendo l’enzima
cataliticamente inattivo
KI
ESI
Nessuna
reazione
L’inibitore influenza la funzione catalitica
dell’enzima, ma non il suo legame con il
substrato.
Importante solo per gli enzimi a substrati
multipli.
Varia sia VMAX che
KM
28
E' interessante notare che per l’inibizione
incompetitiva, il grado di inibizione aumenta
all'aumentare della concentrazione del substrato.
Ciò è comprensibile in quanto l'inibitore
incompetitivo si lega al solo complesso ES, e la [ES]
cresce al crescere di [ S ].
L'inibitore incompetitívo è inibitore per il suo effetto
sulla Vmax, ma è virtualmente un attivatore per
quanto riguarda la Km.
29
