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UNIVERSITA' degli STUDI di PERUGIA
VIROLOGIA GENERALE
Classificazione e struttura
Replicazione virale
Patogenesi virale
Diagnosi delle infezioni da virus
Farmaci antivirali
COSA SONO I VIRUS?
i virus sono....
.... parassiti endocellulari obbligati
• Mancano dell'informazione genetica che codifica l'apparato
necessario per la generazione di energia metabolica (ATPasi)
o per la sintesi di proteine (ribosomi) e sono quindi
assolutamente dipendenti dalla cellula ospite per queste
funzioni
• Si tratta di particelle prodotte dall'assemblaggio di
componenti preformati: non crescono e non si dividono
(gli altri organismi aumentano la somma dei propri componenti
e poi si replicano per divisione)
• Possono infettare animali, piante e batteri
DIMENSIONI RELATIVE DI VIRUS E BATTERI
cellule
animali
10-2
10-3
1 cm
1 mm
10-4
10-5
batteri
10-6
virus
10-7
proteine
10-8
1 µm
10-9
1 nm
atomi
10-10
1Å
microscopio ottico
microscopio elettronico
raggi-X
1.0 mm
NMR
LE DIMENSIONI VARIANO
da 20-30nm a 300nm
(1nm è uguale a 10-6mm
= un milionesimo di mm)
al microscopio:
al microscopio elettronico si
osservano le particelle virali
al microscopio ottico si
osservano le cellule infette
Struttura
e classificazione
dei virus
I VIRUS SONO ORGANISMI SUB-CELLULARI
ESSENZIALMENTE COSTITUITI DA:
• ACIDO NUCLEICO
• INVOLUCRO PROTEICO (CAPSIDE)
ALCUNI HANNO UN RIVESTIMENTO ESTERNO
CHIAMATO
• ENVELOPE o MANTELLO o PEPLOS o PERICAPSIDE
Le particelle virali o “virioni” presentano in superficie
antirecettori che riconoscono i recettori sulle cellule
bersaglio
STRUTTURA DEI VIRUS
CAPSIDE
(proteico)
RIVESTIMENTO
ENVELOPE
(lipidico)
VIRIONE
AC. NUCLEICO
CORE
INTERNO
PROTEINE
(enzimi)
ACIDO NUCLEICO
strettamente impacchettato nel capside:
•
•
•
•
•
RNA oppure DNA
a singola catena o a doppia catena
nonsegmentato o segmentato
lineare o circolare
associato a ioni + o a proteine basiche (virali o
cellulari) per neutralizzare le cariche negative
dei gruppi fosfato
PROTEINE VIRALI
Si distinguono:
• Proteine funzionali che permettono ad es. all’acido
nucleico virale di replicarsi (DNA- o RNA-polimerasi)
• Proteine strutturali: incorporate nelle nuove particelle
virali come costituenti del capside o come strutture
particolari (es. le emoagglutinine) presenti
nell’envelope
• Proteine strettamente associate agli acidi nucleici
• Proteina di matrice o proteina M nei virus con
envelope sono le proteine con funzione strutturale, situate
proprio al di sotto dello strato fosfolipidico
•Bersaglio di farmaci antivirali come amantadina e
•rimanatadina
CAPSIDE (RIVESTIMENTO PROTEICO)
Funzione: protezione,
riconoscimento recettori,
Definisce la SIMMETRIA:
binaria
elicoidale,
icosaedrica,
complessa
.
SIMMETRIA:
Le proteine del capside
caratterizzano la
simmetria :
• cubica o icosaedrica
• elicoidale
• complessa
• binaria
Simmetria CUBICA
o ICOSAEDRICA:
ICOSAEDRO: figura solida con
• 20 facce identiche (triangoli
equilateri)
• 12 vertici
• 30 spigoli
simmetria rotazionale 5:3:2
Vertici,
facce
spigoli
Simmetria CUBICA
o ICOSAEDRICA
• Le unità strutturali proteiche
(protomeri) si dispongono in
raggruppamenti simmetrici detti
CAPSOMERI.
• Disposizione spaziale dei
protomeri in modo da formare
un solido regolare cavo che più
si avvicini alla sfera:
un ICOSAEDRO
• 3 assi di simmetria rotazionali
passanti al centro dell’icosaedro.
• PENTONI (5 protomeri) ai VERTICI
• ESONI (6 protomeri) sulle FACCE
Adenovirus
Paramyxovirus umano tipo 1
Simmetria ELICOIDALE
• I protomeri non si
raggruppano in
complessi, ma si
dispongono con un
andamento a spirale per
formare il capside
cilindrico nella cui cavità
si trova l’acido nucleico
• Questa simmetria ha un
solo asse di simmetria
rotazionale che coincide
con l’asse longitudinale
del cilindro
acido nucleico
proteine
Simmetria
COMPLESSA
è la simmetria dei
Poxvirus (forma a
mattone) e dei
Rhabdovirus (forma
a proiettile)
Simmetria BINARIA
è la simmetria dei fagi
(virus batterici)
MANTELLO
• è presente su tutti i virus a
simmetria elicoidale ed in
alcune famiglie con capside
a simmetria icosaedrica
herpes, hepadna( epatite
B), togavirus(RNA+),
retrovirus (RNA+)
• natura chimica del mantello:
lipidica o glicolipidica
• i virus acquisiscono il
mantello nella fase tardiva
del ciclo d’infezione, dopo
l’assemblaggio del
nucleocapside
Il mantello origina dalla:
• membrana nucleare
(herpes)
• membrana citoplasmatica
(virus a RNA)
Sul mantello sono presenti
GLICOPROTEINE virali come
l’emagglutinina (HA)
che permettono
l’adsorbimento
del virione sulle
cellule sensibili
HIV gemmante
Esempio di
VIRUS NUDI
Esempio di
VIRUS CON ENVELOPE
CAPSIDE NUDO(HPV,poliovirus )
Proprietà
Resistente a:
alte temperature, acidi, detergenti,
essiccamento
E’ rilasciato dalla cellula per lisi
Conseguenze:
Facilmente diffuso (su oggetti, da
una mano all’altra, con la polvere
o piccole gocce d’acqua)
Può essere essiccato e
mantenere l’infettività
Può sopportare le diverse
condizioni dell’intestino
Può resistere ai detergenti e alle
acque di scolo trattate
blandamente
CAPSIDE CON ENVELOPE:
Proprietà
Distrutto da: acidi, detergenti,
essiccamento, calore
Modifica le membrane cellulari durante
la replicazione (fusione)
E’ rilasciato per gemmazione, talvolta
per lisi cellulare
Conseguenze:
Deve rimanere in ambiente umido
Si diffonde con gocce d’ acqua,
secrezioni, trapianti d’organi e
trasfusioni di sangue
Non sopravvive nel tratto gastrointestinale
Non uccide necessariamente la cellula
per diffondersi
I virus con envelope sono
più fragili (in genere…)
virus ad RNA
•Rosolia
HAV polio
rhinovirus
Dengue
trasmesso dalla
zanzara( febbre
emorragica)
Morbillo
Paraotite
From Principles of Virology Flint et al ASM Press
virus a DNA
•B19( quinta
• malattia ) Papilloma
Virus ad RNA
(RNA+)
(N)
(E)
(RNA -) (RNA +/-) (RNA +
via DNA)
(E) (Doppio capside) (E)
Rotavirus
Retro
Picorna epA Toga
Rhabdo
( diarrea bamb)
Calici Flavi(epaC)) COrthomyxo
at C
Norwalk Corona
Paramyxo(Morbillo -Virus respiratorio sinciziale)
Virus ad RNA e struttura del loro genoma
Le famiglie virali sono definite in base alla struttura del
genoma ed alla morfologia del virione
•Reovirus-Rotavirus
•Genome:
•Segmented, d/s RNA
Infections cause endemic/epidemic gastroenteritis and
infantile diarrhoea is an a important cause of death in the
developing world:
Virus a DNA
Rivestiti
Pox
Con capside nudo
Herpes Hepadna
Papova ( HPV)
Adeno
(inf tratto resp
,congiutivite)
Parvo( B19
Quarta malattia)
Virus a DNA
Le famiglie virali sono definite in base alla struttura del
genoma ed alla morfologia del virione
Classificazione tassonomica dei virus
Criteri:
• acido nucleico (DNA o RNA)
• simmetria del capside (icosaedrica, elicoidale, complessa)
• envelope (si o no)
• architettura del genoma
• modalità replicative
• polimerasi associata al virione
• diametro virione (nm) e numero
dei capsomeri
• dimensioni genoma (kb)
Classificazione tassonomica dei virus
International Committee on Taxonomy of Viruses
(ICTV)
per esempio:
herpesviridae
betaherpesvirinae
cytomegalovirus
Nuovi ceppi virali possono originare dal ceppo
parentale o selvatico per mutazioni
Nuovi ceppi possono emergere anche per:
• ricombinazione (tra virus a DNA come HSV1 e 2)
• riassortimento (virus influenzali)
Denominazione dei virus
STRUTTURA
DIMENSIONI, MORFOLOGIA E TIPO DI ACIDO NUCLEICO
ad es.: PICORNAVIRUS = PICCOLI VIRUS AD RNA
TOGAVIRUS = VIRUS CON MANTELLO
CARATTERISTICHE BIOCHIMICHE
STRUTTURA E TIPO DI REPLICAZIONE (SISTEMA CORRENTE
PER LA CLASSIFICAZIONE TASSONOMICA DEI VIRUS)
MALATTIE
ad es.: VIRUS DELLE ENCEFALITI, VIRUS DELLE EPATITI
TIPO DI TRASMISSIONE
ad es.: ARBOVIRUS VIRUS = ARTHROPOD-BORNE VIRUS( enc )
CELLULA OSPITE (SPETTRO D’OSPITE)
ANIMALI (uomo, topo, uccelli),
TESSUTO OD ORGANO (TROPISMO)
ad es.: ADENOVIRUS, ENTEROVIRUS
Replicazione virale
FASI DELLA REPLICAZIONE VIRALE
1.
2.
3.
4.
5.
RICONOSCIMENTO della cellula target
ADSORBIMENTO
PENETRAZIONE
DENUDAMENTO
SINTESI MACROMOLECOLARI
(mRNA precoci e proteine non strutturali
- REPLICAZIONE DEL GENOMA –
mRNA tardivi e proteine strutturali)
6. ASSEMBLAGGIO
7. RILASCIO
P
E
R
I
O
D
O
D
I
E
C
L
I
S
S
I
Nel ciclo di replica virale c’è una
1. Fase precoce
• Riconoscimento
• Penetrazione
• Rilascio del genoma
2. Fase tardiva
• replica
• sintesi macromolecolari
• assemblaggio
• rilascio
Ogni cellula infetta può produrre fino a100000 particelle virali ma solo 110% sono dotate di infettività
1-2
3
4
5
6
7
A) RICONOSCIMENTO-ATTACCO
Contatto virus-cellula (spettro d’ospite)
La cellula bersaglio suscettibile definisce il tropismo tissutale
ANTIRECETTORI VIRALI
(viral attachment protein: VAP)
EBV:
HIV:
Influenza
gp220-gp350
gp120
HA
Morbillo(paramyxovirus) H
Rhinovirus(picornavirus):VP1
-VP2-VP3 ( VP4 è interna)
RECETTORI
CELLULARI
CR2 (CD21)(Tand B
cells) - C3dR
CD4
Gp contenenti acido
sialico
CD46 ( B cells)
ICAM-1 cellule
epiteliali
ESEMPI di VAP
•(Virus attachment protein)
Emagglutinina (HA)
virus dell’influenza
B) PENETRAZIONE
Virus senza mantello:
internalizzazione mediante:
a) endocitosi (o viropessi, mediata da clatrina, pH
neutro o acido) e trasferimento all’interno del
citoplasma in una vescicola endocitica
b) fagocitosi
ENDOCITOSI: alcuni esempi…
VIRUS SENZA MANTELLO: ADENOVIRUS, PICORNAVIRUS
VIRUS SENZA MANTELLO : PICORNAVIRUS
Molte proteine usate come recettori appartengono alla
superfamiglia delle Immunoglobuline
(ICAM = intracellular adhesion molecule).
Il Poliovirus si lega solo al recettore PVR( poliovirus
recettore) o CD155 espresso dai primati che ne determina
così lo spettro d’ospite
• B) Penetrazione
• Virus senza mantello:
• a) adsorbimento
• Virus con mantello.
• A) per fusione dell’inviluppo
lipoproteico con la membrana
cellulare esterna
Virologia
generale
C) DENUDAMENTO
• azione delle
proteasi sul
capside proteico
• azione degli enzimi
lisosomiali sulle
strutture proteiche
• resistenza degli
acidi nucleici agli
enzimi nucleolitici
cellulari
(DNasi, RNasi).
•Virus a DNA (bicatenario)( Herpes virus)
•Utilizza trascrittasi virale
•L’assemblaggio avviene nel nucleo
•(Poxvirus si replicano nel citoplasma)
Genoma a RNA monocatenario positivo ( picornavirus
togavirus) che funziona da messaggero.
Genoma a RNA monocatenario negativo ( orthomyxovirus
paramyxovirus)
utilizzano trascrittasi virali
L’assemblaggio avviene nel citoplasma
•Genoma a RNA(2 molecole identiche)( HIV) viene
trascritto in DNA da una polimerasi virale ( DNA
polimerasi RNA dip) l’assemblaggio avviene nel citoplasma
D) ECLISSI
Sintesi delle
macromolecole virus
specifiche che consta
in 3 fasi:
1) trascrizione del
genoma virale in
mRNA
2) traduzione dei
messaggeri virali
in proteine
3) replicazione del
genoma virale
• la fase di eclissi dura per un periodo che va
da minuti a ore e dipende del tipo di virus .
In questa fase i virioni , perdendo la loro
integrità strutturale sembrano scomparire
alle comuni indagini immunologiche e
virologiche .
Virus a DNA
Per la replica del genoma occorre
DNA polimerasi - DNA dipendente
la replica del DNA virale avviene analogamente alla
replica del DNA cellulare
• i virus piccoli utilizzano la polimerasi cellulare
• i virus grandi codificano per una polimerasi virale
(adenovirus, herpesvirus)
La trascrizione avviene nel nucleo
Per la sintesi dei mRNA viene usata
RNA polimerasi II - DNA dipendente cellulare
Virus a RNA
Il genoma a RNA può essere:
• a RNA+ (cioè come un mRNA)
• a RNA- (cioè come un template per mRNA)
Il genoma virale deve codificare per
la polimerasi
RNA polimerasi - RNA dipendente virale
La trascrizione avviene nel citoplasma
. Virus a RNA+:
è come un mRNA, si lega ai ribosomi
per la sintesi delle proteine
C’è un intermedio a RNA-( stampo) per
la replicazione del genoma
enzima: RNA polimerasi - RNA dipendente
. Virus a RNA: sulla sua base vengono sintetizzati gli
mRNA che codificano per le proteine
virali
C’è un intermedio a RNA+( stampo) per
la replicazione del genoma
enzima: RNA polimerasi - RNA dipendente
Paramyxo morbillo
parainfl parotite
E) ASSEMBLAGGIO
• assemblaggio delle
copie del genoma virale
e delle differenti proteine
strutturali per formare i
nuovi virioni
• tutti i virus a RNA si
assemblano nel
citoplasma delle cellule
infettate
• i virus a DNA si
assemblano nel nucleo
tranne i Poxvirus
(citoplasma)
F) LIBERAZIONE
Acquisizione del mantello:
in genere dalla membrana
cellulare
• herpesvirus (foglietto interno
della membrana nucleare)
liberazione:
la liberazione dei virus con
mantello avviene per
gemmazione
la liberazione dei virus senza
mantello avviene per
esocitosi
Retrovirus: l’RNA+ è convertito in
DNA che si integra con quello cellulare e viene
trascritto come un gene cellulare
enzima: DNA polimerasi - RNA dipendente
o TRASCRITTASI INVERSA
Patogenesi virale
PATOGENESI VIRALE
è il processo tramite il quale
l’infezione virale porta alla
malattia
Infezione / malattia
INFEZIONE
Ingresso del virus nell’organismo
senza sintomi o con sintomi transitori locali
MALATTIA
il virus raggiunge gli organi target e
causa segni e sintomi associati
della malattia
L’esito di un’infezione virale è determinato:
• dalla natura dell’interazione virus-ospite
• dalla risposta immune dell’ospite
• il ceppo virale
• la consistenza dell’inoculo
• Le condizioni generali di salute della persona
infettata determinano la gravità e la durata della
malattia
La risposta immune è uno dei fattori responsabili
della patogenesi di una infezione virale
VIE DI INGRESSO
DEL VIRUS
NELL’OSPITE
Arenavirus (roditori)
febbre emorragica
Trasm da zecche
Febbri emorraggiche
Patogenesi delle infezioni virali:
ingresso nell’organismo
a) impianto
iniziazione dell’infezione al sito primario
b) diffusione
periodo d’incubazione (asintomatico o prodromi)
c) disseminazione sintomi (organo bersaglio)
d) eliminazione
DIFFUSIONE DEL VIRUS
NELL’ORGANISMO
PENETRAZIONE
REPLICAZIONE
PRIMARIA
INFEZIONE
LOCALIZZATA
Virus influenzali, Virus enterici
ORGANI
BERSAGLIO
VIREMIA
PRIMARIA
Suscettibilità e
Permissività
REPLICAZIONE
SECONDARIA
INFEZIONE
DISSEMINATA
Malattie
(esantematiche)
VIREMIA
SECONDARIA
Virologia Generale
TIPI DI INFEZIONE VIRALE A LIVELLO CELLULARE
• Cellula permissiva:
fornisce il complesso
biosintetico per sostenere
l’intero ciclo di replicazione
virale.
• Cellula non permissiva:
non permette la replicazione
di un particolare ceppo virale.
• Cellula semipermissiva:
quando è in grado di
sostenere alcune, ma non
tutte, le fasi della replicazione
virale.
TIPI DI INFEZIONE VIRALE:
1. abortiva (fallimento)
2. litica (morte cellulare)
3. persistente (infezione senza morte
cellulare)
Le infezioni persistenti comprendono le infezioni
3a. croniche (non litiche, produttive)
3b. latenti (sintesi di macromolecole, ma non di
nuovi virioni: ad es. herpes)
3c. ricorrenti
3d. trasformanti
PATOLOGIA VIRALE: progressione della malattia
• Infezione: il virus comincia a crescere nell’ospite
• Periodo di incubazione: periodo compreso fra
l’infezione e la comparsa dei sintomi
• Fase prodromica: periodo di incubazione in cui
possono manifestarsi sintomi non specifici
• Periodo acuto: picco della malattia e dei sintomi
• Periodo di declino: diminuzione dei sintomi,
risoluzione dell’infezione
• Convalescenza: recupero
Virologia Generale
Periodo d’incubazione delle più comuni infezioni virali
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Influenza
Malattie da raffreddamento
Herpes simplex
Poliomielite
Morbillo
Rosolia
Mononucleosi
Rabbia
Epatite A
Epatite B
AIDS
1-2 giorni
1-2 giorni
5-8 giorni
5-20 giorni
12-14 giorni
17-20 giorni
30-50 giorni
30-100 giorni
15-40 giorni
50-180 giorni
1-10 anni
INFEZIONI LITICHE
= replica del virus nelle cellule infette con lisi
cellulare in poche ore-giorni
Infezioni persistenti
condizione di parassitismo virale controllato
- produzione di Ag virali e di virus infettanti
• croniche (HBV, HCV)
INFEZIONI PERSISTENTI
= quando una cellula viene
infettata, ma non uccisa,
dal virus.
• possono essere infezioni
latenti o trasformanti.
• infezioni latenti:
herpesvirus
infezione primaria
fase di latenza
infezione riattivante
INFEZIONI
TRASFORMANTI:
Virus oncogeni: alterazioni non
degenerative ma condizionanti
la proliferazione anomala ed
incontrollata delle cellule infette
(trasformate).
Ad es: alcuni papillomavirus (HPV)
possono inattivare delle proteine
(p53, pRB105) che regolano il ciclo
di replicazione delle cellule
DIFESE DELL’ORGANISMO CONTRO
LE INFEZIONI VIRALI
1. Barriere naturali anatomiche (epidermide, mucose)
2. Difese aspecifiche umorali (infiammazione, complemento
Interferon)
3. Difese aspecifiche cellulari (Cellule natural killer e
macrofagi)
4. Difese specifiche umorali (Anticorpi);
5. Difese specifiche cellulari (CTL).
6. Variabilità recettoriale (ad es: CCR5 e resistenza ad
HIV)
INTERFERONE
Fattore che “interferisce” con la replicazione di molti virus
- prima difesa sia a livello locale che sistemico • blocco della replicazione virale nella cellula target
• attivazione dei linfociti T nel riconoscimento delle
cellule infettate
Type I
IFN-a
IFN-b
Type II
IFN-g
INTERFERONE
IFN-a
PRODOTTO DA:
B cells, monociti, macrofagi, DC immature
IFN leucocitario
IFN-b
fibroblasti
IFN fibroblastico
IFN-g
T cells, NK
IFN immune
STATO ANTIVIRALE
gli IFN inducono la sintesi di due enzimi:
• 2’-5’ oligo-adenilato-sintetasi (2-5A)
• Proteina chinasi R (PKR)
RISULTATO:
blocco della sintesi proteica = no virus
Essendo “parassiti
endocellulari obbligati”
la propagazione dei
virus è possibile solo su
CELLULE VIVE
Possono essere
impiegati:
A) animali da
laboratorio
B) uova embrionate
di pollo
C) colture cellulari
A) Inoculazione negli
animali da laboratorio
è stato il primo metodo
usato per isolare i virus.
Nell’animale si osserva la
capacità del virus di
provocare la morte o di
produrre lesioni o sintomi
clinici evidenti.
L’inoculazione in animali
è stata usata soprattutto
per l’isolamento di virus
neurotropi.
B) Inoculazione in uova
embrionate di pollo
• Sono batteriologicamente sterili
e non sviluppano nessun
meccanismo immunitario.
• Le uova sono di 10-12 gg.
Le vie d’inoculazione sono:
• Membrana corion-allantoidea:
(virus vaiolo, vaccinico, herpes)
• Cavità amniotica:
(virus influenzale, parotitico)
• Cavità corion-allantoidea:
(vaccini anti-influenza).
• Sacco vitellino:
(Rickettsia, Chlamydia)
C) Colture cellulari
Vengono distinte in:
• colture primarie
• colture secondarie
• colture in linea continua
L’isolamento virale in
colture cellulari è il
metodo attualmente più
usato in laboratorio
Terreni per colture cellulari
esistono molte preparazioni:
RPMI 1640
MEM
Dulbecco-modified MEM (DMEM)
ISCOVE
….etc.
Composizione:
H2O, aminoacidi essenziali, vitamine, sali, glucosio, ormoni,
acidi grassi, fonti di carbonio, composti azotati
Deve essere sempre presenti:
• SIERO FETALE BOVINO (FBS) al 10%
• antibiotici ed antifungini per evitare inquinamento
• un indicatore di pH
La crescita cellulare fa variare il pH verso l’acido e il
terreno da rosso-arancio diventa giallo
Colture primarie:
Derivano da un o tessuto o da un
organo prelevato da un animale
(ad esempio rene, polmone, fegato)
Il materiale viene processato in
modo da avere cellule che vengono
risospese in terreno liquido e
inserite in una fiasca dove
aderiscono e formano un
monostrato cellulare
Le preparazioni devono
essere fatte in
condizioni di sterilità!!
Colture secondarie
dopo 7-15 giorni le colture si invecchiano e
occorre fare un “trapianto”:
• dalle colture primarie si elimina il terreno liquido.
• si lava il tappeto con tampone fosfato (PBS) e poi si ricopre
con un velo di tripsina ed EDTA
•
si mantiene la coltura per pochi minuti a 37°C per far agire
la tripsina
• la sospensione viene raccolta e centrifugata a 1800
rpm/ x 3 min.
• si elimina il sovranatante ed il sedimento
è ridistribuito su altri contenitori
• sopravvivenza per 2-3 mesi
con trapianti settimanali
A seconda del tipo di cellule sono
possibili 30-50 TRAPIANTI,
poi la coltura muore
Colture in linea continua:
• Sono cellule modificate o trasformate
(poliploidi, aneuploidi, eteroploidi)
• Hanno perso l’inibizione da contatto
• Sono in grado di moltiplicarsi nel tempo
senza alcun limite, con trapianti settimanali
.Esistono migliaia di linee cellulari
di tutte le origini istologiche
(HeLa EP utero), Hep-2( ep laringe), KB
(oral carcinioma) , LLCMK2, MDCK ep
rene), etc.
• Vantaggi: si propagano in maniera indefinita e
conservano la vitalità per diversi anni se
congelate in azoto liquido (-196°C) una volta
sospese in glicerolo o in dimetilsulfossido
(DMSO).
La moltiplicazione di un agente virale in una coltura
cellulare può essere evidenziata in modi diversi:
1) Effetto citopatico
morte cellulare
arrotondamento cellulare
degenerazione
aggregazione
perdita dell’attacco al substrato
2) Cambiamenti delle
caratteristiche
istologiche
corpi inclusi nucleari,
citoplasmatici
3) Formazione di sincizi
cellule giganti
polinucleate causate dalla
fusione cellula-cellula.
4) Cambiamenti sulla
superficie cellulare
• Espressione degli Ag
virali
• Emoadsorbimento
5) Rilevamento di antigeni
virali mediante anticorpi
monoclonali marcati
con fluoresceina
6) Coltura rapida in
“SHELL-VIAL”
Centrifugazione del
campione su
monostrato cellulare
e immunofluorescenza
diretta dopo 24-48 ore
Farmaci Antivirali
• Per la loro replica, i virus utilizzano le
strutture biosintetiche e gli enzimi della cellula
ospite: è difficile inibire la replicazione virale
senza provocare anche effetti tossici per la
cellula ospite
bersaglio degli antivirali:
le differenti fasi della replica
Distruzione del virione (Nonoxynol-9: detergente)
A) Attacco - Fusione
B) Penetrazione e Denudamento
C) Sintesi di RNA
D) Inibitori della DNA polimerasi
E) Trascrizione
F) Sintesi proteica
G) Biosintesi dei nucleotidi – analoghi
H) Recupero dei nucleotidi
I) Modificazione delle glicoproteine
L) Assemblaggio
A) Attacco
analoghi peptidici delle proteine
di adsorbimento destransolfato, eparina..,
Anticorpi neutralizzanti
Bloccano il legame tra
gp120 e CD4 (HIV)
Enfuvirtide o T20 o Fuzeon®
Inibisce l’azione della proteina
di fusione GP 41 di HIV
Blocco del legame
al recettore
Blocco della
fusione
A) Attacco
Molecole che bloccano il
corecettore
(nel caso di HIV CCR5 o CXCR4)
per CCR5:
Maraviroc o Selzentry®
recettore: CD4
Blocco del legame
al corecettore
corecettore: CCR5
B) Penetrazione e
Denudamento
Amantadina e Rimantadina,
Tramantadina, Arildone.
Sono amine sintetiche
primarie che inibiscono la
replica virale legandosi alla
proteina della matrice M2 e
bloccando i canali protonici
L’attività antivirale limitata al
virus dell’influenza tipo A
C) Sintesi di RNA
• IFN
• Poli I:C (induce IFN)
Biosintesi dei nucleotidi:
analoghi nucleosidici
Ribavirina (--> RSV)
D) Replicazione del DNA
Inibitori della DNA polimerasi
• Analoghi nucleosidici:
ACICLOVIR - (HSV).
Agisce come analogo della
deossiguanidina trifosfato
• GANCICLOVIR, Adenosina
arabinoside, Citosina
arabinoside, Zidovudina,
Dideossinosina,
Dideossicitidina, Idossiuridina,
Trifluoridina.
E) Eclissi, Trascrizione
• interferone,
• poli I:C
F) Sintesi proteica
IFN-a e IFN-b
• Degradano l’mRNA virale e cellulare e viene bloccato il
legame dell’mRNA al ribosoma, impedendo la sintesi proteica
e la replicazione virale.
Usato soprattutto IFN alfa - PEGILATO: coniugato a PEG
(polietilenglicole) per lento rilascio
Impiegato nelle infezioni da:
virus epatite A, B, C (HAV, HBV, HCV), papillomvirus (HPV)
G) Biosintesi dei
nucleotidi: analoghi
nucleosidici
• ribavirina
• acyclovir
• gancyclovir
• AZT
H) Recupero dei
nucleotidi
timidina chinasi (analoghi
nucleosidici)
• Herpes, HIV, HBV
I) Modificazione delle
glicoproteine
• anti-proteasi.
L) Assemblaggio
• inibitori delle proteasi
• indinavir, ritonavir, saquinavir….
attivi verso HIV (in HAART)
Blocco
dell’assemblaggio
Blocco
dell’esocitosi
Anti-HIV
Virologia generale
Oltre ai Virus “classici”, esistono altri agenti infettivi
studiati dalla virologia:
• Viroidi: piccole molecole di RNA circolare (200-400
nucleotidi), prive di capside e envelope. Associati
con alcune malattie delle piante. Sono parassiti
endocellulari obbligati
• Virusoidi: simili ai viroidi, ma più grandi, sono
molecole di RNA 'satellite' (circa 1000 nt). Per la loro
moltiplicazione dipendono dalla presenza di virus
che si replicano (da cui 'satellite'), e sono assemblati
nel capside virale come “passeggeri”. Presenti in
animali e piante, sono associated a malattia (virus
Delta epatite)
Virus: scoperta dei vaccini
On 14th May 1796,
Edward Jenner used
cowpox-infected material
obtained from the hand
of Sarah Nemes, a
milkmaid from Berkley in
Gloucestershire to
vaccinate 8 year old
James Phipps.
On 1st July 1796, Jenner
challenged the boy by
deliberately inoculating
him with material from a
real case of smallpox !
He did not become
infected!