I batteriofagi 1 Gli enzimi di restrizione

I batteriofagi
I virus batterici si chiamano BATTERIOFAGI, i quali hanno una struttura complessa
per permettere loro (1) di aderire alla superficie esterna della parete batterica e (2) di
perforare la spessa parete batterica
Come si possono DIFENDERE i BATTERI dall’attacco dei BATTERIOFAGI?
Ostacolando l’adsorbimento dei
FAGI sulla superficie della
cellula batterica
Degradando il materiale nucleico
del FAGO utilizzando Enzimi di
Restrizione
In questo caso il
batterio protegge il suo
DNA utilizzando sistemi
di MODIFICAZIONE
(metilazione delle
basi azotate)
1
Gli enzimi di restrizione
Nei batteri sono presenti degli enzimi che tagliano le molecole esogene (cioè
provenienti dall’esterno) di DNA (in tal modo i batteri possono essere immuni ai fagi).
Questi enzimi sono gli enzimi di restrizione (endodessossiribonucleasi di restrizione).
Molti enzimi di restrizione riconoscono
sequenze PALINDROME di lunghezza
compresa tra le quattro e le otto basi.
EcoRI
G A A T T C
(Escherichia coli B55)
HindIII
A A G C T T
(Haemophilus influenza)
BamHI
G G A T C C
(Bacillus amyloliquefaciens H)
I diversi enzimi di restrizione tagliano il DNA in
differenti sequenze nucleotidiche specifiche.
La reazione di rottura del legame fosfodiesterico
richiede la presenza di uno ione bivalente
(Mg2+) (cofattore dell’enzima di restrizione) ma
non richiede l’impiego dell’ATP.
N.B.: Invece di tagliare le molecole in maniera netta
(taglio blunt), alcuni enzimi di restrizione lasciano
delle estremità coesive (sticky end).
STICKY
BLUNT
2
I sistemi di restrizione/modificazione dei batteri per
difendersi dai batteriofagi
Il batterio possiede sia un gene per la produzione
dell’enzima di restrizione, sia un gene per la sintesi
di un enzima DNA-metilasi che protegge il proprio
DNA dall’enzima di restrizione stesso.
Vasu K , and Nagaraja V Microbiol.
Mol. Biol. Rev. 2013;77:53-72
3
Il genoma virale
Diverse tipologie di genoma virale e diversi percorsi per ottenere mRNA
dsDNA
mRNA
ssDNA
dsDNA
ssRNA(+)
funziona da mRNA
ssRNA(-)
mRNA(+)
dsRNA
filamento (-) trascritto in mRNA
mRNA
solo per retrovirus
ssRNA(+)
ssDNA(-)
dsDNA
mRNA
4
Ciclo di moltiplicazione virale
Il virus può infettare la cellula ospite, riprodursi e distruggerla, cioè attuare un ciclo LITICO
In alternativa, dopo che un virus infetta la cellula ospite, il materiale genetico virale può integrarsi nel
cromosoma batterico. In questo caso l’interazione tra batterio e virus è definita LISOGENIA e il virus che
la determina è definito TEMPERATO. Anche in una coltura lisogena può indursi un ciclo litico, ma la
frequenza con cui questo processo accade è molto bassa (una cellula su 1000).
5
https://www.youtube.com/
watch?v=wLoslN6d3Ec
https://www.youtube.com/
watch?v=6szOeiAdQ74
6
Le mutazioni
La variazione della sequenza dei nucleotidi in un gene viene detta mutazione. Come
conseguenza, in un genoma aploide (batterico), una mutazione viene subito espressa
nelle cellule figlie. Negli organismi diploidi (per es. alcuni lieviti) l’effetto della
mutazione in una copia del gene può essere mascherato dalla presenza della seconda
copia dello stesso gene.
Tipologie di mutazioni
1
Transizioni o Sostituzioni di una singola base. Una purina viene sostituita da un’altra
purina (G o A) oppure una pirimidina viene sostituita con un’altra pirimidina (C o T).
2
Trasversione o Sostituzioni di una singola base con un’altra di classe diversa.
Una purina viene sostituita da una pirimidina.
3
Delezioni. Perdita di uno o più nucleotidi.
4
Inserzioni. Acquisto di uno o più nucleotidi.
Le mutazioni permettono l’evoluzione di una specie (concetto neodarwiniano di
evoluzione: mutazioni casuali, selezionate dall’ambiente). Tuttavia, le 4 tipologie di
mutazione appena elencate determinerebbero una mutazione molto lenta. Negli
eucarioti esiste la sessualità che accelera l’evoluzione (crossing over); nei procarioti
ci sono invece altri processi (trasformazione, coniugazione e trasduzione)…
7
Il trasferimento genico e
la ricombinazione genica
I batteri possiedono anche materiale genetico extra-cromosomale
FAGI e PLASMIDI
rappresentano elementi genetici, di piccole
e/o grandi dimensioni, che non fanno parte
del cromosoma batterico
PLASMIDI BATTERICI: MOLECOLE DI DNA (SOLITAMENTE CIRCOLARE)
EXTRACROMOSOMALI, AUTOREPLICANTI.
I plasmidi presenti nelle cellule batteriche sono in genere molecole circolari.
Possono essere presenti da una a 20-30 copie per cellula. In alcuni casi
possono essere trasferiti da cellule donatrici a cellule ospiti
8
Che tipo di informazioni sono codificate a livello plasmidico?
- Geni codificanti per enzimi coinvolti nell’utilizzazione di mono- e polisaccardi
- Geni codificanti per enzimi coinvolti nell’utilizzazione di proteine
- Informazioni correlate alla produzione di sostanze antibatteriche (batteriocine)
- Informazioni correlate alla produzione di sostanze tossiche per altre specie
viventi (tossine)
- Geni che donano resistenza agli antibiotici
Nessuna informazione essenziale per la vita della cellula !
Si tratta di informazioni che posso fornire, a chi le possiede,
un vantaggio nella competizione ambientale con altri ceppi
o altre specie batteriche che non le possiedono
9
La ricombinazione genetica
Oltre alle mutazioni esistono altri meccanismi per fare acquisire “nuove
caratteristiche” ad un gene. Questi meccanismi consentono anche l’acquisizione di
nuovi geni o la perdita di geni preesistenti
Ricombinazione Omologa
1 le regioni di DNA interessate dalla
ricombinazione
omologa
devono
possedere zone “estese” con elevata
omologia
di
sequenza.
Questo
processo è definito anche crossingover
2 le regioni di DNA interessate alla ricombinazione
omologa possono trovarsi nella stessa molecoladi
DNA o risiedere su molecole diverse di DNA
(cromosoma e plasmide, cromosoma e DNA fagico)
3 le proteine RecA, RecB,
RecC e RecD mediano il
processo di ricombinazione e
riarrangiamento genico
4 La ricombinazione si
definisce
sito-specifica
quando richiede la presenza di
sequenze
omologhe
relativamente brevi (più piccole
di un gene) nelle regioni
coinvolte nel processo di
ricombinazione
10
La ricombinazione genetica
regioni omologhe
La ricombinazione può
avvenire tra due plasmidi
(A) o tra un plasmide e il
cromosoma (B)
Plasmide ricombinante
Quando avviene la
ricombinazione omologa tra un
plasmide e il cromosoma, il
risultato è l’integrazione del
plasmide nel cromosoma
11
La ricombinazione genetica
La ricombinazione può avvenire anche tra due
regioni omologhe presenti sulla stessa molecola
Regione che va
incontro a
ricombinazione
Regione che va
incontro a
ricombinazione
12
Negli eucarioti, la riproduzione sessuale prevede il crossing-over, cioè
l’interscambio di regioni di DNA tra due cromosomi omologhi appaiati durante la
meiosi.
Il
crossing-over
determina
il
riarrangiamento dei geni e
produce
variazioni nelle caratteristiche ereditarie
della progenie
il crossing over
PRODUCE VARIABILITÀ GENETICA e,
quindi, promuove l’evoluzione.
Nei procarioti, la meiosi (e quindi il crossing-over) non avvengono, poiché
questi organismi si riproducono esclusivamente per via asessuale
(riproduzione per scissione binaria):
(mitosis)
La progenie è geneticamente identica,
ad eccezione delle mutazioni casuali
che possono avvenire durante la
replicazione del DNA
▼
DIVERSITÀ GENETICA RIDOTTA
13
Nei procarioti, la meiosi (e quindi il crossing-over) non avvengono…
tuttavia, i processi di ricombinazione genetica avvengono nei procarioti,
attraverso:
il trasferimento genico orizzontale (TGO)
Trasferimento orizzontale
dell’informazione genetica (il
trasferimento è possibile
anche tra cellule batteriche
appartenenti a gruppi
tassonomici
filogeneticamente distanti)
Trasferimento verticale
dell’informazione genetica =
trasmissione alla progenie
14
I motivi per i quali il TGO nei batteri è importante
1. I meccanismi di TGO sono i principali
generatori della biodiversità nei
procarioti. In altre parole, il TGO
promuove l’evoluzione batterica. Il
TGO, infatti, partecipa alla
speciazione (il processo
evoluzionistico attraverso cui si
generano le specie biologiche)
1. .
2. Il TGO promuove la disseminazione di tratti di patogenicità e, soprattutto,
i geni di resistenza antibiotica.
Il TGO determina l’acquisizione da parte di una cellula batterica di nuovi geni, e quindi
l’acquisizione di nuovi fenotipi (per esempio, la resistenza a un antibiotico o l’abilità di
metabolizzare un carboidrato).
Se il fenotipo acquisito conferisce un vantaggio al batterio, il suo gene si diffonde
rapidamente nella popolazione batterica attraverso trasmissione verticale alla progenie: la
sottopopolazione di cellule ricombinanti (cioè, cellule che hanno acquisito il nuovo
gene/fenotipo) hanno un vantaggio rispetto alle altre cellule che gli permette di diffondersi più
efficacemente.
Ciò che determina se un gene (e il fenotipo ad esso associato) offre un vantaggio alla cellula
batterica o meno è l’ambiente: l’ambiente esercita una pressione selettiva sui geni che
conferiscono un vantaggio alla cellula batterica.
15
L’ORIGINE DELLA BIODIVERSITÀ MICROBICA
IL CONCETTO NEODARWINIANO DI EVOLUZIONE
MUTAZIONI = modificazioni della sequenza nucleotidica del DNA,
generate da errori non corretti nel corso del processo replicativo
Gli organismi attuali hanno un progenitore evolutivo comune e derivano da esso
mediante una serie di piccoli cambiamenti (mutazioni), ognuno dei quali ha conferito un
vantaggio selettivo per alcuni organismi in nicchie ecologiche particolari. Questi
cambiamenti sono però molto piccoli e determinerebbero una evoluzione molto lenta
nei batteri. Ci sono però gli eventi di ricombinazione genetica naturale che
permette il TRASFERIMENTO GENICO ORIZZONTALE…).
Il caso e la necessità
Jacques Monod, 1970
(…l’evoluzione si basa sul reciproco gioco di
forze stocastiche e deterministiche…)
Il gene egoista – Richard Dawkins, 1976
(…la teoria del gene egoista… invece di concentrarsi
sul singolo organismo, guarda la natura dal punto di
vista del gene. È un diverso modo di vedere, non
una teoria diversa…)
16
Il TGO può avere diverse conseguenze che dipendono
dalla pressione selettiva ambientale
Cellula batterica che ha acquisito il
gene di resistenza antibiotica
ampR (dona resistenza
all’ampicillina) attraverso TGO
L’antibiotico ampicillina non è
presente nell’ambiente
NO C’È
PRESSIONE SELETTIVA per il
mantenimento del gene
Popolazione clonale di
uno specifico ceppo
batterico
L’antibiotico ampicillina è presente
nell’ambiente
C’È LA PRESSIONE
SELETTIVA per il mantenimento del
gene di resistenza antibiotica ampR
La cellula batterica che ha acquisito
orizzontalmente il gene ampR si può
riprodurre; tuttavia, in assenza di
pressione selettiva, il genotipo di
questa cellula non dona un vantaggio
rispetto alle cellule parentali non
mutate. Le cellule ricombinanti
tenderanno quindi a scomparire
La cellula batterica che ha acquisito
orizzontalmente il gene ampR
possiede un vantaggio ecologico
rispetto alle altre; le cellule
ricombinanti possono perciò
diffondersi e diventare dominanti
nella popolazione
17
I “superbatteri” sono generati dall’accumulo progressivo di geni di
resistenza agli antibiotici in un singolo microrganismo patogeno (ciò può
avvenire con maggiore facilità in ambito ospedaliero).
Il «superbatterio» più noto e diffuso è il:
MRSA: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
k__Bacteria;
p__Firmicutes;
c__Bacilli;
o__Bacillales;
f__Staphylococcaceae;
g__Staphylococcus
18
I meccanismi naturali di TGO nei batteri
Il trasferimento genico orizzontale comprende processi naturali ricombinazione
genetica nei quali il batterio acquisisce DNA ETEROLOGO, cioè proveniente da un
altro orgasmo.
Nei batteri l’acquisizione di DNA eterologo avviene attraverso TRE
MECCANISMI distinti (conosciuti come processi di PARASESESSUALITÀ):
11) Trasformazione acquisizione di
DNA libero dall’ambiente
3)
2
Coniugazione processo di
..trasferimento di DNA da una
cellula
all’altra
mediato
da
plasmidi
2)
3
Transduzione,
in
cui
il
trasferimento di DNA è mediato da
un virus (batteriofago)
19