Rapporto virus-ospite e virus umani

VIRUS
Rapporto virus-ospite
e virus umani
I virus, strutture ultramicroscopiche (max 0.3 µm), sono parassiti endocellulari
obbligati: devono infettare una cellula per potersi replicare
•Costituiti da materiale genetico
(RNA o DNA ss o ds): un solo tipo
di acido nucleico rivestito da
proteine (capside)à “virus nudi”
• eventuale pericapside o envelope
fosfolipidico acquisito da ospite
•Proteine di superficie necessarie x
inerazione con cellula bersaglio
•infettano cellule batteriche,
eucariotiche vegetali e animali
Gamma di ospiti + - ristretta (solo
un tipo cellulare di una specie o di
specie diverse, vari tipi cellulari di
una stessa specie,…)
•Interazione con cellula ospite puo’
provocare morte, trasformazione
cellulare o danni +- lievi: in gen.
apparato biosintetico della cellula è
stravolto e dirottato verso sintesi di
particelle virali
Genomi virali
Dimensione : 3,2 kb-1200 kb
DNA-RNA ss o ds, lineare o circolare, singola molecola o genoma
segmentato
Filamenti + o Strategie espressive diverse a seconda di tipo/polarità di acido nucleico
Compattezza dei genomi virali
Limitazione dimensioni dovuta
a capside proteico
Strategie per aumentare
numero funzioni virali
ØGeni con ORF sovrapposte
ØSplicing alternativo
ØPrecursori poliproteici che
maturano in diverse proteine
Evoluzione virale
In generale virus (soprattutto ad RNA) mostrano rapida evoluzione dovuta a:
•Elevato tasso di errori nella copiatura del materiale genetico (spec per virus a
RNA in cui le RNA polimerasi RNA-dipendenti non hanno correzione bozze);
•Elevata capacità riproduttiva: migliaia di copie genomiche /cellula infettataà
elevata possibilità di mutazione in tempi brevi
Altri fenomeni genetici contribuiscono all’evoluzione virale
interazione genica durante co-infezione mediante:
•Riassortimernto genomico: scambio di frammenti di genoma tra virus
genotipicamente diversi à solo in virus con genomi segmentati
•Ricombinazione genetica: nuove combinazioni di loci genici: a livello di DNA
con sistemi ricombinazione cellulare, in virus ad RNA con meccanismi tipo
“salto enzima trascrittasi”
•Complementazione: interazione a livello funzionale. Virus difettivi diversi si
supportano vicendevolmente
Virus batterici o fagi
I fagi hanno testa icosaedrica o
filamentosa contenente DNA ds
Molti fagi hanno una coda a
simmetria elicoidale attraverso cui
trasferito DNA
Le fibre e la piastra basale servono
per adesione ai recettori batterici
Il genoma del fago T4 è DNA ds lineare
I fagi di serie T sono “litici”: producono
la lisi cellulare
La lisi si evidenzia come perdita di
torbidità in una coltura batterica liquida
o come placche di lisi in uno strato di
cellule su terreno solido (piastra)
Ciclo litico del fago T4
Il fago λ è temperato: può provocare lisi dell’ospite oppure instaurare
lisogenia (stato di profago);
La lisogenia può revertire alla via litica in base a condizioni ambientali
(UV, agenti tossici, carenza nutrienti,…)
Ciclo lisogeno e via litica del fago λ
Durante la lisogenia il genoma
fagico è replicato insieme a
quello dell’ospite: il virus è in
uno stato di “quiescenza”
L’integrazione del fago avviene dopo circolarizzazione del genoma virale a
livello dei siti COS e mediante successiva ricombinazione sito-specifica
(promossa da integrasi virale) in una regione specifica del cromosoma
batterico
Il genoma di λ è DNA ds lineare con estremità coesive:
Estremità 5’ a singola elica protrudenti e complementari
Il genoma fagico è replicato generando un concatamero (tante
copie genomiche legate insieme) che viene poi tagliato in singole
molecole DNAds con estremità sporgenti COS
Le singole molecole sono impacchettate nelle teste fagiche
Fasi del ciclo riproduttivo di un virus eucariotico
Legame tra proteine di “attacco” e
recettori cellulari
Fusione con membrana o
endocitosi mediata da
recettore
uncoating
≠Modalità replicazione-biosintesi
a volte degradazione DNA ospite
Assemblaggio e rilascio
mediante gemmazione o lisi
cellulare
L’interazione virus-ospite eucariotico può concludersi in:
•INFEZIONE PRODUTTIVA: Rilascio progenie virale numerosaà morte
celllulare per necrosi o apoptosi (cellule permissive)
•INFEZIONE ABORTIVA: no progenie (cellule non permissive)
•INFEZIONE RESTRITTIVA: scarsa progenie virale, ma persistenza del virus
nella cellula in forma latente (cellule solo transitoriamente permissive)
Lo stato di latenza spesso consiste nella integrazione del genoma virale in
quello dell’ospite: STATO DI PRO-VIRUS
Al contrario dei fagi lo stato di provirus è stabile e generalm irreversibile
INTEGRAZIONE in gen casuale per genomi DNA
a livello di siti virali specifici (LTR) per virus ad RNA
In alcuni casi l’infezione di cellule non permissive provoca la
trasformazione neoplastica:
virus oncògeni o tumorali à virus a DNA (SV40, HPV, Epstein-Barr, HBV)
interferiscono con normale proliferazione cellulare alterando pattern di
espressione genica o altro
à virus a RNA (retrovirus HTLV-1) contengono
copie alterate di geni endogeni cellulari coinvolti in controllo ciclo
Alcuni retrovirus ricopiano il
proprio RNA in DNA (cDNA)
(enzima trascrittasi inversa)
per poi integrarlo nel DNA della
cellula ospite (ricombinaz sitospecifica) coinvolgendo LTR
Molti virus sono agenti eziologici di malattie umane (raffreddore, influenza,
epatiti, vaiolo, poliomielite, AIDS, rabbia, morbillo, varicella …)
Il virus dell’influenza A è ad RNA – segmentato; capside + pericapside
fosfolipidico con spicole proteiche che mediano adesione con cell ospite
Gamma d’ospite: infetta cellule tratto respiratorio di vari animali (mammiferi
ed uccelli)
Molto contagioso àResponsabile di pandemie (epidemie diffuse in grosse
aree)
CICLO VITALE del virus influenza A
Le molecole di RNA- sono trascritte in mRNA+ à traduzione nel citosolà proteine virali
Trascrizione nel nucleoà nuovi genomi RNA- à morte cellulare
Elevato tasso di errore della trascrittasi, co-infezione e ampiezza serbatoio
animale ospite à veloce evoluzione del virus influenzaleà sempre nuove
varianti verso cui SI non è preparato (vaccini annuali)
Le infezioni miste con virus provenienti da animali ≠ à virulenza
Il virus unfluenzale H1N1 è di origine suina e si è prodotto per
ricombinazione di tratti virali suini, aviari e umani
evoluzione rapida e drastica del genoma (shift antigenico)à pandemie
VIRUS ONCOGENI (a RNA e DNA)
Inducono trasformazione cellulare in vitro e tumorigenesi in vivo
Molti virus oncogeni ad RNA sono retrovirus che hanno casualmente
exciso dal genoma della cellula infettata un gene cellulare che controlla
proliferazioneà trasduzione e mutazione del gene. Gli oncogeni virali sono
quindi omologhi (mutati) di geni cellulari
caratteristica dei retrovirus: possiedono l’enzima trascrittasi inversa
che copia l’RNA in DNA
Es virus che provocano sarcomi in vari animali: genoma con tratti
caratteristici di retrovirus (GAG-POL-ENV) + oncogene
Il retrovirus HTLV umano invece provoca tumore (leucemia) perché un suo
gene (regione X) attiva l’espressione di vari geni cellulari che stimolano
crescita (citochine, recettori fattori di crescita,…) e reprime geni che frenano
proliferazione (es p53)
Virus oncogeni a DNA
Es SV40 infetta e uccide cellule di scimmia (cell permissive)
Se infetta cellule non permissive di altra specieà integrazione nel DNA ospite
e induzione della proliferazione cellulare incontrollata
Virus oncogeni a DNA nell’uomo
Es HPV infetta epiteli - responsabile del 70% tumori cervice uterina
(trasmissione via sessuale)
Oncogeno quando si integra in genoma ospite: espressione di geni che
stimolano crescita cellulare à neoplasia (ceppi HPV-16 e -18)
Vaccinazioni preventive, utilità di PAP test
Degrada oncosoppressore p53
Lega e inattiva oncosoppressore Rb
Nobel Prize in Physiology or Medicine 2008
-Harald zur Hausen
for his discovery of "human papilloma viruses causing cervical cancer"
and
-Françoise Barré-Sinoussi and Luc Montagnier
for their discovery of "human immunodeficiency virus“
Harald zur Hausen went against current dogma and postulated that oncogenic human
papilloma virus (HPV) caused cervical cancer, the second most common cancer among
women. He realized that HPV-DNA could exist in a non-productive state in the tumours,
and should be detectable by specific searches for viral DNA. He found HPV to be a
heterogeneous family of viruses. Only some HPV types cause cancer. His discovery has
led to characterization of the natural history of HPV infection, an understanding of
mechanisms of HPV-induced carcinogenesis and the development of prophylactic
vaccines against HPV acquisition.
Françoise Barré-Sinoussi and Luc Montagnier discovered human immunodeficiency
virus (HIV). Virus production was identified in lymphocytes from patients with enlarged
lymph nodes in early stages of acquired immunodeficiency, and in blood from patients
with late stage disease. They characterized this retrovirus as the first known human
lentivirus based on its morphological, biochemical and immunological properties. HIV
impaired the immune system because of massive virus replication and cell damage to
lymphocytes. The discovery was one prerequisite for the current understanding of the
biology of the disease and its antiretroviral treatment
Virus oncogeni a DNA
-virus di Epstein Barr (EBV); infetta linfociti e cellule epitelio cavo orale;
contribuisce a sviluppo di tumorià linfoma di Burkitt
Le proteine virali EBNA agiscono da fattori trascrizionali che attivano
l’espressione del gene c-myc (fattore trascrizionale stimolatore di proliferazione)
-HBV (virus epatite B): infetta epatociti; provoca epatite acuta, cronica e
epatocarcinoma (HCC). L’induzione del tumore dipende da stato infiammatorio
cronico (iperstimolazione dei linfociti) e da proteine virali che alterano normali
vie apoptotiche e proliferative
Vaccinazioni preventive
Virus dell’immunodeficienza umana (HIV)
Retrovirus con genoma ad RNA+ (2
molecole), nucleocapside e pericapside
fosfolipidico
2 ceppi principali (HIV-1 e -2) con
diversa distribuzione geografica
Attacca cellule del SI che presentano
recettore CD4 (soprattutto linfociti T
helper, alcuni macrofagi e dendriti)
Fase acuta: sintomi influenzali
Fase cronica: asintomatica anche per
diversi anni ma compromissione del SI
(infezioni opportunistiche e tumori)
HIV produce ben 15 diverse proteine ottenute mediante
sovrapposizione di ORF,
splicing alternativo
e maturazione proteolitica dei precursori
dopo retrotrascrizione in DNA
e formazione delle LTR, Il
genoma di HIV è integrato a
caso nel DNA cellulare
Enzima RT ha 3 attività
catalitiche:
1.Retrotrascrive RNA in DNA
2.Degrada RNA su ibrido DNARNA
3.Copia secondo filamento DNA
Genoma evolve rapidamente
per alto tasso di mutazione
Ricombinazione promossa
anche dai “salti molecolari “
della RT
àDifficoltà nel produrre
vaccini
àFarmaci attuali sono
inibitori delle proteasi e della
RT
Ciclo di HIV
Viroidi
Agenti infettivi che parassitano cellule vegetali
Differenze rispetto ai virus:
•Genomi piccoli (alcune centinaia di nt) ad RNAss circolare e/o
bastoncellare
•Non codificano per proteine
•Non esistono in forma libera
HP sull’origine dei virus
• forme di vita degenerate che hanno perso molte
delle loro funzioni essenziali
• Porzioni di genoma cellulare che si sono
affrancate
• Evoluzione parallela ed indipendente rispetto a
organismi cellulari (retaggio di mondo ad RNA)
• Virus comunque comparsi dopo cellule
I virus batterici sono sistemi modello per lo studio del gene e
dei meccanismi molecolari che sottendono al flusso di
informazione genica
Facili da coltivare
Elevata capacità replicativaà grandi numeri
La morfologia della placca di lisi è carattere fenotipico utilizzato per
l’analisi genetica virale
Lisi rapida àplacche piccole margini irregolari
Lisi lenta à placche grandi margine netto
Carattere ”r”
Altro carattere fenotipico utilizzato per l’analisi genetica virale è la
specificità di infezione o gamma di ospite
Carattere “h”
Studi sulla ricombinazione nei virus
Analisi fenotipica della progenie fagica
ottenuta da esperimenti di co-infezione con
fagi con genotipi diversi
àLa frequenza di fagi ricombinanti è una
stima della distanza genica tra i 2 loci presi
in esame (espressa in unità di mappa, u.m.)
àModello sperimentale semplice, rapido,
buona statistica
Analisi fine del gene: esperimenti di Benzer
Benzer isolò vari mutanti di uno stesso
locus genico àfenotipi distinguibili
Infezioni miste ed analisi delle frequenze
di ricombinanti à
Sistema permetteva di rilevare freq di
ricombinazione molto basse
mappatura delle mutazioni intrageniche
Contributo a definire le proprietà del
codice genetico
Test cis-trans e complementazione
I fagi mutanti potevano produrre
placche di lisi solo se le funzioni
geniche difettive “complementavano”:
ripristino di una funzione genica grazie
alla presenza di una copia wild type
nella stessa cellula
Test di complementazione definisce se 2
mutazioni sono su stesso gene o geni
diversi
•Mutazione su geni diversi à
complementazione : ricompare fenotipo
selvatico
•Mutazione su stesso gene à no
complementazione: fenotipo mutante no
lisi
Benzer individuò 2 gruppi di
complementazione nel locus rII (A e B)
corrispondenti a 2 geni o “cistroni“
diversi
Genetica batterica
Anche batteri sono ottimi modelli di studio: semplici dal pv genetico
(genomi piccoli e aploidi), facili da coltivare in laboratorio, tasso
riproduttivo alto,…
Negli anni ‘50-60 studi sui batteri hanno permesso di dimostrare natura del
materiale genetico (esp trasformazione di Griffith ripreso da Avery,
MacLeod, McCarty)
Es. p di ricombinazione à prime mappature geniche
Esp di Jacob e Monod: modello operone nella regolazione dell’espr. genica
I Batteri possono essere coltivati in terreni di coltura solidi o liquidi
Caratteri fenotipici tipicamente studiati:
•Morfologia colonia
•Mutanti nutrizionali (capacità di crescere in
particolari condizioni colturali)
•Mutanti di resistenza
Oltre al genoma principale (cromosoma
“batterico” formato da DNA ds circolare) i
batteri hanno plasmidi ed episomi: piccoli
DNA circolari.
Contengono geni
•per resistenza a antibiotici,
•produzione tossine,
•e/o funzioni che possono dare vantaggio
selettivo in particolari condizioni crescita,
•e geni di trasferimento
Plasmidi: solo citoplasmatici
Episomi: sia in forma libera citoplasmatica che integrati nel
genoma principale
Eucarioti e procarioti contengono elementi genetici mobili o trasposoni:
sono DNA parassiti che spostandosi nel genoma possono distruggere geni o
interferire con loro espressione
Anni ‘40
Studi di Barbara McClintock
Sul mais: esistenza di mutazioni
geniche particolarmente instabili
anni ‘60: scoperta dei
trasposoni batterici
Nei batteri esistono 2 tipi di
trasposoni:
1) Elementi IS:
semplici
Brevi (2,5 kb)
Con solo geni per mediare
trasposizione
Trasposasi espressa a bassi
livelli à bassa freq
trasposizione
Spostamento dell’IS
(trasposizione conservativa)
2) Trasposoni composti (IS) e Tn3
contengono geni per trasposizione + seq genica extra (es resistenza a
farmaco); + lunghi
I Tn3 traspongono duplicandosi (trasposizione replicativa)
Rilevanza clinica:
I trasposoni batterici contribuiscono alla diffusione della resistenza gli
antibiotici
I trasposoni che veicolano i geni di resistenza si inseriscono in
plasmidi o episomi che possono trasferirsi da cellula a cellula
Geni di resitenza codificano per
enzimi che degradano, modificano, o
espellono l’ antibiotico
Sessualità e ricombinazione genica nei batteri
La ricombinazione si puo’ avere solo in condizioni di diploidia
parziale che si verificano a seguito di trasformazione, trasduzione e
coniugazione.
Trasformazione
Una molecola di DNA rilasciata
nell’ambiente da un batterio è captata da
una cellula “ricevente” (NB entra DNA
ss)
Se il DNA entrato ha omologia di
sequenza con DNA endogeno à
ricombinazione: trasferimento di
informazione genica
In alcune fasi della crescita i batteri sono
“competenti” cioè predisposti ad assumere
DNA nudo dall’ambiente extracellulare
La cellula “competente” ha opportune
proteine di membrana per legare e
internalizzare DNA esogeno
Fenotipo S (virulento) ed R (innocuo) osservato da
Griffith negli esperimenti su pneumococco (1928)
dimostrazione del principio trasformante
Coniugazione
Trasferimento unidirezionale di DNA da batterio donatore a ricevente
mediante contatto fisico (pilo sessuale o canale coniugativo)
Individuati 3 tipi “sessuali”
F- : ricevente
F+: donatore, ha un fattore F (episoma) con funzione cpniugativa
Hfr: donatore con alta freq di ricombinazione, ha fattore F integrato nel genoma
Il fattore F contiene geni per formare pilo coniugativo
Il trasferimento avviene a partire da un punto preciso: mentre si
trasferisce, il DNA si duplica (à una copia resta nella cellula donatrice)
La cellula ricevente a sua volta diventa F+
Nei ceppi Hfr il fattore F è integrato nel
genoma
Questi ceppi trasferiscono, oltre al DNA
di F, anche il DNA genomico associato
In q caso, la cellula ricevente raramente
diventa F+ perchè prima di trasferire l’ultimo
tratto di F deve essere trasferito intero
genoma (contatto deve durare almeno 1 h 30
min!!)
Esperimenti di accoppiamento interrotto tra ceppi Hfr e ceppi F- (con genotipi
diversi) ha permesso di creare “mappe genetiche” di E. coli
(ordine relativo dei geni definito in base al tempo necessario per trasferire versione
alternativa del gene corrispondente mediante coniugazione)
Questi esperimenti hanno anche dimostrato che il genoma batterico è circolare
I plasmidi coniugativi spesso contengono geni resistenza a antibiotici
Trasduzione
Trasferimento di DNA da un batterio donatore (precedentemente
infettato) and un ricevente, attraverso un fago
-Generalizzata: trasferito tratto qualsiasi
DNA che si impacchetta insieme a DNA
Virale
- Specializzata: trasfer di seq. specifiche
Trasduzione specializzata
Deriva da un fago lisogeno
(integrato come profago nel DNA
batterico)
Quando il fago si excide dal
genoma batterico per riprendere
via litica, può incorporare per
“sbaglio” breve tratto di DNA
batterico
Il tratto trasdotto è specifico
perchè il sito di integrazione del
fago sul genoma batterico è
specifico (siti att)
Anche gli studi sul trasferimento genico associato a
trasformazione e trasduzione hanno contribuito a “mappare geni”
batterici (soprattutto quelli molto vicini)
In particolare la frequenza di cotrasduzione e/o di cotrasformazione di
marcatori genici ha permesso di stimare il grado di associazione tra geni:
cioè quanto sono distanti fisicamente sul DNA
•Freq cotrasduzione alta à minore distanza fisica
•Freq cotrasduzione bassa à maggiore distanza fisica
Meccanismo molecolare di ricombinazione
Ricombinazione omologa: scambio
reciproco di DNA tra sequenze omologhe
(crossing over tra cromatidi meiotici,
integrazione di DNA trasdotto, coniugato o
trasformato in batteri, ricombinazione virale)
La ricombinazione avviene per rotture a
doppio filamento sul DNA, srotolamento,
invasione di ssDNA su filamento
complementare, saldatura, taglio e
ricongiunzione (vari enzimi coinvolti,
alcuni si trovano nel complesso
sinaptinemale)
Modello di Holliday
Ricombinazione sito-specifica: brevi seq specifiche di DNA sono
riconosciute da enzimi “recombinasi”à unione delle 2 molecole di DNA in cui
si trovano sequenze (+efficiente di ricombin. omologa)
Es integrazione di fago λ e di fattore F nel genoma batterico