Plant Genetic variability
Somatic
hybridization
Mutagenesis
Haploids
Somaclonal
variability
Genetic
modified
plants
Plant Genetic variability
Haploid
Haploid refers to those plants
which posses a gametophytic
number of chromosome (single
set) in their sporophytes
Scoperti per la prima volta in Datura
stramonium (Blakeslee, 1922).
Gli aploidi possono originarsi
spontaneamente in natura, ma possono
anche essere prodotti artificialmente.
Riportati in numerose specie: mais,
sorgo, riso, orzo, patata,frumento,
segale, erba medica, tabacco, cotone…...
Introduction
Perchè produrre Aploidi
L’aploidia delle piante presenta numerosi vantaggi per il
miglioratore:
o
Partner di fusione
o
Facile identificazione di mutazioni (tutti i loci sono
emizigoti)
o
Produzione di linee omozigoti
La poliploidizzazione di linee aploidi generalmente è effettuata
attraverso trattamenti con colchicina. Di fatto, con tale tecnica
sono state selezionate linee isogeniche dotate di resistenza a
insetti, funghi e virus.
La disponibilita di queste linee ha rappresentato un passo
importante anche verso la costituzione di ibridi con alto grado di
eterozigosi.
Notevole potenziale applicativo nel
miglioramento genetico degli aploidi
Per le piante autogame
questi genotipi costituicono varietà
potenziali, poiché attraverso la loro moltiplicazione si possono
ottenere linee puree
Per le piante allogame essi rappresentano le piante da
incrociare per la costituzione di varietà ibride.
In frumento e in riso la coltura di antere è frequentemente
usata per promuovere l’androgenesi utilizzando piante ibride F1
ottenute attraverso l’incrocio tra due linee pure (H1).
In questo modo la valutazione delle linee omozigoti, ottenute per
raddoppiamento cromosomico, può essere effettuata gia nella
generazione successiva (H2) anziché attendere fino alla
generazione F6 come di solito accade segeuendo gli schemi
classici di miglioramento genetico.
In vivo vs in vitro
Aploidi naturali
Si formano mediante
partenogenesi a carico di
ovocellule non ancora fecondate,
di sinergidi di sacchi embrionali
Aploidi da coltura in vitro
Si possono ottenere in vivo
trattando gli organi
ridotti oppure a partire dal
riproduttivi con agenti fisici
nucleo vegetativo del polline.
o chimici
Agenti fisici:
o Radiazioni ionizzanti
o shock termici
Agenti Chimici
Auxine
Piante aploidi da coltura in vitro
Con le tecniche di coltura in vitro è
possibile ottenere piantine aploidi a
partire da cellule gametiche
La possibilità di ottenere piante a
partire
da
granuli
pollinici
fu
dimostrata nel 1964 ad opera di S.
Guha e S.C. Maheshwari
Piante aploidi non sono ottenute solo mediante la coltura in
vitro di antere o polline (androgenesi), ma anche di ovuli
(ginogenesi) sia su terreno solido che in terreno liquido
mantenuto in agitazione
Produzione di Aploidi
La tecnica si basa sull’impiego
di
un
terreno
di
coltura
capace di nutrire le spore
aploidi:
le
contenute
all’interno
logge
microspore
polliniche
megaspore
delle
o
le
contenute
all’interno
del
sacco
embrionale.
La stimolazione della divisione
mitotica delle cellule apolidi
avviene
appropriati
nutritivi.
con
l’uso
di
substrati
L’androgenesi ha avuto in a passato
ed ha tuttora una maggiore
diffusione rispetto alla ginogenesi
in quanto è molto più semplice
collezionare antere che non ovuli.
Androgenesi
Tappe fondamentali
La fase gametofitica maschile inizia
con la formazione di 4 microspore
aploidi attraverso la meiosi
Il nucleo di ogni microspora subisce
in seguito una divisione mitotica
dando origine a due nuclei: un
piccolo nucleo generativo ed un
nucleo vegetativo piu grande.
Il nucleo generativo subisce un
ulteriore divisione originando i due
nuclei spermatici, i gameti maschili
Tappe fondamentali
Mediante la coltura in vitro di antere o polline la divisione del
nucleo generativo e/o di quello vegetativo puo essere
stimolata, promuovendo uno sviluppo di tipo sporofitico che
porta alla formazione di calli o di embrioni avventizi aploidi.
Evoluzione di un
embrione ottenuto
dalla coltura di antere
di un ibrido somatico
MODELLI
Divisione
Nucleo
Nucleo
vegetativo generativo
Ripetute
Divisioni
Ripetute
Divisioni
Divisione
NUCLEO MICROSPORA
Divisione
Divisione
Nucleo
Nucleo
Nucleo
Nucleo
vegetativo generativo vegetativo vegetativo
Ripetute
Divisioni
Ripetute
Divisioni
Ripetute Divisioni
Nucleo
Nucleo
vegetativo generativo
Ripetute
Divisioni
Poche
divisioni
sviluppo del tessuto aploide
Androgenesi diretta:
dalla divisione delle cellule
aploidi
strutture
embrioni
embriodi
si
ottengono
simili
ad
chiamate
Tipi di androgenesi
Androgenesi indiretta:
dalla divisione delle cellule
aploidi
si
ottengono
calli
indifferenziati
Sia dai calli che dagli embriodi secondo diversi modelli di
sviluppo si possono rigenerare per embriogenesi o per
organogenesi plantule aploidi.
La tendenza da parte di una
Differenze
microspora di originare embriodi
tassonomiche oppure calli posti in coltura in vitro
Nelle Graminaceae la
rigenerazione delle piante
aploidi passa generalmente
attraverso la formazione del
callo
è in qualche modo connessa a
differenze tassonomiche.
Nella maggior parte delle Solanaceae
e delle Brassicaceae l’androgenesi
avviene per embriogenesi diretta.
Fattori che influenzano la risposta
androgenetica
Genotipo della pianta
Condizioni di allevamento della pianta madre
Substrati di coltura
Pretrattamenti (freddo, calore, chimici
Non si può fornire un unico protocollo sperimentale per tutte le
specie vegetali è possibile descrivere le tappe fondamentali
dell’androgenesi mediante la coltura di antere e di polline
Genotipo della pianta
•In ogni specie genotipi diversi hanno attitudine differente a
dare origine a piante aploidi vitali.
•In base ai risultati ottenuti in esperimenti di androgenesi su
frumento, patata, segale, orzo si dimostro che tale attitudine
è di natura genetica (carattere ereditabile).
•Per ciascuna specie e per ciascun genotipo opportune
condizioni di coltura consentano di incrementare le attitudini
androgenetiche.
Stadio di sviluppo dell’ antera
Un fattore molto importante è lo
stadio di sviluppo dell’antera e
quindi delle microspore al momento
del
prelievo
e
della
messa
in
di
differenziazione
coltura.
Il
processo
gametofitico può essere deviato
verso
solo
quello
sporofitico
esclusivamente in corrispondenza
di un preciso stadio di sviluppo del
granulo pollinico.
Tale stadio varia da specie a
specie e solitamente compreso tra
la fine dello stadio di tetrade e le
primissime fasi dello stadio
binucleato
Stadio ottimale dell’antera
Nella maggioranza delle specie
saggiate lo stadio ottimale per il
prelievo delle antere è risultato
quello uninucleato, immediatamente
prima o durante la divisione
mitotica.
L’analisi al microscopio delle antere
opportunamente schiacciate e trattate
con carminio acetico permette
determinare lo stadio di sviluppo delle
microspore in vivo.
La raccolta dei boccioli fiorali viene
effettuata a diversa età in modo da
porre in relazione un carattere
fenotipico distintivo con lo stadio della
microsporogenesi.
Pretrattamenti
•3-5 °C per 2 giorni
(tabacco)
•35
°C
per
24
ore
(brassica)
4-10 °C per 3-28 giorni
(cereali)
Tobacco
A cultured tobacco anther
showing globular stage and
torpedo stage
A cultured tobacco
anther after 6 wks
Antere o Microspore?
M: non si forma callo da tessuti somatici
M: si eliminano interazioni negative tra microspora e tessuti
dell’antera (svantaggio se l’antera ha effetto stimolante)
M: migliore controllo della risposta androgenetica
• PROBLEMI
coltura di M più laboriosa
successo solo in poche specie
Ginogenesi
• Riportata
per
la
prima
volta nell’orzo
• Utile per ottenere aploidi
da piante maschiosterili
• Successo
solo
in
poche
specie (es. barbabietola da
zucchero)
• Tecnicamente la procedura
è
difficile
e
grande esperienza
richiede
Risposta Ginogetica
I FATTORI CHE INFLUENZANO LA RISPOSTA
GINOGENETICA
Genotipo della pianta
Stadio di sviluppo dell’ovulo (non ancora fecondato!)
Condizioni di allevamento della pianta madre
Substrato
Fattori stagionali (x barbabietola estate)
Pretrattamenti (freddo)
RADDOPPIAMENTO CROMOSOMICO
•
Colchicina/orizalina
•
Antere
•
Gemme apicali
•
Embrioni
•
Nodi di pianta aploide capitozzata
•
Immersione delle radici di piante capitozzate in
contenente colchicina (cereali)
•
Organogenesi da espianto dell’aploide
soluzione
Limitazioni
• Bassa frequenza di aploidi
• Raddoppiamento cromosomico poco
efficiente (chimere)
• Aploidi e aploidi-raddoppiati devono
essere geneticamente stabili
• Variabilità genetica (somaclonale)
negli aploidi ottenuti in vitro
• Albinismo
