STUDIO DELLA FLORA
MICROBICA INTESTINALE
F
Agnese Miranda, Raffaella Zagaria, Antonietta G. Gravina, Marco Romano
Dipartimento Medico Chirurgico di Internistica Clinica e Sperimentale - Gastroenterologia ed Azienda Ospedaliera Universitaria,
Seconda Università di Napoli
INTRODUZIONE
Il microbiota intestinale è l’insieme di microorganismi che popolano il
nostro intestino. Quest’ultimo è uno degli ecosistemi microbici con la maggiore densità di popolazione. Il microbiota intestinale umano ha un carico
elevato di microorganismi ed è pari ad un peso di circa 1 kg. La maggior
parte di questi microorganismi è localizzata nel colon. Inoltre il microbiota
intestinale umano, spesso indicato come “a forgotten organ of the human
body”, contiene un numero di geni almeno 100 volte superiore rispetto al
genoma umano. Alla luce di ciò possiamo affermare che l’uomo può essere
considerato un superorganismo costituito da cellule umane e microbiche,
il cui corredo genetico è rappresentato dall’insieme dei geni presenti nel
genoma umano e nel genoma del microbiota intestinale (microbioma).
La microflora intestinale è costituita da un “insieme di microorganismi
presenti nel lume intestinale, i quali, se convivono in un determinato equilibrio, contribuiscono allo stato di salute dell’ospite”.
Il corpo umano è costituito da circa 10.000 miliardi di cellule e ospita
una popolazione batterica di circa 100.000 miliardi di cellule, in rapporto
di 1:10. Attualmente sono stati identificati circa 400 specie di batteri
della microflora intestinale e, di questi, circa 30 specie sono pressoché
sempre presenti in ciascun singolo individuo. In particolare, i bifidobatteri
rappresentano il 90% della flora intestinale dei neonati; percentuale che
si riduce attorno al 50% negli individui adulti. Specie e ceppi autoctoni
di batteri vengono selezionati da ciascun individuo, secondo le proprie
abitudini alimentari e la propria fisiologia. Alcuni batteri sono benefici,
ma dopo una mutazione possono divenire dannosi liberando tossine. La
maggior parte dei microorganismi che coabitano con l’uomo si trova nel
tratto gastrointestinale (apparato digerente). La loro distribuzione varia
grandemente lungo la superficie di circa 350 m2, in cui si svolge la digestione dei cibi, grazie a pliche, villi, microvilli e cripte che sono posizionati
sulla parete del tubo digerente. Il mantenimento di questo ordine microbatterico è fondamentale per il buon funzionamento dell’intestino,
la salute complessiva dell’organismo umano e la completa maturazione
del sistema immunitario.
COMPOSIZIONE E LOCALIZZAZIONE
Il microbiota intestinale è composto principalmente da batteri anaerobi
(95%) e solo in minima misura da batteri aerobi (5%). Lattobacilli, bifidobatteri, batterioidi ed enterococchi sono le specie batteriche che sono
state studiate più diffusamente, mentre le funzioni di clostridi, lieviti ed
altri sono ancora oggetto di valutazione. Nel piccolo intestino i batteri
commensali sono prevalentemente gram-positivi, mentre nel grosso intestino stazionano batteri gram-negativi. La prima parte del colon ospita
germi deputati alla fermentazione dei carboidrati, il secondo tratto invece ospita germi deputati alla metabolizzazione di proteine e aminoacidi. La proliferazione batterica è rapida nel colon ascendente, dove il pH
è acido, più lenta nel tratto discendente dove il pH tende alla neutralità.
Nel lume intestinale il mantenimento e/o le variazioni del pH risultano
essere un efficace meccanismo di controllo della crescita batterica. Con
il progredire dell’età, varia la composizione batterica: durante l’allattamento l’intestino dell’infante viene colonizzato da batteri ambientali e
di provenienza materna (provenienti cioè dal latte, dalla suzione e dal
contatto fisico). L’allattamento al seno provoca un abbassamento del pH
e quindi un ambiente favorevole ai bifidobatteri che stimolano le funzioni immunitarie. Al contrario il pH intestinale dei bambini allattati artificialmente risulta più elevato, ne consegue che le enterobatteriacee
(e fra queste anche i germi patogeni) conoscono una crescita più spiccata
a scapito dei bifidobatteri. Con lo svezzamento e l’introduzione di cibi
solidi la composizione della microflora diventa simile a quella degli
adulti. Sulla base del comportamento dei microorganismi nei riguardi
dell’ospite (uomo) i batteri intestinali vengono classificati in potenzialmente dannosi (come proteus, candida, clostridi, staphylococcus), indifferenti come (bacteroides, enterococcos) e benefici (come lactobacillus,
eubacterium, bifidobacterium).
FUNZIONI
Il microbiota intestinale svolge una serie di funzioni essenziali per il benessere del nostro organismo: corretta maturazione morfologica e funzionale del tratto digerente; attività dei processi digestivi;
metabolizzazione (di proteine di zuccheri e lipidi; di acidi biliari e ormoni
steroidei); controllo quali- quantitativo dei gas intestinali; produzione di
vitamine (vit. K e complesso B) e utilizzazione di vitamine esogene; metabolizzazione di diversi farmaci; rappresenta una vera e propria barriera
di protezione nei confronti delle aggressioni da batteri nocivi o da agenti
dannosi di natura alimentare o virale.
Maturazione morfologica
Studi condotti su animali privati della flora intestinale hanno evidenziato
la presenza di villi più sottili con una diminuzione della profondità delle
cripte e un ridotto spessore della mucosa. Sono rilevabili, inoltre, anche
anomalie del sistema immunitario locale. I batteri svolgono, dunque, un
ruolo indispensabile per un corretto sviluppo e un’adeguata funzionalità
del sistema immunocompetente proprio a livello dell’intestino, dove la
risposta immunitaria è scarsa e viene a mancare una valida protezione
delle mucose dall’invasione dei microorganismi patogeni.
Metabolizzazione zuccheri e proteine
Nell’ambito dei processi digestivi possiamo fare una distinzione di massima tra flora fermentativa in grado di digerire amido e altri polisaccaridi
e flora putrefattiva per la digestione delle proteine, localizzate per lo più
a livello del colon.
Metabolizzazione acidi biliari
L’acido colico e chenodesossicolico (acidi biliari primari) sintetizzati a livello epatico e secreti con la bile, vengono trasformati a livello intestinale
rispettivamente in desossicolico e litocolico (acidi biliari secondari), vengono quindi sequestrati all’interno del lume intestinale e resi non disponibili per il circolo enteroepatico.
Produzione gas intestinali
Fondamentale è il ruolo svolto nel controllo della produzione quali-quantitativa dei gas intestinali. Essi infatti derivano dai processi di metabolizzazione da parte dei microorganismi di sostanze endogene (muco e
cellule di sfaldamento) ed esogene (alimenti).
Produzione vitamine
La popolazione batterica è responsabile della sintesi di numerose vitamine: vit. K, complesso B, acido folico, biotina, acido pantotenico e vitamina C. Essa inoltre è in grado di utilizzare vitamine introdotte con la
dieta. È noto infatti come la somministrazione di alcuni farmaci, soprattutto antibiotici e sulfamidici, in grado di alterare la normale flora batterica intestinale, possa determinare una situazione di disvitaminosi.
Metabolizzazione dei farmaci
Tra le sostanze esogene prendiamo in considerazione anche i farmaci che
la microflora è in grado di metabolizzare dando origine ad una molteplicità di composti che possono risultare farmacologicamente attivi, inattivi
o addirittura tossici. Per questa e tutte le altre funzioni sopracitate risulta
quindi evidente come il mantenimento dell’equilibrio dell’ecosistema intestinale sia fondamentale al fine di preservare lo stato di salute e di benessere di ogni individuo.
RUOLO DELLA FLORA BATTERICA
NELLA PREVENZIONE DELLE INFEZIONI
La flora batterica ha un ruolo nella prevenzione delle infezioni tramite
attraverso antagonismo diretto; produzione di batteriocine, produzione
di sostanze ad attività antibatterica verso alcuni ceppi di batteri grampositivi e gram-negativi; competizione per i nutrienti; competizioni per
i recettori cellulari; capacità di aderire alle cellule mucose intestinali,
sottraendo “spazio” ai batteri patogeni (Lattobacilli in particolare);
stimolazione dell’immunità e capacità di attivare una risposta immunitaria aspecifica, aumentando l’attività macrofagica e la produzione
di Ig-IFN, di IgGA e di peptidi a basso PM, capaci di interferire nelle risposta immunitaria.
MICROBIOTA E ALTERAZIONI
DEL TRATTO GASTROINTESTINALE
L’equilibrio della flora batterica intestinale può essere facilmente compromesso dai seguenti fattori: alimentazione non equilibrata, eccessivo
stress, terapie con antibiotici ed episodi di diarrea. Uno squilibrio della
flora batterica intestinale può manifestarsi con disturbi gastrointestinali,
gonfiore addominale, cattiva digestione, acne, seborrea e pelle impura
.
MICROBIOTA ED INFIAMMAZIONE INTESTINALE
IN SALUTE ED IN MALATTIA
All’interno del tratto GI, i batteri hanno un rapporto di reciproco beneficio con il loro ospite, necessario al mantenimento della normale
funzione immunitaria della mucosa, dell’integrità della barriera epiteliale, della motilità ed all’assorbimento dei nutrienti. La rottura di
questo rapporto altera la funzione gastrointestinale predisponendo
automaticamente alla malattia.
Gli studi sugli animali suggeriscono che le perturbazioni comportamentali derivanti da stimoli esterni, come ad esempio lo stress, possono determinare importanti cambiamenti nella composizione del
pattern del microbiota intestinale. Tali cambiamenti sono associati ad
un aumento della sensibilità a stimoli pro-infiammatori nel tratto GI.
I meccanismi che sottendono queste alterazioni possono comportare
modifiche nella normale fisiologia del tratto GI responsabili del- l’alterazione dell’habitat dei batteri enterici. Inoltre, è stato visto come
la perturbazione sperimentale del microbiota può alterare il comportamento, inducendo nei topi germ-free linee comportamentali diverse
da quelle dei topi colonizzati. Ottenere una migliore comprensione del
rapporto tra comportamento e il microbiota intestinale può fornire la
comprensione della patogenesi dei disturbi intestinali funzionali e
delle patologie infiammatorie.
MICROBIOTA E IBIS
La sindrome del colon irritabile (IBS) è il risultato di alterazioni della funzione motoria e secretiva gastrointestinale, delle sensazioni viscerali, ma
anche dell’attività del sistema nervoso centrale e del sistema nervoso
autonomo variamente associate tra loro. La predisposizione genetica e
il profilo psicologico concorrono con stimoli ambientali, psicosociali ed
endoluminali allo sviluppo dell’IBS. Inoltre vi è un’aumentata eterogeneità del microbiota intestinale rispetto ai pazienti sani in particolare riguardo ai firmicutes, batteri gram-positivi non coltivabili e di cui non si
conoscono le funzioni, che abitano normalmente nel colon umano e sono
naturali ospiti della flora microbica normale.
MALATTIE INFIAMMATORIE DELL’INTESTINO
L’alterazione della flora batterica intestinale sembra giocare un ruolo
patogenetico importante nelle malattie infiammatorie dell’intestino
(i.e. Colite Ulcerosa e morbo di Crohn). In particolare, numerosi casi di
colite ulcerosa e morbo di Crohn sembrerebbero dipendere proprio
dalla scarsa produzione intestinale di IgA e IgG, la cui riduzione sarebbe
causata proprio da un’alterazione della microflora batterica. Di conseguenza, l’intestino ha difficoltà a proteggersi dall’aggressione di agenti
nocivi, batteri e sostanze sfuggite alla digestione e mette in azione
particolari automatismi cellulari di risposta infiammatoria tesi all’eliminazione del fatto-re aggressivo; questi meccanismi, alla lunga, potrebbero contribuire all’instaurarsi di una condizione infiammatoria
cronica dell’intestino.
INTEGRAZIONE DEL MICROBIOTA
NELL’ASSE INTESTINO-CERVELLO
Nonostante siano molte le conoscenze sulla fitta rete di comunicazione
esistente tra il tratto gastrointestinale (GI) e il sistema nervoso centrale,
la capacità del sistema nervoso centrale di influenzare il microbiota e
viceversa risulta scarsamente studiata. Mentre le interazioni bidirezionali cervello-intestino sono dei meccanismi ben noti ormai da tempo,
il ruolo della flora enterica in tale interazione (includendo in questa sia
gli organismi commensali che quelli patogeni) è stato messo in evidenza soltanto negli ultimi anni.
Il cervello può influenzare il microbiota intestinale in maniera indiretta,
attraverso cambiamenti della motilità, secrezione e permeabilità intestinale, oppure in maniera diretta, attraverso molecole di signaling cellulare rilasciate nel lume intestinale dalle cellule della lamina propria
(cellule enterocromaffini, neuroni, cellule del sistema immunitario).
La comunicazione tra il microbiota intestinale e l’ospite può avvenire attraverso molteplici meccanismi: in condizioni fisiologiche il signaling recettore-mediato dalle cellule epiteliali, allorché sussista un’aumentata
permeabilità intestinale, determina la stimolazione diretta delle cellule
ospiti nella lamina propria.
Le cellule enterocromaffini sono importanti trasduttori bidirezionali che
regolano la comunicazione tra il lume intestinale e il sistema nervoso.
L’innervazione afferente vagale delle cellule enterocromaffini fornisce
un pathway diretto per il signaling dalle cellule enterocromaffini alle
cellule neuronali, collegamento che potrebbe avere un ruolo importante
nella modulazione del dolore e della risposta immunitaria, nel controllo
del background emozionale e di altre funzioni omeostatiche.
La persistenza di perturbazioni delle interazioni bidirezionali tra il microbiota intestinale ed il sistema nervoso potrebbe rappresentare un
passaggio fondamentale nella fisiopatologia di malattie gastrointestinali
acute e croniche, come ad esempio i disturbi intestinali funzionali e le
patologie infiammatorie.
STUDIO DEL MICROBIOTA INTESTINALE
High-Throughput Culturing
Metodica utilizzata per isolare le specie microbiche da ambienti non di
origine laboratoristica tramite l’uso di micro-beads o di superfici solide
con multiplex. Tale tecnica permette di coltivare migliaia di batteri simultaneamente. Il limite di tale metodica è costituito dal fatto che i microbi del tratto GI hanno stabilito nel corso dell’evoluzione relazioni con
l’ospite o altri microbi che li rendono dipendenti dall’attività metabolica
dell’ecosistema in cui vivono. Pertanto, è difficile coltivarli al di fuori del
loro ecosistema.
Utilizzo della Biologia Molecolare
La biologia molecolare grazie ai suoi costi relativamente bassi, alla sempre maggiore rapidità del sequenziamento del DNA ed ai progressi compiuti negli approcci computazionali per l’analisi di complessi dataset ha
permesso la transizione dalla fenotipizzazione batterica convenzionale
alla genotipizzazione e all’approccio molecolare. Le tecniche di biologia
molecolare si basano sullo studio della small subunit ribosomal RNA (16S
rRNA). L’RNA ribosomiale è la tipologia più abbondante di RNA presente
nella cellula. Non codifica direttamente le proteine, ma è il componente
essenziale (circa i due terzi) dei ribosomi, macchine catalitiche che provvedono all’assemblaggio delle proteine, presenti in tutte le cellule viventi. Consiste di circa 1.5 kb, dimensione ragionevole per analisi di
sequenza comparativa, ha un numero sufficiente di regioni ipervariabili
che riflettono la divergenza nell’evoluzione di specie differenti; il suo sequenziamento è un metodo utile per identificare e classificare sul piano
filogenetico batteri intestinali.Attualmente oltre 600.000 sequenze del
gene 16S rRNA sono disponibili in GeneBank. Le sequenze di rRNA possono essere clusterizzate in gruppi correlati sulla base della % di identità
della sequenza stessa. Sono stati stabiliti i cut-off del 95% e 98% per
delimitare, rispettivamente, genere e specie batterica. Per filotipo si intende un gruppo filogenetico di microbi, con un cluster di sequenze del
gene 16S rRNA caratterizzate da un’identità di sequenze ≥97%.
La Tabella 1 indica le principali tecniche di biologia molecolare adoperate per lo studio del microbiota intestinale. La clonazione e successivo
sequenziamento del gene 16srRNA è utilizzata principalmente per ottenere approfondite informazioni sul piano filogenetico. Il fingerprinting
permette il confronto di diverse comunità microbiche e il monitoraggio
della loro dinamica. La FISH permette di quantizzare e localizzare specifiche comunità microbiche. Nel loro complesso tali metodiche hanno
contribuito ad aumentare le nostre conoscenze filogenetiche del microbiota intestinale e di comprendere l’impatto di ospite d’ambiente sulla
struttura e dinamica del microbiota stesso.
Tabella 1. Tecniche di studio sulla diversità microbica intestinale.
Clonazione e successivo sequenziamento del gene 16S rRNA;
Metodiche Coltura Dipendenti
Il microbiota si identifica in base alle forme specifiche e alle variazioni
morfologiche (di forma) che esso può auto-indurre in funzione del luogo
o “terreno” dell’ospite, nel quale si trova a vivere. Le metodiche culturadipendenti sono quindi basate su caratterizzazioni fenotipiche quali la
morfologia, richieste nutrizionali, profili fermentativi. Tale metodiche
hanno dei limiti come la difficoltà ad ottenere campioni rappresentativi
dalle differenti niches intestinali per mancanza di mezzi di coltura realmente selettivi; scarsa riproducibilità; basso potere discriminatorio; ambiguità di risultati.
Fingerprinting del gene 16S rRNA mediante elettroforesi con gel a gradiente di denaturazione (DGGE);
Fluorescent In Situ Hybridization (FISH);
High-throughput Phylogenetic DNA Microarray.
Nel corso degli ultimi 10 anni la tipizzazione di batteri intestinali tramite
tecniche coltura-dipendenti si è completamente arrestata e come si è
assistito ad un aumento drammatico del numero di filotipi GI evidenziati
mediante tecniche di biologia molecolare.
Le Figure 1 e 2 indicano in maniera schematica come sia possibi-le identificare e classificare un batterio intestinale coltivabile (Figura 1) e non
coltivabile (Figura 2).
Nella Figura 3 è invece schematizzata la analisi del microbiota intestinale
attraverso sequenziamento ed analisi filogenetica mediante microarray
(phylogenetic microarray assay). In breve, le specie batteriche presenti in
un determinato campione intestinale potranno essere identificate e quantificate grazie ad ibridazione di RNA trascritto dal DNA estratto da una comunità microbica e successivamente marcato con microchips precostituiti
e contenenti migliaia di sequenze geniche batteriche note.
La biologia molecolare ci ha permesso di stabilire che il microbiota intestinale umano consiste di un core individuale stabile di microbi (colo-
Figura 1. Identificazione dei batteri.
nizzatori stabili), circondati da microbi che sono “visitatori temporanei”,
in associazione ad un core di batteri comune a tutta la specie umana.
L’analisi del microbiota intestinale umano attraverso Phylogenetic Microarray Assay presenta alcuni limiti. In particolare, una volta stabilita
una correlazione tra microbiota intestinale ed una determinata condizione patologica intestinale, come possiamo stabilire che esista un rapporto di causa-effetto tra l’alterazione del microbiota intestinale e lo
specifico quadro di malattia? E, nel caso siamo in grado di stabilire che
l’alterazione del microbiota intestinale sia la causa di una determinata
patologia intestinale, come possiamo definire i meccanismi patogenetici
di tale associazione? In questo ci viene in soccorso lo studio della metaomica (Figura 4).
Figura 2. Identificazione dei batteri non coltivabili.
Figura 3. High-throughput analisi del microbiota GI umano mediante sequenziamento e Phylogenetic Microarray Analysis.
Una volta identificata la specie microbica caratteristica di una specifica
condizione di malattia, dobbiamo sapere quali RNA della specie identificata vengano trascritti (meta-transcriptomica), quali proteine vengano
sintetizzate (meta-proteomica), quali metaboliti vengano prodotti
(meta-metabolomica), quale sia il potenziale genetico della specie batterica identificata (meta-genomica).
La meta-genomica è lo studio coltura-indipendente, DNA-based, di strut-
tura e funzioni delle comunità microbiche di un determinato ecosistema
e delle loro interazioni con gli habitats da esse occupati. Si basa sulla
estrazione di DNA, clonazione di frammenti di DNA in ospite adatto (E.
coli), formazione di una libreria meta-genomica utile per effettuare successivamente un’analisi sequence-driven o function-driven.
L’analisi sequence-driven ci fornisce un’istantanea della diversità genetica
di un determinato ecosistema. L’analisi function-driven attraverso lo
Figura 4. Meta “omics”.
screening di librerie meta-genomiche ci permette di individuare nuovi
enzimi o funzioni di particolare interesse (ad es. antibiotico-resistenza),
e di identificare il network metabolico di una determinata comunità
microbica (meta-metabolomica).
RIASSUNTO E PROSPETTIVE FUTURE
• Il microbiota intestinale in gran parte non è caratterizzabile mediante
coltura (the “unculturables”).
• Sviluppo di tecniche coltura-indipendenti con analisi di 16S rRNA necessarie.
• Il microbiota intestinale è individuo- e sede-specifico
con enorme diversità.
• Il Phylogenetic Microarray Assay permette la simultanea analisi di migliaia di microbi per lo studio del
microbiota GI in salute e malattia.
• Il microbiota intestinale fluttua intorno ad un core
di colonizzatori stabili e le sue modifiche sono associate ad IBD ed IBS.
• Le tecniche di biologia molecolare ci permettono di
stabilire correlazioni tra microbiota e caratteristiche
dell’ospite ma non ci consentono l’estrapolazione di
funzioni microbiche.
• Meta-genomica e meta ”omics” necessari per informazioni sul potenziale genetico ed attività del microbiota GI umano.
• Microorganismi che risiedono nel tratto GI costituiscono un importante fattore ambientale che
contribuisce allo stato di salute o malattia dell’uomo.
• In futuro dovremo essere in grado: a) di stabilire associazioni statisticamente rilevanti tra filotipi microbici, attività microbiche e stato
di salute/malattia; b) di adoperare le nostre conoscenze sulla composizione e la attività del microbiota umano come indice diagnostico
e prognostico della salute umana e dovremo sviluppare composti
che hanno come bersaglio specifiche linee microbiche, prodotti genici e vie metaboliche, al fine di utilizzarli come potenziali nuovi
agenti terapeutici per promuovere lo stato di salute.
BIBLIOGRAFIA
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–
Camp JG, Kanther M, Semova I, Rawls JF. Patterns and scales in gastrointestinal microbial ecology. Gastroenterology 2009; 136:1989-2002.
Collins SM and Bercik P.The relationship between intestinal Microbiota and the central nervous system in normal gastrointestinal function and disease. Gastroenterology 2009; 136:2003-14.
Zoetendal EG, Rajilic-Stojanovic M, de Vos WM. High-throughput diversity and functionality analysis of the gastroinestinal tract microbiota. Gut 2008; 57:1605-15.
