Appunti di Microbiologia
Informazioni:
Prof Eugenio Debbia
Università di Genova
Scuola di Scienze Mediche e Farmaceutiche
DISC-Sezione di Microbiologia,
Largo Rosanna Benzi 10,16132 Genova
Tel: 010-353 38136,
329 260 5218 338 88 05 256
FAX: +39-010-353 7651
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e-mail: [email protected]
W. Churchill
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Testi consigliati
Antonelli et al. Principi di Microbiologia Medica II ed. CEA
2012
La Placa Microbiologia Medica. Edises 2014
Jawetz et al. Microbiologia Medica. Piccin 2012
M P Conte, P. Mastromarino. Microbiologia Medica
Batteriologia e Virologia. Esculapio 2014
Wessner et al. Microbiologia. CEA, 2015
Brock- 3 Biologia dei microorganismi Pearson 2016
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Con il microscopio si incomincia a pensare all’invisibile
E ciò permette la scoperta dei microrganismi
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Olanda 1674
Anton van Leeuwenhoek
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Il microscopio a lente singola di Leeuwenhoek
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Germania 1840
Friedrich Henle
Teoria del “germe”
I microorganismi sono
responsabili di
MALATTIA nell’uomo
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Vienna 1850-1860
I.F. Semmelweis
Tentò di dimostrare che i
germi dalla sala di anatomia
giungevano alla sala parto,
tramite i medici e gli studenti
Suggerì la disinfezione delle
mani prima di intervenire
sulla puerpera.
Non fu mai ascoltato
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
1870-1880
Francia e Germania
viene dimostrato che alcuni microorganismi sono i
responsabili di carbonchio, rabbia, peste, colera e tubercolosi
Pasteur
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Koch
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
MICROBIOLOGIA
• Batteri
• Virus
• Miceti
• Protozoi e altri parassiti
Microrganismi
Organismi unicellulari
Eucarioti
Nucleo evidente con
membrana
Alghe
Protozoi
Miceti
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Batteri
Nucleo non evidente
Eubatteri
Clamidie
Spirochete
Rickettsie
Micoplasmi
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
BATTERI
dimensioni
Cellula Eucariotica
Cellula
procariotica
Nucleo
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
STRUTTURA INTERNA DELLA CELLULA MICROBICA
a) CELLULA PROCARIOTICA b) CELLULA EUCARIOTICA
Membrana
citoplasmatica
Reticolo
endoplasmatico
Citoplasma Nucleoide Ribosomi
Ribosomi
Nucleo
Nucleolo
Membrana
nucleare
Parete
cellulare
plasmide
Citoplasma
Membrana
citoplasmatica
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Mitocondrio
Cloroplasto
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Composizione: H2O (80%), K, Na, Mg, Ca, Fe,
Zn, P, S e macromolecole organiche
localizzazione delle macromolecole nella cellula batterica
Membrana
Flagello
Parete
Citoplasma
Polisaccaridi
Proteine
Nucleoide
Ribosomi
Acidi
nucleici
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Granuli
D’accumulo
Lipidi
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
G. Antonelli, M. Clementi, G. Pozzi, G.M. Rossolini
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
1. Cocchi, 2. Diplococchi,
3. Streptococchi, 4. Stafilococchi
5.Tetradi di cocchi, 6. Coccobacilli
7. Clostridi, 8. Bastoncini,
9. Carbonchi, 10. Fusobatteri
11. Vibrioni, 12. Spirilli
13. Borrelie, 14. Treponemi
15. Leptospira
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
IL MICROSCOPIO OTTICO
• Vite macrometrica: è
la manopola di regolazione
grossolana della messa a fuoco.
• Vite micrometrica: permette la
regolazione fine della messa a
fuoco.
•
• Regolatore dell’intensità
luminosa: permette di variare
l’intensità luminosa del campo.
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COLORAZIONE semplice DELLE
CELLULE PER L’OSSERVAZIONE
MICROSCOPICA
Strisciare la coltura su un vetrino
Formando uno strato sottile
Ricoprire il vetrino con colorante
Risciacquare e asciugare
Asciugare all’aria
Vetrino
100x
Olio
Porre una goccia d’olio (da immersione)
sul vetrino; osservare con l’obiettivo 100x
Passare il vetrino sulla fiamma per fissare il campione
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Hans Joachim Christian Gram
Il suo nome è legato all'importante
scoperta della colorazione di Gram
da lui effettuata nel 1884 a Berlino:
mentre esaminava del tessuto
polmonare di pazienti deceduti per
polmonite notò che le cellule
batteriche si coloravano più
intensamente con cristal violetto e
soluzione di lugol
Tale colorazione è tutt'oggi
essenziale nella classificazione dei
batteri
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COLORAZIONE DI GRAM (complessa o
differenziale)
Fase 1
Fase 2
Ricoprire lo striscio fissato al calore
con cristal-violetto per 2-3 minuti
Tutte le cellule si coloreranno di viola
Aggiungere soluzione iodata per 1 minuto
Le cellule rimarranno viola
Fase 3
Decolorare in alcool per circa 1-2 minuti
Le cellule Gram-positive risulteranno
viola, quelle Gram-negative incolori
Colorare con fucsina per 1-2 minuti
GLe cellule Gram-positive (G+)
risulteranno viola, quelle Gram-negative
(G-) avranno unahttp://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm
tonalità da rosa a rosso
G+
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Fase 4
La colorazione di Gram
Un Gram positivo
Un Gram negativo
Cocchi Gram
positivi
Cocchi Gram
positivi
Un Gram positivo
Bastoncelli
Gram negativi
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misti a cocchi Gram positivi
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Colorazione di Ziehl-Neelsen
(bacilli alcool-acido resistenti)
Fucsina fenicata a caldo 5 m
Acido solforico (20%) 30’’
Alcool 30’’
Blu di metilene 1 m
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Batteri alcool-acido resistenti: rossi
su fondo blu azzurro
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Osservazione a contrasto di fase
Un batterio (L. sakei),
400x
Un lievito (S. cerevisiae),
400x
Una muffa (G. candidum),
400x
Un attinomicete
400x
Un lievito (Y. lipolytica)
400x
Una muffa (R. oligosporus),
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400x
Osservazione in campo scuro
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Anatomia della cellula batterica
Schematicamente dall'esterno verso l'interno i batteri presentano:
a) glicocalice o slime
b) capsula
c) flagelli, pili o fimbrie
d) involucro (parete in generale) totalmente diverso tra grampositivi e gram-negativi (tale differenza è messa in rilievo proprio
dalla colorazione di Gram)
e) membrana citoplasmatica
f) mesosomi
g) citoplasma
cromosoma o altro materiale genetico accessorio: es. plasmidi.
ribosomi
corpi inclusi
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Glicocalice
Materiale stratificato intorno alla cellula
Strato S: distribuzione regolare (cristallina)
di sub-unità glicoproteiche
Capsula: matrice fibrosa costituita da
polimeri di carboidrati
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Flagelli
Moto browniano
Movimento attivo
Flagello: unico filamento sprovvisto
di membrana – flagellina(diversa in specie batteriche diverse)
Chemiotassi positiva e negativa
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STRUTTURA
DI UN FLAGELLO
BATTERICO
Filamento
Flagellina
Membrana
Esterna
LPS
Uncino
Richiede molta energia
ATP
Anello L
Anello P
Peptidoglicano
Periplasma
Membrana
citoplasmatica
Proteina
Mot
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Anello MS
Proteina Fli
invertitore
del motore
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Pili o Fimbrie
Le fimbrie sono appendici diverse dai flagelli,
sono costituite da una proteina detta pilina che
gioca un ruolo fondamentale nel processo di
adesione dei batteri ad altre cellule
(patogenicità). Spesso sono codificati dai
plasmidi (vedi oltre) sia come fimbrie per
l'adesività sia come pilo detto sessuale per
creare un ponte citoplasmatico tra due cellule
batteriche nei processi di coniugazione.
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Afimbrial adhesin
Type I fimbriae
Type IV fimbriae (= bundle forming pilus)
Curli
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La Parete (Cell-Wall)
E’ lo strato compreso tra la membrana citoplasmatica
e la capsula
Gram+: peptidoglicano e ac. teicoici
Gram-: peptiglicano, lipoproteine, membrana esterna
e lipolisaccaride (LPS)
Fornisce protezione osmotica (5-20 atm) entra in
gioco nella divisione non ha permeabilità selettiva
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RAPPRESENTAZIONE SCHEMATICA
DELLA PARETE CELLULARE
DEI GRAM POSITIVI E NEGATIVI
Gram positivi
Gram negativi
Peptidoglicano
Membrana
citoplasmatica
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Peptidoglicano
Membrana
Periplasma
Membrana esterna
Lipopolisaccaridi e
proteine
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PARETE CELLULARE DEI GRAM
POSITIVI
Proteina associata
alla parete
Acido teicoico
Acido
lipoteicoico
Peptidoglicano
Membrana
citoplasmatica
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BATTERIO GRAM NEGATIVO
Membrana esterna
Membrana
citoplasmatica
Peptidoglicano
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PARETE CELLULARE DEI
GRAM NEGATIVI
Polisaccaride O-specifico
Core polisaccaridico
Esterno
Porina
Lipide A
Lipopolisaccaride
(LPS)
Membrana
esterna
Lipoproteina
Periplasma
Membrana
citoplasmastica
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Peptidoglicano
Fosfolipide
Interno
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G. Antonelli, M. Clementi, G. Pozzi, G.M. Rossolini
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Enzimi attivi sulla parete
Lisozima, contenuto nella saliva, lacrime e
mucosa nasale,
Autolisine, contenute negli stessi batteri:
glicosidasi, amidasi e peptidasi
(enzimi che intervengono sulla sintesi di
parete).
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Membrana citoplasmatica
Costituita da fosfolipidi e proteine, non
contiene steroli (negli eucarioti) presenta
invaginazioni: i mesosomi importanti nella
formazione del setto vi è attaccato il DNA in
certe specie su altri mesosomi vi è un sistema
di trasporto attivo (fotosintesi, azoto)
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Doppio strato fosfolipidico della
Membrana Citoplasmatica batterica
Lipidi 40% (steroli assenti, fosfolipidi ++)
Acidi grassi
Regione
idrofila
Regione
idrofobica
H2O
Fosfato
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Glicerolo
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STRUTTURA DELLA
MEMBRANA
CITOPLASMATICA
Fosfolipidi
Esterno Gruppi
idrofilici
Gruppi
idrofobici
Interno
Proteine integrali
di membrana
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Molecola
fosfolipidica
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Membrana citoplasmatica
Funzioni
permeabilità selettiva e trasporto,
trasporto elettroni e fosforilasi ossidativa
escrezione enzimi idrolitici
contiene enzimi e proteine (carrier) deputate alla sintesi del
DNA, polimeri della parete, lipidi di membrana contiene
recettori e proteine necessarie alla chemiotassi
Il 50% della membrana si presenta in uno stato semifluido
dovuto alla grande attività per la crescita batterica
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FUNZIONI DELLA MEMBRANA CITOPLASMATICA
Barriera
di permeabilità
Sito di ancoraggio
Siti di molte proteine coinvolte nel trasporto, nelle
vie biosintetiche e nella chemiotassi
Produzione dell’energia
Mesosomi ?
Previene dispersioni e funziona come centro di transito
per il trasporto di nutrienti da e verso la cellula
Enzimi della catena respiratoria
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Forza motrice protonica: le reazioni biochimiche a livello di MC creano un eccesso
di H+ all’esterno (gradiente) che tendono a rientrare. Attraverso ATPasi la cellula
genera ATP.
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Lo spazio periplasmico
E’ compreso tra la membrana interna e quella
esterna, è riempito da un gel formato da
peptidoglicano idratato. Diffusi nel gel vi sono
inoltre proteine ed oligosaccaridi nonché proteine
leganti specifici substrati, enzimi come la fosfatasi
alcalina che reagendo con substrati li rendono
trasportabili all’interno. Molti di questi composti
intervengono nella regolazione della pressione
osmotica, per esempio, cellule che crescono in
ambiente ipotonico aumentano la sintesi di
oligosaccaridi.
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STRUTTURA DEL
LIPOPOLISACCARIDE DEI BATTERI
GRAM NEGATIVI
Polisaccaride O-specifico
Core polisaccaridico
Lipide “A”
Acidi grassi saturi
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Struttura
UNITA’ BASALE
N-acetilglucosamina (G)
Acido N-acetilmuramico (M)
Gruppo
N-acetile
Legami
peptidici
Legame sensibile
Al lisozima
L-alanina
Acido D-glutammico
Acido Meso
diaminopimelico
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D-alanina
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LEGAME TRA LE UNITA’ PEPTIDICHE E
GLICANICHE NELLA FORMAZIONE DELLO
STRATO DI PEPTIDOGLICANO
Scheletro
del glicano
Peptidi
Escherichia coli
(Gram negativo)
Staphylococcus aureus
(Gram
positivo)
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Sistemi di secrezione
(Gram-negativi)
Sono NOTI SEI (sette) SISTEMI di esportazione di molecole
effettrici nella membrana e citoplasma della cellula ospite della
quale modulano ed alterano le funzioni per favorire la propria
sopravvivenza e replicazione nei tessuti dell.ospite. L’energia
necessaria per il trasporto del substrato è fornita da ATP per
azione di ATPasi (tranne che nel sistema IV) situata nella
faccia interna della membrana citoplasmica. Alla
secrezione di molte proteine batteriche partecipano delle
chaperonine che legano il substrato, ne impediscono la
degradazione e ne orientano il passaggio attraverso i vari
sistemi
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Sistemi di secrezione
(Gram-negativi)
Tipo I: la proteina è direttamente liberata nell’ambiente attraverso
una porina
Tipo II: la proteina viene immessa nello spazio periplasmico quindi
un vettore la porta all’esterno
TipoIII: la proteina è introdotta nella cellula bersaglio direttamente
con un meccanismo tipo siringa
TipoIV: il prodotto è inserito in un altro microorganismo o cellula
mediante un ponte citoplasmatico (donatore e ricevente)
Tipo V: la proteina è portata all’esterno mediante se stessa
(autotrasporto)
Tipo VI: la proteina è direttamente iniettata nella cellula bersaglio
(eu-procariota) mediante meccanismo attivo (coda di fago)
Tipo VII: (MT) la proteina è immessa fuori dalla membrana interna
e portata all’esterno attraverso un meccanismo non ancora noto
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Fig. 4. Model for type VII secretion. Both Esx and PE/PPE proteins are exported as dimers
by the T7S secretion machinery. Substrate recognition occurs via a C-terminal secretion motif on one of the dimer subunits (indicated by a
red box). The cytosolic component EspG specifically recognizes PE/PPE proteins and possibly targets these substrates to the putative
membrane channel that consists of EccB, EccC, EccD and EccE. The three nucleotide binding domains of EccC are likely involved in
energizing translocation of substrates through this channel. In this model, T7S is a two-step process, in which the channel in the outer
membrane refers to a hypothetical, so far unidentified pore.
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Figure 1 | Schematic representation
of the different type-IV-dependent
mechanisms.
The three subfamilies of type IV
secretion (T4S) systems are shown.
Conjugation
machines deliver DNA to recipient
bacteria and other cell types by cellto-cell contact.
DNA-uptake and –release systems
exchange DNA with the extracellular
milieu independently of contact with
target cells.
Effector translocators deliver DNA or
protein substrates to eukaryotic
cells during infection. The effector
translocators contribute in markedly
different ways to the infection
processes of the bacterial pathogens
shown. PT, pertussis toxin
Eric Cascales and Peter J. Christie 2003 THE VERSATILE
BACTERIAL TYPE IV SECRETION SYSTEMS. Nature Rev
Microbiology 1:137-149
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Sistemi di secrezione
(Gram-positivi)
Le proteine elaborate nel citoplasma sono
trasferite a livello di membrana citoplasmatica
qui alcune proteine vettore (chaperone)
mediano il passaggio attraverso la parete
durante il quale la proteina si trasforma nella
versione funzionale con meccanismo non noto
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FUNZIONI DEL CROMOSOMA
Il cromosoma consiste di circa 3,8-4,5 milioni di basi
appaiate, esso è diviso funzionalmente in segmenti,
ciascuno dei quali determina una sequenza di
aminoacidi e quindi la struttura di una proteina.
Queste proteine, enzimi, componenti della
membrana ecc. costituiscono le proprietà del
microrganismo. Un segmento di DNA che determina
un prodotto funzionale è chiamato gene. Gli eventi
attraverso i quali una sequenza di nucleotidi di un
gene determina una proteina sono i seguenti:
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L’enzima RNApolimerasi, usando il DNA
come modello, forma una singola catena
poliribonucleotidica
chiamata
RNA
messaggero (mRNA). Questo processo è noto
come trascrizione. Questo mRNA ha una
sequenza nucleotidica che è complementare
con una delle catene della doppia elica di
DNA.
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Gli aminoacidi sono attivati enzimaticamente e
trasferiti ad una molecola particolare di RNA
chiamato RNA transfer (tRNA). Questi tRNA hanno
una struttura che presenta ad una estremità una
tripletta di basi sul mRNA, ed all’altra estremità
hanno legato l’aminoacido corrispondente. La
tripletta posta sul mRNA si chiama codon.
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mRNA ed il tRNA vanno insieme sulla
superficie del ribosoma. Il tRNA trova la
tripletta complementare sul mRNA. Il
ribosoma si muove sul mRNA e la sintesi
procede. Il processo è noto come traduzione.
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PLASMIDI
I plasmidi sono piccoli elementi di DNA circolare
che si replicano autonomamente (replicon, fattori R,
elementi genetici extracromosomici, geni aggiunti,
episomi, profagi non integrati). Codificano per
funzioni non indispensabili per la cellula, ma che
possono essere fondamentali in particolari ambienti.
Diffusione della resistenza agli antibiotici
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PLASMIDI
Elementi genetici extracromosomici DNA
circolare, doppia elica replicazione autonoma
( da 1.5 a 400 Kb
1-1,5 Kb = 1 gene
4500 Kb = cromosoma
1 Mdal = 1 milione dalt = 3 Kb
1ųm = 2 Mdal
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PLASMIDI
Classificazione
Fenotipo
Numero di copie
Peso molecolare
Frammenti di restrizione
Gruppo di compatibilità
Genetico e biochimico
Fattori R coniugativi e non
Amplificazione dei geni
Batteriocine
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ENDOSPORE
Diversi microorganismi (gram+), quando le
condizioni ambientali diventano sfavorevoli,
sono in grado di formare endospore (Bacillus,
Clostridium, Sporosarcina ecc.) che poi sono
liberate nell’ambiente.
La spora è una cellula in fase di riposo,
altamente resistente al calore, all’essiccamento,
e agenti chimici, quando le condizioni risultano
nuovamente favorevoli la spora germina e
produce una cellula vegetativa.
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Sporulazione
La sporulazione comporta la produzione di nuove
strutture, enzimi e metaboliti. Circa 200 geni strutturali
sono attivati durante il processo. Inizia con una
invaginazione della MC sino a racchiudere il nucleo. La
prespora si trova così racchiusa tra due membrane
capaci di sintetizzare parete nella parte compresa tra
loro. La prima struttura che appare si chiama corteccia,
con internamente la parete della spora, all’esterno delle
due membrane si costituisce la tunica sporale
(mantello), ed oltre la tunica l’esosporio. Tutto richiede
una gran quantità di calcio e sintesi di ac. dipicolinico.
All’interno ove è contenuto il nucleo (core), gli enzimi
vegetativi sono degradati e rimpiazzati da costituenti
della spora.
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
STADI DI FORMAZIONE
DELL’ENDOSPORA
Stadio 0
Cellula
vegetativa
Parete
Membrana
citoplasmatica
DNA
Stadio 1
7-10h
Stadio 7
Esosporio
Core
Spora libera
Stadio 6
Strati corticali
Stadio 2
Stadio 3
Spora in via di sviluppo
Membrana
esterna
della spora
Membrana
interna
della spora
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Stadio 5
Core
Nucleo
centrale
Stadio 4
Disidratazione
Esosporio
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Corteccia
iniziale
Dinamica delle Popolazioni
Batteriche
Proprietà
Core: contiene il nucleo, tutti i
componenti della sintesi proteica ed un
sistema per generare energia basato sulla
glicolisi. L’energia per la germinazione è
conservata in 3-fosfoglicerato piuttosto
che ATP. La resistenza è dovuta in parte
allo stato disidratato e alla presenza nel
core di dipicolinato di calcio (intermedio
nella sintesi della lisina)
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Proprietà
Parete della spora
E’ lo strato più interno di parete che
circonda la MI della spora, composta di
peptidoglicano (diventerà parete nella
cellula quando germinerà)
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Proprietà
Cortex
E’ lo strato più spesso dell’involucro
della spora, contiene peptidoglicano ma
con meno legami crociati di quello usuale.
Sensibile al lisozima, la sua autolisi è
importante durante la germinazione.
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Proprietà
Mantello
E’ composto da proteine di tipo
cheratinoso aventi molti legami disolfuro.
Impermeabile agli agenti chimici.
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Proprietà
Esosporio
Lipoproteina contenente alcuni
carboidrati.
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Fisiologia della spora
Nessun consumo di O2
Attività enzimatiche assenti
Assenza di sintesi macromolecolari
Resistenti agli UV e all’essiccazione
Termoresistenza:
stabilità
proteine
(particolare stabilizzazione della struttura
2aria e 3aria), Ca, acido dipicolinico → problema
sterilizzazione
Possono sopravvivere per decine di anni
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GERMINAZIONE
Avviene in tre stadi: attivazione, iniziazione e crescita.
Attivazione
Anche se posta in ambienti favorevoli la spora non
germina se non vi è danno al mantello: calore, abrasione,
acidità e composti contenenti gruppi sulfidrici liberi.
Iniziazione
Una volta attivata la spora, la germinazione avviene se
certi effettori sono legati (L-alanina, adenosina). Questo
mette in azione l’autolisina che degrada il cortex. E’
assunta acqua, è liberato il dipicolinato di calcio e sono
degradati gli altri costituenti della spora.
Crescita
Si osserva un rigonfiamento all’interno (core) e quindi
sintesi di nuova parete su quella già presente (parete della
spora) con successiva divisione cellulare.
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DIFFERENZE PRINCIPALI TRA
ENDOSPORA E CELLULA ORIGINARIA
Morfologia e dimensioni
Composizione
Resistenza agenti chimici e fisici
Attività metaboliche
Resistenza
80°C, 5-10 min
Batteri non
sporigeni
Sporigeni
C. botulinum
C. tetani
Clostridi
gangrena
gassosa
Inattivazione
Bollitura
330 min
90 min
30 min
Vapor acqueo
20 min, 121°C,
1 atmosfera
Calore secco
90 min, 170°C
