Nelle piante l`embrione deriva solo da uno zigote fecondato?

Nelle piante l’embrione deriva
solo da uno zigote fecondato?
La capacità delle piante di produrre embrioni non è limitata solo
allo sviluppo della cellula uovo fecondata.
Cellule somatiche sono in grado di sviluppare una pianta
completa passando attraverso stadi embrionali senza però
passare
attraverso
la
fusione
dei
gameti.
Questo processo è noto come
EMBRIOGENESI AVVENTIZIA O SOMATICA
L'embriogenesi somatica quindi è il processo per cui cellule
somatiche, e non, sviluppano interi organismi attraverso una serie
di stadi molto simili a quelli dello sviluppo dell'embrione zigotico
(fase globulare, a cuore, torpedo, cotiledonare).
In natura avviene naturalmente solo in pochissime specie, ed i
tessuti competenti sono sia tessuti implicati nella riproduzione,
ad es. le cellule della nucella (entro l’ovulo), le microspore, ma
anche cellule somatiche quali tessuti fogliari.
In Crassula multicava cellule dell’epidermide fogliare, dopo
che la foglia è stata staccata dalla pianta, riprendono a
dividersi
e
formano
embrioni
avventizi
che
successivamente
differenziano piante. (Esempio di
induzione di embrioni somatici mediante stress meccanico).
Le cellule della foglia in condizioni naturali non
differenzierebbero mai embrioni, però il distacco dalla
pianta (meccanicamente) riattiva alcune cellule epidermiche
alla divisione ed alla successiva organizzazione di embrioni.
Sebbene il controllo genico dello sviluppo degli embrioni zigotici
e somatici sia simile, i meccanismi che portano alla fase di
induzione embrionale è molto diversa nei due processi.
Le cellule somatiche acquisiscono competenza
embriogenica in seguito a trattamenti chimici
e/o stimoli meccanici.
L’organizzazione di embrioni somatici richiede una
riprogrammazione dell’espressione genica con l’attivazione e/o
spegnimento di una serie di geni per permettere ad alcune
cellule il passaggio dalla condizione vegetativa alla condizione
embrionale.
L’embriogenesi somatica può essere indotta sia direttamente, in
cellule appartenenti ad una struttura già differenziata (foglie,
stelo, radici, cotiledoni ecc.) sia indirettamente in calli allevati
su un mezzo agarizzato o in sospensioni cellulari.
L’embriogenesi somatica diretta avviene, in coltura in vitro, da
tessuti o cellule già determinate a produrre embrioni, prima del
prelievo dalla pianta madre. Questi espianti richiedono pochi
regolatori di crescita (ormoni) o solo condizioni ambientali
favorevoli alla ripresa delle divisioni cellulari e alla successiva
espressione della loro competenza, cioè produrre embrioni.
Diversamente, l’embriogenesi somatica indiretta richiede che ai
tessuti di partenza venga modificato il loro destino. Questo è
possibile inducendoli a proliferare inizialmente in masse cellulari
(callo) indifferenziate. Solo successivamente alcune cellule di
callo vengono indotte a dare origine ai PEM (masse proembriogeniche), è a trasformarsi in embrioni somatici.
Esempi di tessuti che producono embrioni somatici
direttamente: l’epidermide dell’ipocotile, e le cellule della
nucella.
Nell’embriogenesi indiretta, una singola cellula del callo
o, nella maggior parte dei casi, un aggregato di cellule
detto complesso pro-embrionale può originare uno o più
embrioni.
Ogni embrione che si sviluppa passa attraverso le stesse
fasi di sviluppo dell’embrione zigotico.
Dal Libro di testo: Elementi di
Biologia dello Sviluppo delle
Piante, ed. EdiSES
Differenze fra embriogenesi zigotica e somatica:
I due processi sono morfologicamente identici dallo stadio globulare
in poi.
Possono esserci piccole differenze perché gli embrioni somatici
presentano spesso il fenomeno della “fasciazione”, o un numero di
cotiledoni diverso rispetto a quello tipico della specie.
Però le prime fasi di sviluppo possono essere differenti nei due
processi, in particolare manca il sospensore nell’embrione
avventizio.
Nell’embriogenesi somatica è frequente il fenomeno della
formazione di embrioni a partire direttamente dall’epidermide di un
altro embrione somatico.
Si chiamano embrioni secondari.
In genere la produzione di embrioni secondari è associata al
fallimento dello sviluppo di quello primario
Importante è la composizione del mezzo di coltura per
indurre embriogenesi somatica.
In genere sono richiesti due tipi diversi di mezzi, uno per
l’induzione delle cellule embriogeniche ed un secondo
per il successivo sviluppo dell’embrione.
Il primo mezzo deve contenere auxina, il secondo ne deve
essere privo o ne deve contenere una concentrazione
notevolmente inferiore rispetto al primo
Se non intervengono eventi che inducano variazione
genetica nelle cellule che danno origine all’embrione
somatico, le piante ottenute da embrioni somatici
sono geneticamente identiche ai tessuti somatici di
partenza.
però
Eventi di variazione somaclonale sono frequenti nelle
colture in vitro.
Il rimodellamento della cromatina è un
prerequisito per lo stabilirsi della totipotenza
nelle cellule staminali durante l’embriogenesi
somatica
• Negli animali il rimodellamento della
cromatina è un importante strumento di
conversione staminale.
• Nelle piante la struttura della cromatina si
rimodella continuamente durante lo
sviluppo, ed il silenziamento genico
dipendente dalla cromatina è coinvolto nel
mantenimento dello stato differenziato.
• Le cellule staminali presentano uno
stato della cromatina più dinamico
delle cellule differenziate perchè
proteine strutturali della cromatina,
come gli istoni, sono scambiati più
rapidamente nelle cellule staminali che
nelle cellule differenziate e questo
favorisce rapidi cambiamenti nei
programmi di espressione genica.
La ristrutturazione della cromatina
svolge due ruoli principali nei primi stadi
dell’embriogenesi somatica
• Sia nell’embriogenesi diretta che nella
indiretta, l”unfolding” della cromatina
è richiesto per lo sdifferenziamento
delle cellule somatiche.
Perchè?
• E’ necessario per consentire
l’espressione di geni che sono stati
inattivati dalla eterocromatizzazione
che ha luogo durante il processo del
differenziamento.
Il rimodellamento della cromatina è anche
necessario alla fine del processo
embriogenico
Perchè?
Per reprimere i geni specifici
dell’embriogenesi, riattivando il
differenziamento, almeno in specifici
distretti cellulari dell’embrione somatico.
Altri meccanismi epigenetici
• L’ipermetilazione del DNA, per esempio
causato dall’auxina esogena (l’ormone
induttore), causa la formazione di
cellule somatiche embriogeniche
Chi la media???
• La metilazione del DNA è mediata da
almeno tre classi di metiltransferasi. La
METHYLTRANSFERASE1 (MET1) è una
delle tre. Embrioni met1 (somatici e
zigotici) si sviluppano in modo
improprio.
Sembra che un’azione concertata di metilazione
del DNA e demetilazione degli istoni sia essenziale
all’induzione di embrioni somatici
• Durante lo sviluppo del seme,
Arabidopsis MET1 interagisce con
MEDEA, uno dei componenti del
complesso FERTILIZATION
INDEPENDENT SEED (FIS) -PRC2,
dimostrando che un’azione concertata
dei programmi epigenetici di
metilazione del DNA e metilazione degli
istoni regola le variazioni dei
cambiamenti di sviluppo
Altre modificazioni...
• Le modificazioni della cromatina includono
l’acetilazione delle code istoniche per il
rilassamento del “packing” del DNA, al fine
di facilitarne l’accesso da parte di molte
proteine regolatrici
• L’iperacetilazione degli istoni si associa ad
attiva espressione genica, mentre
l’ipoacetilazione si correla a repressione
genica.
L’attività di numerosi fattori di
trascrizione è coinvolta nella
riprogrammazione della
totipotenza necessaria
all’embriogenesi somatica
• E questo è in accordo con quanto ha luogo
nelle cellule somatiche umane ove una
specifica combinazione di FT riprogramma le
cellule differenziate in cellule staminali.
• La lista dei FT che influenzano l’induzione
dell’embriogenesi somatica include
WUSCHEL (WUS), geni WUSCHELrelated homeobox (WOX), AGAMOUSLIKE15 (AGL15), LEAFY COTYLEDON
(LEC), e geni MYB come
EMBRYOMAKER .
AGL15
• In Arabidopsis e riso, le proteine a dominio
MADS, come AGL15, svolgono ruoli
importanti in vari eventi dello sviluppo,
come tempo di fioritura, organogenesi del
fiore e del frutto e sviluppo del seme.
• AGL15 accentua l’embriogenesi somatica
riducendo i livelli dell’acido gibberellico
(GA) attraverso l’induzione di una GA2ossidasi che inattiva GA, inoltre è un
componente del complesso SOMATIC
EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE
KINASE 1 (SERK1)
WUSCHEL
• Durante l’embriogenesi zigotica in Arabidopsis
WUS si esprime prima dello stabilirsi della
nicchia staminale nell’apice caulinare.
• Nella stessa pianta la sovraespressione di WUS
causa aumento dell’embriogenesi somatica
senza alcun fitormone esterno, suggerendo che
questo FT sia coinvolto nel processo di
embriogenesi somatica promuovendo la
transizione vegetativo-embriogenica. Inoltre,
l’induzione di WUS ha luogo prima di quella di
CLV3, marcando i gruppetti cellulari iniziali
dell’embriogenesi.
WOX
• I geni WOX svolgono ruoli importanti nel
coordinare la trascrizione nelle prime fasi
dell’embriogenesi somatica in Vitis vinifera.
VvWOX2 e VvWOX9 sono quelli più espressi,
vengono definiti geni di identità embrionale.
• Nell’embriogenesi somatica di Arabidopsis
WOX5 and WUS si esprimono prima dei geni di
identità embrionale, ad es. di WOX2
LEC e LEC-like
• LEC1 codifica una proteina simile ad una
subunità di Heme-Activated Proteins 3 (HAP3).
LEC1-LIKE (LIL) è anche richiesto per lo
sviluppo dell’embrione somatico in numerose
piante, es.cacao. I geni LEC-like sembrano
importanti per coordinare eventi primari che
portano alla competenza embriogenica. LEC2
and FUS3 presentano un motivo di legame al
DNA (B3) unico degli FT delle piante.
• La formazione di embrioni somatici
da parte dell’auxina richiede la funzione dei
geni LEC
L’auxina:livelli, trasporto e
biosintesi
• Gradienti di auxina attivano nel callo
embriogenico il trasportatore polare di
auxina PIN1, e la soppressione di WUS e
PIN1 mostra che entrambi i geni sono
necessari all’induzione dell’embriogenesi
somatica.
• …e LEC???
• I carrier di efflusso dell’auxina PIN1 e
PIN2, i geni della biosintesi dell’auxina
YUCCA2 (YUC2) e YUCCA4 (YUC4) ed I
fattori di risposta all’auxina ARF5, ARF8,
ed ARF10, e SERK1 sono controllati da
LEC2
• L’auxina endogena promuove la rottura di alcune
proteine auxin/IAA (AUX/IAA) (repressori), che, quando
attivi, bloccano i Fattori di Risposta all’Auxina (ARF)
formando dimeri inattivi. L’inattivazione delle AUX/IAA
consente agli ARF di legare gli elementi di risposta
all’auxina presenti sui geni di risposta all’ormone,
provocandone l’attivazione.
• Tuttavia gli stessi AUX/IAA sono rapidamente indotti dall’
auxina, che così restaura la repressione degli ARF,
perchè?
Per ridare equilibrio al sistema
MONOPTEROS
• MP (ARF5) è un gene chiave
dell’embriogenesi zigotica ove influenza il
trasporto polare dell’auxina attraverso
l’attivazione di PIN1.
• Gli embrioni somatici non si formano
quando il trasporto auxinico è inibito e MP
represso.
• Il 2,4-D può agire direttamente come
auxina, oppure può modificare il
metabolismo intracellulare dell’IAA e/o
agire come induttore di stress attivando
geni di risposta allo stress (es. ROS).
Etilene????
• I ruoli dell’etilene nell’induzione
dell’embriogenesi somatica non sono ben
conosciuti, perchè sono stati ottenuti sia
risultati di promozione che di inibizione in
specie diverse e diversi sistemi di coltura
in vitro.
Acido gibberellico
• In Arabidopsis, i livelli endogeni di GA si
correlano negativamente con il potenziale
embriogenico.
• In supporto del ruolo inibitorio, geni
importanti per la regolazione negativa
delle risposte-GA sono sovraespressi,
come i geni DELLA
ABA
• Nella carota l’applicazione di ABA alle
plantule induce embriogenesi somatica ed
anche causa embriogenesi secondaria.
• L’ABA è indotto dallo stress ed induce i
geni Late-Embryogenesis Abundant (LEA)
nell’embriogenesi zigotica.
• In Arabidopsis, AtECP31 e AtECP63 sono
gli omologhi dei geni LEA della carota, e
sono indotti dall’ ABA durante
l’embriogenesi somatica, ed egualmente
l’espressione del gene ABI3 è coinvolta
AGL15 ha ruoli multipli, controlla anche
ABI3, è anche capace di reprimere la sua
stessa espressione e di attivare LEC2.
•Le somatic-receptor-kinases sono
coinvolte nel network di regolazione per
l’induzione di cellule staminali e per il
loro mantenimento nell’embriogenesi
somatica
I geni SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE
KINASE
(SERK)
sono
infatti
coinvolti
nell’embriogenesi
somatica
in
numerose
monocotiledoni (es. Dactylis glomerata, riso,
Triticum aestivum, noce di cocco, banana, mais) e
dicotiledoni (es. A.thaliana, Medicago truncatula,
Ocotea catharinensis, Citrus unshiu, Vitis vinifera,
patata).
EMBRIOGENESI SOMATICA
Generazione di embrioni da cellule diverse dallo zigote
Per APOMISSIA:
• da cellule uovo non fecondate
• da cellule dei tessuti materni
dell’ovulo
Per TOTIPOTENZA in vitro: di
alcune cellule vegetali:
Da colture embriogeniche per esempio da espianti
di radici di Daucus carota,
Da espianti di ipocotile trattati con auxina
sintetica (2,4 D) o da giovani foglie
IN NATURA l’embriogenesi può avvenire anche da tessuti
somatici :Viviparia
PIANTA DELLA MATERNITA’
APOMISSIA
da cellule vegetative
Kalanchoe daingremontiana
EMBRIOGENESI SOMATICA
L’embriogenesi somatica è il processo attraverso il quale cellule
somatiche, in opportune condizioni colturali induttive, passando
attraverso una serie di cambiamenti morfologici e biochimici, danno
origine ad un embrione, del tutto simile ad un embrione zigotico, senza
che avvenga la fusione dei gameti (fecondazione).
Le cellule somatiche più idonee per indurre l’embriogenesi somatica
sono le cellule meristematiche, i tessuti che costituiscono gli embrioni
zigotici e tessuti giovani anche se differenziati. In numerose specie tale
processo è stato osservato avvenire spontaneamente sia da tessuti
riproduttivi (nucella e cellule sinergidi) che da tessuti somatici (foglia).
Con un processo molto simile a quello proprio degli embrioni zigotici, gli
embrioni somatici possono svilupparsi, formando plantule che, dopo un
periodo di crescita in vitro, possono essere ambientate e trasferite in
serra o in pieno campo.
EMBRIOGENESI ZIGOTICA A CONFRONTO CON LA SOMATICA
EMBRIOGENESI SOMATICA DIRETTA ED INDIRETTA
L’embriogenesi somatica può avvenire per via diretta o
indiretta.
Nella diretta l’embrione deriva direttamente da alcune cellule
dell’espianto, senza passare attraverso la formazione di un callo.
Le cellule proembriogeniche sono già determinate e richiedono
solo regolatori di crescita e condizioni favorevoli per la crescita
cellulare e l’espressione dell’embriogenesi.
Nella indiretta è richiesta proliferazione di callo e
rideterminazione di cellule già differenziate in uno stato
embriogenico. In questo caso i regolatori di crescita sono necessari
non solo per la ripresa delle divisioni mitotiche ma anche per la
determinazione dello stato embriogenico
PIANTA
ESPIANTI
FOGLIARI
•Prelievo degli espianti
•Sterilizzazione
ESPIANTI
CAULINARI
•Inoculo in mezzo callogenico
CALLO
Callogenesi
Callogenesi
Embriogenesi da callo
Gruppi di cellule meristematiche
nella massa del callo. Iniziali
dell’embrione
Rigenerazione di pianta di peperone attraverso embriogenesi
somatica indiretta
Callo
Pianta sviluppata
Embione somatico
Plantula
Analisi molecolare dell’embriogenesi
Sono stati identificati geni inducibili dagli ormoni come i geni PIN. PIN1 che codifica per un
trasportatore dell’auxina, è il primo espresso in cellule proembriogeniche. Un altro gene
associato alla competenza embriogenica delle cellule e marcatore precoce del processo è
SERK, isolato in singole cellule (competenti a formare embrioni somatici) in una
sospensione cellulare di Daucus e Dactylis. Si ipotizza che le proteine SERK possano agire
come recettori transmembrana per segnali nel mezzo di coltura e per innescare
l’embriogenesi. Studi di trascrittomica hanno identificato alcuni geni per fattori di
trascrizione coinvolti nell’embriogenesi somatica, come i membri della famiglia AP2/ERF
(APETALA”/Ethylene-responsive factor) codificati da BBM. BBM è un fattore di
trascrizione espresso nell’embrione che gioca un ruolo chiave nell’induzione e
mantenimento dello sviluppo dell’embrione nella pianta. Over-espressione ectopica
(espressione di un gene con una differente localizzazione da quella normale) di BBM, in
Arabidopsis e Brassica napus, induce lo sviluppo spontaneo, indipendentemente dall’auxina,
di embrioni somatici in tessuti vegetativi.
I geni SERK sono regolati dall’
auxina in alcune specie, e dall’
auxina e dalla citochinina in
altre
Cyclamen persicum Mill. è una delle più
importanti specie ornamentali invernali (in
Europa la produzione annuale si aggira intorno
ai 140 milioni di piante).
Il solo modo commerciale di propagare il
ciclamino è attraverso semi ibridi.
L’embriogenesi
somatica
in
Cyclamen
persicum è un efficiente metodo per ottenere
linee con eccellenti caratteri.
Il ruolo dei geni SERK
nell’embriogenesi somatica del
ciclamino è stata descritta,
Two SERK genes are markers of
pluripotency in Cyclamen
persicum Mill.
Savona M, Mattioli R, Nigro
S, Falasca G, Della Rovere
F, Costantino P, De Vries S, Ruffoni
B, Trovato M, Altamura MM.
J Exp Bot. 2012;63(1):471-88.
PEA, aggregato preembriogenico
Sequenza istologica della
formazione di embrioni somatici
(A-I) sul mezzo induttivo
Sviluppo
degli
embrioni
sul mezzo
induttivo
(K-M)
J Exp Bot. 2012;63(1):471-88.
CpSERK2
CpSERK1
CpSERK2
Analisi dei profili di espressione dei
geni CpSERK1 e CpSERK2 mediante
“RNA in situ hybridization” durante
l’embriogenesi somatica in C.
persicum
CpSERK1
CpSERK2
CpSERK1
“RNA in situ hybridizations” usando
sonde senso di CpSERK1 e CpSERK2
(controlli)
CpSERK2
J Exp
Bot. 2012;63(1):471-88.
Risultati in
pianta
CpSERK1
CpSERK1 e CpSERK2 si esprimono nel ricettacolo,
negli ovuli, nella nucella, nell’embriosacco, e,
dopo la fecondazione, nell’embrione zigotico fino
allo stadio di torpedine. L’espressione rimane nel
procambio e nei poli radicale e caulinare
dell’embrione allo stadio cotiledonare
“RNA in situ hybridizations” con
sonde senso di CpSERK1 e
CpSERK2 (controlli)
CpSERK2
CpSERK1
CpSERK2
J Exp
Bot. 2012;
63(1):47188.
CpSERK2
L’embriogenesi somatica come
risposta allo stress
• L’embriogenesi somatica può essere
considerata una risposta adattativa allo
stress, perchè vari stress la inducono. Per
esempio, in carota è stimolata
dall’applicazione di sali di metalli pesanti
(Cd 2+ , Ni 2+, Cu 2+ , Co 2+), alta
pressione osmotica, alte temperature, tutto
in assenza di fitormoni esogeni.
Anche il 2,4-D può funzionare
come agente di stress per
l’espianto
• Durante l’embriogenesi della patata
indotta da 2,4-D si osserva sovraregolazione di geni dello stress
ossidativo e della difesa.
Quindi
• L’embriogenesi somatica è accentuata da
livelli aumentati di ROS, ad esempio nel
grano, e l’applicazione di antiossidanti al
mezzo induttivo riduce l’embriogenesi
somatica in Eucalyptus globulus
I ROS sono in relazione con l’ABA
e con il Boro
• L’ABA incrementa i livelli di ROS negli embrioni
di mais
• Anche il micronutriente Boro mette in moto i
pathway mediati dallo stress durante
l’embriogenesi somatica con un diretto impatto
sui livelli di ABA, che aumentano, come
osservato nell’embriogenesi somatica di carota.
Lo stress ed i ROS stimolano l’induzione di
embriogenesi somatica, ma poi devono essere
detossificati, ad es. dalle proteine DELLA
L’ossido nitrico
• L’ossido nitrico è un fattore critico per lo sviluppo
e le risposte allo stress nelle piante, ed è uno
“stressor” per l’induzione dell’embriogenesi
somatica, forse influenzando la disponibilità di
ioni Ca 2+ entro le cellule attraverso l’attività di
proteine-chinasi.
• In alternativa, potrebbe incrementarla
aumentando la produzione di auxina attraverso
la repressione del gene MYC2, che è un
repressore di biosintesi dell’auxina, come
dimostrato nell’embriogenesi somatica di
Arabidopsis.
• La morte cellulare programmata è
essenziale all’embriogenesi somatica
• Le cellule del sospensore (quando c’è)
muoiono per PCD come nell’embriogenesi
zigotica.
• Abies alba dimostra che la PCD deve però
avvenire anche prima, e quest’ondata di
PCD è specifica dell’embriogenesi
somatica ed essenziale per il suo
successo. Dove avviene?
• Nei PEM
Perchè?
• Dal PEM non possono partire troppi
embrioni, perchè se no nessuno arriverà a
compimento!
• Esperimenti con linee cellulari composte di
PEM deficienti nel programma di PCD lo
dimostrano, infatti queste linee sono
incapaci di formare embrioni,
indipendentemente dal trattamento.
Lo zinco
• Lo Zinco è un potente regolatore di PCD negli
animali, ed è cruciale per la formazione regolare
dell’embrione somatico, come dimostrato nelle
conifere.
• ..ma attenzione ai suoi ruoli:
• L’esposizione dei giovani embrioni ad agenti
chelanti lo zinco conduce alla morte
dell’embrione, e l’aggiunta di zinco esogeno
sopprime il differenziamento terminale del
sospensore e la sua eliminazione, causando
l’inibizione della maturazione dell’embrione.
Possibili utilizzi dell’embriogenesi somatica:
-trasformazione genetica, per ottenere piante con geni
desiderati (particolarmente utili per le trasformazioni con
Agrobatterio)
- propagazione massiccia e piuttosto veloce di piante il cui ciclo
biologico naturale è molto lungo.
- Applicazione biotecnologica : SEMI SINTETICI
-Conservazione della biodiversità (banche del seme)
Gli embrioni somatici allo stadio di torpedo possono
essere conservati per moltissimi anni.
Necessitano però di trattamenti particolari.
Gli embrioni, a questo stadio, vengono inglobati in sostanze
sintetiche, ad es. l’alginato di sodio. Questo serve per nutrire
l’embrione e contemporaneamente a proteggerlo dalla
disidratazione e dai danneggiamenti fisici e meccanici.
Embrioni così incapsulati sono detti
SEMI ARTIFICIALI O SINTETICI
All’alginato spesso vengono aggiunti altri composti (olio di silicone ed altri) in
grado di assorbire ossigeno.
L’incapsulamento, quindi deve fornire una protezione fisica e può contenere delle
sostanze nutritive, dei regolatori di crescita, degli antibiotici e dei fungicidi, tutti in
grado di portare alla formazione della pianticella in campo. Non si è ancora
verificato un utilizzo diffuso dei semi sintetici.
SEMI SINTETICI
Embrioni inclusi in pallini di alginato di calcio
Il rivestimento, “endosperma artificiale”, di un seme sintetico
deve essere preparato in relazione alle caratteristiche della specie
e delle potenzialità di germinazione.
L’unità di propagazione formata dall’embrione somatico più
l’involucro, seme sintetico, può anche essere “criopreservato” per
lunghi periodi in azoto liquido o conservato in condizioni di
sviluppo rallentato a temperature comprese tra 7 °C e 10 °C.
Questa potenzialità rappresenta una strategia per la
conservazione del germoplasma in programmi di protezione della
biodiversità.
La produzione di semi sintetici è un obiettivo biotecnologico per
una specie di rilevanza dal punto di vista economico come
potrebbero essere le piante agronomicamente importanti o quelle
ornamentali.
E’ possibile un’applicazione
biotecnologica dei geni SERK?
• Possono essere idonei per un rapido
screening di calli potenzialmente
embriogenici per ridurre i costi della
produzione di semi utilizzando la
tecnologia di produzione di semi
artificiali
Un’altra via per l’embriogenesi
Le Angiosperme producono una grande quantità
di granuli pollinici all’interno delle antere. Il
granulo di polline è composto da un massimo di
3 cellule.
Ogni granulo pollinico, essendo un prodotto della
meiosi ha cellule apliodi. Ha origine dalla
microspora, mononucleata
La meiosi può essere sfruttata per aumentare la biodiversità.
Come?
Le microspore ed i granuli pollinici immaturi possono essere spinti a
dividersi in colture in vitro per formare embrioni.
Questi embrioni sono APLOIDI e possono dare origine a piante
APLOIDI.
Questi embrioni sono detti EMBRIONI ANDROGENICI.
Come conseguenza della meiosi, ogni microspora è unica dal punto
di vista genetico, quindi ogni embrione androgenico (prodotto da
una sola microspora o granulo pollinico) è diverso da tutti gli altri.
Si pensi alla enorme variabilità che si può ottenere con gli embrioni
androgenici.
Gli embrioni androgenici sono aploidi ed hanno solo il set
cromosomico paterno.
L’androgenesi può essere diretta o indiretta. L’indiretta prevede
la formazione di callo prima di iniziare il differenziamento
dell’embrione. Es. di androgenesi indiretta si ha nelle colture di
antere dei cereali.
Gli embrioni androgenici vengono rilasciati dall’esina (parete
del granulo pollinico) allo stadio globulare.
Nell’androgenesi lo stadio di microspora uninucleata rappresenta
un punto di partenza ideale per la produzione degli embrioni
androgenici.
La microspora viene deviata dalla via gametofitica verso quella
“sporofitica”.
Come è possibile che durante una coltura di microspore o granuli
pollinici immaturi avvenga una deviazione dal normale sviluppo
gametofitico per cui le microspore sono destinate?
In pianta la prima mitosi della microspora è asimmetrica e porta
alla formazione di una grossa cellula vegetativa con un nucleo
diffuso ed una piccola cellula con un nucleo denso, che si divide
successivamente per formare i due nuclei spermatici.
Durante l’androgenesi la prima mitosi è simmetrica e dà origine a
due nuclei piccoli e simili. Da questi prenderà origine l’embrione
androgenico.
Così una divisione mitotica simmetrica, al posto di una
asimmetrica è alla base del cambiamento del destino della
microspora.
NORMALE SVILUPPO GAMETOFITICO
Granuli di polline maturo
I2KI
È evidente un citoplasma
molto denso con un alto
contenuto in amido
La cellula generativa
mostra una forma
allungata con cromatina
altamente condensata
Formazione di embrioni aploidi a partire da una coltura di
polline di tabacco.
A
Il processo androgenico prevede tre fasi fondamentali:
• FASE 1 acquisizione della potenzialità embriogenetica da parte
della microspora mediante un fattore di stress: quindi da una parte
repressione del normale sviluppo del gametofito maschile, dall’altra
indirizzamento verso una via embriogenetica.
• FASE 2 divisione cellulare della microspora che conduce ad uno
stato multicellulare
FASE 3 passaggio dalla struttura multicellulare (definita embryolike structure) ad un embrione vero e proprio
Per indurre la microspora all’androgenesi bisogna agire con
uno stress che induce la microspora a cambiare il suo
programma di sviluppo e formare due cellule uguali che daranno
l’avvio dell’embriogenesi aploide. Nell’orzo è stato utilizzato uno
stress osmotico, attraverso incubazione delle antere con
mannitolo. Ma recenti esperimenti hanno dimostrato che si può
ricorrere anche a stress con calcio e acido abscissico; per il
frumento è stato utilizzato uno stress da calore. E’ stato
osservato che quando c’è meno contatto tra le microspore e
quando viene distrutta la loro organizzazione ordinata nello
spazio c’è più possibilità di deviare il loro sviluppo verso una via
androgenica.
E’ sufficiente un trattamento di calore (32°c) durante le
prime 8 ore di coltura delle microspore per indurre
l’androgenesi. Per il tabacco è stato utilizzato come stress la
privazione di alcuni nutrienti come la glutammina e lo zucchero e
poi trasferimento in un terreno con elevato glucosio. Ma altri
stress abiotici possono essere utilizzati come uso di colchicina,
mancanza di azoto, auxina, bassa temperatura e radiazioni
gamma in associazione a calore.
Il fenotipo delle piante aploidi è dato dall’espressione dell’unica
copia di geni che contengono.
Le piante aploidi sono particolarmente indicate per i programmi di
selezione di specie aventi caratteri desiderati.
Nell’individuo aploide, essendo presente un solo allele per
carattere, ogni mutazione indotta diviene manifesta.
La generazione di piante aploidi è stata realizzata per un gran
numero di specie vegetali (oltre il centinaio tra cui, tabacco, orzo,
vite, banano, patata, riso, granturco, frumento).
Limite delle piante Aploidi:
Sono Sterili.
Tuttavia è possibile renderle fertili raddoppiando il loro contenuto
cromosomico.
Si ottengono così piante diploidi fertili
diploidi omozigoti).
(piante DH, individui
COME SI FA?
Somministrando colchicina che induce un raddoppiamento
cromosomico o direttamente alla pianta aploide o
all’embrione androgenico; oppure coltivando gli espianti della
pianta aploide in vitro (endoreduplicazine spontanea, fusione
nucleare).
Al momento le linee DH (double haploids) sono i più avanzati
sistemi per selezionare linee resistenti a virus o batteri.
Gli embrioni androgenici aumentano la biodiversità.
Gli embrioni androgenici possono essere facilmente trasformati.
Anche le microspore di partenza si trasformano facilmente.
L’importate conseguenza che le piante ottenute da microspore
transgeniche sono omozigoti per il transgene, anche dopo il
raddoppiamento cromosomico, ha fatto di questi individui un
ottimo modello da utilizzare per manipolazioni genetiche.
Oltre all’androgenesi esiste anche la ginogenesi. In quest’ultimo
caso gli embrioni avventizi si sviluppano da tessuti del
gametofito femminile (Apomissia)
Tuttavia, l’androgenesi sperimentale è un sistema più efficiente
della ginogenesi, in contrasto a ciò che avviene in natura. Infatti
in diverse specie frequentemente si osservano casi di formazione
di embrioni a partire da tessuti del macrogametofito, mentre sono
molto scarsi i casi di androgenesi naturale.
CRIOCONSERVAZIONE
TECNICA DELLA CRIOCONSERVAZIONE
Consiste nello STOCCAGGIO DI GERMOPLASMA A
TEMPERATURA ULTRA-BASSA (–196 °C), propria dell’azoto
in fase liquida
Possibili origini di embrioni nelle piante
Granulo di polline
(n)
DH
Embrione
F zigotico
M
Embrio sacco
(n)
Sporofito
(2n)
Androgenesi
Embrio sacco
Ginogenesi
Apomissia materna
Embriogenesi
somatica
DH
Domande:
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Cos’è l’embriogenesi somatica?
A cosa serve?
Quali sono i principali geni implicati?
Lo stress ha un ruolo? E la PCD?
Cos’è l’androgenesi?
A cosa serve?
Qual è il motivo per cui l’embriogenesi somatica
avviene?
• Che tipo di divisione cellulare è alla base
dell’androgenesi?
• Cosa sono i semi sintetici?