Biol. Mar. Medit. (2006), 13 (1): 500-503
C. Fabbro, E. Crevatin, P. Del Negro
OGS Dipartimento di Oceanografia Biologica, Via Auguste Piccard, 54 - 34010 Trieste, Italia.
[email protected]
MOLLUSCHICOLTURA IN ACQUE COSTIERE
E SVILUPPO DI VIBRIO SP.
MUSSEL FARM IN COASTAL SEAWATERS
AND VIBRIO SP. DEVELOPMENT
Abstract
The aim of this work was to study the role of mussel farms on bacteria community and in particular on
the Vibrio sp. development. Marine bacteria and Vibrio abundances were detected from two stations in the
Gulf of Trieste for one year. 200 Vibrio strains isolated from TCBS plates were submitted to biochemical
characterization. Some suspected V. parahaemolyticus were submitted to genetic caracterization.
Key-words: Vibrio parahaemolyticus, marine environment, identification, PCR, tox R.
Introduzione
I microrganismi appartenenti al genere Vibrio comprendono batteri Gram
negativi, anaerobi facoltativi, ampiamente distribuiti nell’ambiente acquatico e
colonizzatori del tratto digerente di molluschi e pesci. I Vibrio sono stati indicati
dall’OMS quali temibili agenti eziologici di gastroenteriti acute, setticemie e infezioni sistemiche (Vibrio vulnificus) e infezioni alla pelle (Vibrio parahaemolyticus)
(Daniels et al., 2000; West, 1989; De Paola et al., 2003).
I Vibrio sono autoctoni delle coste marine tropicali e temperate ma sono stati
isolati anche da acque reflue e acque estuariali (Rapporti ISTISAN, 2003). Dati
recenti sulla qualità delle acque costiere italiane evidenziano una crescente frequenza nell’isolamento di batteri appartenenti al genere Vibrio (Dionisi et al.,
2003). L’emergente problematica igienico-sanitaria, rappresentata soprattutto dalle
specie autoctone V. parahaemolyticus e V. vulnificus, riguarda sia la gestione delle
zone di balneazione e di acquacoltura, che il commercio dei prodotti ittici (Rapporti ISTISAN, 2003).
Al fine di valutare il ruolo svolto da una mitilicoltura sullo sviluppo della
comunità batterica ed in particolare delle Vibrionaceae, è stata condotta una
ricerca in due stazioni del Golfo di Trieste: la stazione C1, situata a circa 200 m
dalla costa (profondità 15 m), all’interno della riserva Marina di Miramare, e la
stazione D2, posizionata a circa 1200 m dalla costa (profondità 9 m), all’interno
di un allevamento long-line di molluschi della specie Mytilus galloprovincialis,
nella Baia di Panzano.
Materiali e metodi
Da gennaio a dicembre 2003 sono stati raccolti mensilmente i principali parametri
chimico-fisici, mediante l’utilizzo di una sonda multiparametrica, e, con un sistema
di campionamento intelligente “Mini-rosetta” (1016 GENERAL OCEANIC)
equipaggiato con bottiglie Niskin da 5 l, sono stati prelevati campioni d’acqua in
Molluschicoltura in acque costiere e sviluppo di Vibrio sp.
501
superficie e sul fondo per valutare l’abbondanza batterica sia mediante conteggio diretto in microscopia ad epifluorescenza (Porter e Feig, 1980), sia mediante
conteggio delle UFC su terreno ZoBell (ZoBell, 1934). L’abbondanza dei batteri presumibilmente appartenenti al genere Vibrio è stata determinata per mezzo
di conteggi diretti su TCBS agar utilizzando il metodo FDA-BAM (FDA-BAM,
1995) adattato alla matrice acquosa.
Ogni mese dalle colture in TCBS agar sono state prelevate circa 15 colonie
sospette e subcoltivate su TSA 3%NaCl, per verificarne la purezza; i ceppi isolati
sono stati sottoposti a caratterizzazione fenotipica per verificarne l’effettiva appartenenza alle Vibrionaceae (FDA-BAM, 1995). È stato così possibile selezionare
circa 200 ceppi che mostravano risposte coerenti con quelle del genere Vibrio.
Successivamente tali ceppi sono stati sottoposti ad identificazione biochimica
utilizzando i due sistemi standardizzati API E e API NE (bioMérieux®sa).
Su alcuni ceppi identificati come V. parahaemolyticus è stata effettuata la caratterizzazione molecolare attraverso l’identificazione del gene ToxR specifico per V.
parahaemolyticus; a tal fine è stata utilizzata la stessa coppia di primers di base
tox R-F: 5’GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3’ e tox R-R: 5’-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3’ (Kim et al., 1999).
Risultati
Raggruppando i valori delle abbondanze batteriche rilevati nel corso dell’anno
(Fig. 1), si osserva una distribuzione più o meno simile nelle due stazioni considerate, con il valore mediano più elevato nella stazione D2 sia in superficie che
al fondo.
Anche
la frazione
del popolamento
è più
abbondante
Fig.1
- Box-plotscoltivabile
relativi alle abbondanze
batteriche batterico
(109 cell/l) nelle
stazioni
C1 e D2. nella
9
stazione D2, soprattutto
in superficie
(Fig.
Box-plots of bacterial
abundances
(102).
cell/l) in C1 and D2 stations.
Legenda:
massimo
III quartile
┬
mediana
I quartile
minimo
┴
Fig. 1 - Box-plots relativi alle abbondanze batteriche (109 cell/l) nelle stazioni C1 e D2.
Box-plots of bacterial abundances (109 cell/l) in C1 and D2 stations.
Fig.1 - Box-plots relativi alle abbondanze batteriche (109 cell/l) nelle sta
Box-plots of bacterial abundances (109 cell/l) in C1 and D2 statio
La stazione D2 si caratterizza anche per la maggior abbondanza dei batteri
presumibilmente appartenenti al genere Vibrio (Fig. 3) che raggiungono, sia in
Legenda:
superficie che al fondo, valori
superiori anche di 20 volte rispetto a quelli osservati in C1.
massimo
I presunti Vibrio sono stati
identificati per via biochimica con i sistemi API
III quartile
20E e/o da API 20NE e sulla
base del “sospetto fenotipico” 26 ceppi batterici,
┬
mediana
Fig.2-Box-plots relativi alle abbondanze (UFC/ml)dei batteri eterotrofi coltivabili nelle stazioni C1 e D2.
Box-plots of abundances
of heterotrophic coltivable bacteria (UFC/ml) in C1 and D2 stations.
I quartile
minimo
┴
mediana
Fig.1 - Box-plots relativi alle abbondanze batteriche (109 cell/l) nelle stazioni C1
I quartileBox-plots of bacterial abundances (109 cell/l) in C1 and D2 stations.
502
minimo
Legenda:
massimo
III quartile
┴
C. Fabbro, E. Crevatin, P. Del Negro
┬
mediana
I quartile
minimo
┴
Fig.2-Box-plots relativi alle abbondanze (UFC/ml)dei batteri eterotrofi coltivabili
Fig. 2 - Box-plots relativi alle abbondanze (UFC/ml) dei batteri eterotrofi coltivabili nelle staBox-plots of abundances of heterotrophic coltivable bacteria (UFC/ml) in C
zioni C1 e D2.
Box-plots of abundances of heterotrophic coltivable bacteria (UFC/ml) in C1 and D2 stations.
ascritti alla specie V. parahaemolyticus, (16 provenienti da D2 e 10 da C1), sono
stati sottoposti a caratterizzazione molecolare per verificare l’appartenenza alla
specie e di conseguenza l’affidabilità dei kit.
L’analisi molecolare ha confermato l’appartenenza alla specie V. parahaemolyticus di 13 dei Fig.2-Box-plots
16 ceppi provenienti
dalla
stazione (UFC/ml)dei
D2, mentre batteri
nessuno
dei coltivabil
relativi alle
abbondanze
eterotrofi
“sospetti” provenienti daBox-plots
C1 è risultato
positivo.
of abundances of heterotrophic coltivable bacteria (UFC/ml) in C
Fig.3-Box-plots relativi alle abbondanze (UFC/ml) dei presunti Vibrio nelle stazio
Box-plots of abundances of presumptive Vibrio (UFC/ml) in C1 and D2 stat
Fig.3-Box-plots
relativi
alle abbondanze
(UFC/ml)
presunti
Fig. 3 - Box-plots relativi
alle abbondanze
(UFC/ml)
dei presunti Vibrio
nelle dei
stazioni
C1 e Vibrio
D2. nelle stazi
Box-plots
of abundances
of presumptive
Vibrio
(UFC/ml)
Box-plots of abundances
of presumptive
Vibrio (UFC/ml)
in C1 and D2
stations.
in C1 and D2 sta
Conclusioni
L’abbondanza di presunti Vibrio è risultata più elevata nella stazione D2, localizzata all’interno di una mitilicoltura, inoltre nel medesimo sito è stata confer-
Molluschicoltura in acque costiere e sviluppo di Vibrio sp.
503
mata la presenza di V. parahaemolyticus utilizzando la caratterizzazione molecolare. Ciò lascia presumere una relazione tra la presenza delle mitilicolture e lo
sviluppo delle Vibrionaceae.
La caratterizzazione molecolare dei ceppi per mezzo della PCR ha messo in
luce inoltre la poca affidabilità dell’identificazione fenotipica, effettuata con i kit
API E e API NE, al momento considerati attendibili per una rapida identificazione delle Vibrionacee potenzialmente patogene. La discrepanza tra i risultati
delle due diverse caratterizzazioni effettuate ha messo in evidenza come per i ceppi
autoctoni di V. parahaemolyticus alcune risposte biochimiche (tra cui fermentazione di mannosio e arabinosio, decarbossilazione dell’ornitina) non siano univoche né determinanti. Ciò si ripercuote su diversi aspetti igienico-sanitari: non c’è
ancora la capacità di individuare rapidamente possibili Vibrio patogeni nell’ambiente e quindi di definire un metodo di monitoraggio nelle zone di balneazione
e di acquacoltura, ma è problematico anche l’aspetto riguardante il commercio di
prodotti ittici poiché esiste sia il rischio di una sovrastima della presenza di Vibrio
spp., che comporta il blocco dei prodotti in questione, sia quello di una mancata
determinazione di specie patogene.
Bibliografia
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Il presente studio è stato svolto nell’ambito del progetto “Sviluppo di criteri di valutazione del rischio
ambientale e sanitario associato a microorganismi patogeni in ambienti acquatici” promosso dal Ministero della Salute e dall’ISPESL e coordinato dalla dott.ssa M. Manganelli.
