Corso di Immunologia Molecolare
RECETTORE PER IFN-γ
Marco Barberis
Complesso Recettoriale IFNγ-R
Il complesso INFγ_R consiste di due parti:
due catene IFNγ-R1 da 90kDa che hanno la funzione di
ligand binding
due catene signal transducing IFNγ-R2 da 62 kDa
Le due catene sono legate ai rispettivi Jak (Jak1 e Jak2)
IFNγ-R1: struttura del gene
• è espresso in modo ubiquitario in tutte le cellule nucleate
• IFNγ-R1 è scarsamente inducibile, e il suo promotore è ricco in GC,
manca di TATA e CAAT boxes ma ha multipli siti di inizio di trascrizione.
•il gene ha di 7 esoni, i primi 5 codificano per il dominio extracellulare con
capacità di legame per IFNγ, esone 6 per il dominio transmembrana, e
l’ultimo esone codifica per il dominio intracellulare.
•A livello intracellulare sono stati identificati tre regioni:
-LPKS (266-269) Jak-binding-site
-LI (270-271) endocytosis/recycling domain
-YDKPH (440-444) Stat-1 binding site
•IFN γ -R1 è una molecola di 471 aminoacidi, viene N-glicosilato nel RE e
nel Golgi. La glicosilazione aumenta il PM da 52.5kDa a 90kDa.
Legame IFNγ e recettore
Dopo il legame dell’IFNγ con il recettore si hanno varie fasi:
2 catene IFNγ-R1 si associano, reclutando nel complesso due
catene IFNγ-R2.
IFNγ-R2 è ritenuto essere la parte limitante del complesso
legame dell’ IFNγ consente stretta associazione di IFNγ-R1 e R2
con le rispettive Janus chinasi (Jak1 e 2). I siti di legame per le
Jak sono nei domini intracellulari codificati dall’esone 7 dei geni di
entrambi i recettori.
Jak1 fosforila Tyr440 del dominio intracellulare di IFNγ-R1: la
fosforilazione crea un docking site per il dominio SH2 di Stat-1.
Entro 1 minuto dal legame con IFNγ Stat-1 è anche fosforilato nei
siti Y701 e S727 (probabilmente da Jak2).
Pathway di trasduzione: Jak-Stat
•Jak-Stat pathway è usato da oltre 50 diverse citochine, fattori di crescita e
ormoni
•Jak sono tirosine chinasi che sono auto-fosforilate (Jak1) o trans-fosforilata
(Jak2) dopo l’aggregazione del recettore con il ligando
La via di segnalazione che utilizza IFNγ-R richiede tre componenti :
-Jak1
-Jak2
-Stat1
si lega sulla pozione vicina alla membrana del dominio
intracellulare della catena IFNγR1
si associa con porzione intracellulare della catena IFNγR2
Stat = Signal transducers and activators of transcription.
Recettore per IFNγ– prima parte
Journal of Leukocyte B iolog y Volume 75, February 2004 163
Segnalazione
-1
•Due molecole Stat1 omodimerizzano formando il fattore
trascrizionale GAF (gamma activated factor).
•GAF (Stat1 omodimero) dissocia rapidamente dal complesso
IFNγ-R e trasloca nel nucleo.
•GAF induce geni target contenenti GAS elements (gamma
activating sequences) entro 15-30 minuti dal legame di IFNγ.
Segnalazione
-2
• L’endocitosi del complesso recettore-ligando e la successiva
dissociazione del complesso sono mediate da una specifica sequenza
isoleucina-leucina presente sulla catena IFNγ-R1.
• subito dopo l’esposizione della cellula all’IFNγ si ha la colocalizzazione di Stat1, IFNγ e IFNγ-R1 come unico complesso
nella membrana nucleare e successivamente si ha l’accumulo nel
nucleo; il complesso IFNγ-IFNγR sembre funzionare come
chaperone intracellulare e faciliti la traslocazione nucleare di Stat1.
• IFNγ-R1 defosforilato viene riciclato sulla superficie cellulare,
mentre la molecola di IFNγ è degradata
Recettore per IFNγ– seconda parte
Journal of Leukocyte B iolog y Volume 75, February 2004 163
Geni regolati IFNγ
-1
Schroder et al. Journal of Leukocyte Biology 2004, 74: 163-189
Geni regolati IFNγ
-2
Schroder et al. Journal of Leukocyte Biology 2004, 74: 163-189
Geni regolati IFNγ
-3
Schroder et al. Journal of Leukocyte Biology 2004, 74: 163-189
Geni regolati IFNγ
-4
Schroder et al. Journal of Leukocyte Biology 2004, 74: 163-189
Terminazione del segnale
L’inibizione del pathway Jak-Stat avviene entro 1 ora dal legame dell’IFNγ ed
avviene con meccanismi differenti:
1- induzione delle proteine SOCS, principalmente SOCS-1 (suppressor of
cytokine signaling)
2- azione delle proteine fosfatasi Shp-1 e -2 (agiscono sull’IFNγ-R e sugli
omodimeri Stat-1)
Entrambi i meccanismi portano all’inibizione del segnale via Stat-1: topi con
delezioni di SOCS-1 o Shp-1 sono caratterizzati da risposte infiammatorie
sistemiche molto gravi (Marine JC et al. Cell 1999; 98: 609-616).
3- PIAS (protein inhibitor of Stat1): lega direttamente Stat1 e inibisce
l’associazione degli omodimeri (GAF) col DNA
4- citochine anti infiammatorie (IL-4, IL-10, TGFbeta) e glucocorticoidi
antagonizzano azione IFNγ.
Recettore per IFNγ: regolazione - a
Journal of Leukocyte B iolog y Volume 75, February 2004 163
Recettore per IFNγ: regolazione b
Journal of Leukocyte B iolog y Volume 75, February 2004 163
Classificazione ereditarietà difetti
IFNγ-R
•i geni della cascata IFNγ hanno forme sia dominanti
che recessive
IFNγ-R1: struttura del gene e mutazioni
• Mutazioni a trasmissione sia AD che AR risultano in deficienze in IFNγR1. Gran parte delle mutazioni recessive causano la completa perdita
dell’espressione del recettore sulla superficie cellulare o la perdita del
legame con l’IFNγ: complessivamente questi difetti sono conosciuti come
RC-IFNγ-R1 (recessiva completa).
• Difetti dominanti di IFNγ-R1 sono causati da mutazioni eterozigoti
troncanti localizzate nel dominio intracellulare di IFNγ-R1, che causano un
accumulo di proteine IFNγ-R1 non funzionanti sulla superficie cellulare
• L’accumulo delle proteine con la mutazione porta al legame di queste con
la molecola codificata dall’allele normale, con una risposta diminuita (ma
non assente) all’IFNγ: questa condizione è conosciuta come DP- IFNγ-R1
deficiency (dominante parziale).
IFNγ-R1: struttura del gene e mutazioni
•Hotspot mutazionale: è la regione vicino alla base 818, con la delezione di 4bp
(818del4), subito al di sotto del dominio transmembrana, che elimina la sequenza
peptidica critica per la rimozione del recettore dalla superficie cellulare.
IFNγ-R2: struttura del gene
• molto simile come organizzazione genetica a quella dell’IFNγ-R1: ha 7
esoni, i primi 5 codificano per il dominio extracellulare (che non
possiede però capacità di legame), il sesto codifica per la porzione
transmembrana e il settimo codifica per il dominio intracellulare.
• IFNγ-R2 è più corto dell’IFNγ-R1 (316 aa) principalmente a causa
della porzione intracellulare più corta.
• Nel dominio intracellulare è presente il sito di legame per Jak2 (aa 263274 PPSIPLQIEEYL).
• Viene glicosilato all’estremità N-terminale durante il passaggio nel
Golgi, e ciò porta il suo PM a 61-67kDa (rispetto ai 34,8 kDa predetti).
• IFNγ-R2 è una catena deputata alla traduzione del segnale ma ha un
ruolo anche nello stabilizzare il complesso IFNγ_IFNγ-R1
IFNγ-R2: struttura del gene e mutazioni
• sono stati pubblicati sia casi di pazienti con forme dominanti che
recessive
• descritte molte meno mutazioni che IFNγ-R1
• la mutazione 791delG quando in condizione di emizigosi riduce della
metà la capacità di trasdurre il segnale
IFNγ-R2
Un lavoro del gruppo di Rosenzweig et al. (J Immunol;173:3991–
3999(2004) ha evidenziato l’importanza del dipeptide Leu-Isoleu (residui
255-256) per la funzione dell’IFN γ -R2.
- la rimozione di questo motivo (mantenendo però intatto il dominio di
legame per Jak2) genera un recettore che si over-accumula sulla
superficie cellulare (con effetto gain-of-function)
- se la rimozione coinvolge anche il Jak-binding site genera un mutante
che si accumula sulla superficie cellulare con effetto dominante-negativo.
- rimuovendo solo il dominio di legame per Jak si ottiene un costrutto non
funzionale, con pattern di espressione normale sulla superficie cellulare.
Recessive vs dominanti:
correlazione genotipo-fenotipo
• pazienti con forme RC hanno
un fenotipo decisamente più
severo rispetto ai DP, sia
come età di comparsa (3,1
anni vs 13,4), aumento di
numero e gravità delle
infezioni (19 vs 8 infezioni per
100 persone/anno di
osservazione), diminuzione
della sopravvivenza (100% vs
27% mortalità a 10 anni)
Stat1: gene&mutazioni
• nei mammiferi sono state descritte 4 Jak (Jak1-4) e 7 Stats (Stat1,
Stat2, Stat3, Stat4, Stat5a, Stat5b e Stat6).
• le proteine Stat sono citosoliche, 750-800 residui con struttura
comune. Hanno regioni caratteristiche che dal C-terminale verso
N-terminale sono:
-dominio SH2 (Src homology-2)
-dominio di legame al DNA
-dominio per l’oligomerizzazione
Promotore dell’IFNγ-R1 e SNP
• la regione MPR (minimal promoter region) comprende 692 pb
al 5’ della sequenza codificante del recettore, ed è altamente
polimorfica.
• diversi SNPs sono stati descritti in questa regione, con
differenze significative tra i vari gruppi etnici, sono stati oggetto
di studio di associazione.
• in particolare la sostituzione in posizione – 56 T>C è associata
alla protezione dallo sviluppo di malaria cerebrale e dalla morte
nei Mandikas, il maggiore gruppo etnico del Gambia (Koch O, et
al. J Infect Dis 2002;185:1684–1687).
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