Diagnostica della Malattia di
Pompe
(Glicogenosi tipo II)
Dott.ssa Angela Amati
Servizio di Neurofisiopatologia
Azienda Ospedaliera-Universitaria Policlinico di Bari
ESAMI DI LABORATORIO
– Dosaggio del CK
• Bambini: valore aumentato (< 10x);
• Adolescenti e adulti (normale o lievemente
aumentato (5%);
– Dosaggio dell’attività enzimatica dell’alfa
glucosidasi acida;
MALTASI ACIDA
(alfa-glucosidasi acida)
• enzima lisosomiale;
•lavora ad un pH compreso
tra 4 e 5;
•dotata di attività alfaglucosidasica→può
idrolizzare completamente
il glicogeno in glucosio;
•è il solo enzima
degradativo del glicogeno
presente nei lisososmi;
•è codificato dal gene
GAA;
L’α-1,4-glucosidasi acida
– Localizzazione: presente in tutti i tessuti
– Localizzazione subcellulare: lisosomiale
– Meccanismo d’azione:
• Idrolizzazione lineare dei legami α1-4 glucosidici dei carboidrati
• Il sito catalitico dell’enzima: Asp-518
– Effetti delle mutazioni dell’α-1,4-glucosidasi acida: varie
• Enzima assente: nella forma infantile;
• Enzima e attività proporzionalmente ridotta: nella forma adulta;
• Enzima presente ma attività catalitica ridotta: nelle forme infantili,
giovanili e adulte;
PATOLOGIA
PATOGENESI
DELLA MALATTIA DI POMPE
• La GAA è
essenziale per
la degradazione
del glicogeno
lisosomiale
• Il deficit causa
accumulo e
dilatazione
Raben N, Plotz P, Byrne BJ. Acid alfa-glucosidase deficiency (glycogenosis type II, Pompe disease). Curr Mol Med. 2002;2:145-166.
La progressione della Malattia di Pompe
Dosaggio dell’attività enzimatica
dell’α glucosidasi acida
•
DIAGNOSI
Dosaggio dell’attività enzimatica della GAA su:
– Goccia di sangue essiccato (Dried Blood Spot) (tecnologia
emergente)
– Leucociti
– Fibroblasti cutanei
– Biopsia muscolare
•
Dosaggio del gluco-tetrasaccaride derivante dal glicogeno
nelle urine
•
Analisi delle mutazioni genetiche
•
Diagnosi prenatale tramite
– Amniocentesi
– Prelievo dei villi coriali
Hirschhorn R, Reuser AJJ. Glycogen storage disease type II: acid alpha-glucosidase (acid maltase) deficiency. The Metabolic and Molecular Bases of
Inherited Disease. 8th ed. New York: McGraw-Hill; 2001:3389-3420.
Umapathysivam K, Hopwood JJ, Meikle PJ. Determination of acid alfa-glucosidase activity in blood spots as a diagnostic test for Pompe disease. Clin
Chem. 2001;47:1378-1383.
Yijun L, Scott R, Chamoles N, Ghavami A, Pinto B, Turecek F, Gelb M. Direct multiplex assay of lysosomal enzymes in dried blood spots for newborn
screening. Clin Chem. 2004;50:1785-1796.
Chamoles NA, Niizawa G, Blanco M, Gaggioli D, Casentiini C. Glycogen storage disease type II: enzymatic screening in dried blood spots on filter
paper. Clin Chimica Acta. 347, 2004:97-102
DBS (Dried Blood Spot)
Malattia di Pompe identificata dal test di macchia di sangue essiccato
per dosaggio enzimatico dell’α glucosidasi acida
Inviati a: Dott. Severo PAGLIARDINI
Ospedale Sant’Anna Torino
Il metodo usato per la determinazione dell’α
glucosidasi acida (GAA) su spot è
di tipo fluorimetrico e viene eseguito a pH
acido (pH 4) e poi rapportato al pH 6.5
(pH6.5/pH4).
Se il valore è basso bisogna confermare il
sospetto di patologia di Pompe ripetendo
il dosaggio GAA su sangue intero e poi
confermando con il dosaggio sui
leucociti.
Vantaggi DBS
1. Metodo non invasivo;
2. Piccola quantità di sangue usata (200µl)
contro i 3-5 ml dei linfociti;
3. L’attività dell’enzima nello stato di
essiccamento rimane stabile a
temperatura ambiente quindi lo spot può
essere conservato e spedito al laboratorio
che esegue il test senza problemi;
4. Tempi di risposta molto brevi.
Dosaggio dell’attività
enzimatica GAA sui leucociti
• Occorrono 3-5 ml di sangue;
• Il dosaggio viene eseguito su pappa
leucocitaria;
• La presenza di isoenzimi che interferiscono
con l’attività della GAA è stata superata
usando degli inibitori per cui questo metodo
serve a confermare la diminuzione dell’attività
trovata con il DBS;
• Tempi di risposta più lunghi (6-8 settimane).
Dott.ssa Amelia Morrone
Responsabile Laboratorio
di Biologia Molecolare
Dosaggio dell’attività enzimatica
GAA su fibroblasti cutanei
• È un metodo più invasivo;
• I tempi di risposta sono di 1-2 mesi in
quanto è necessario attendere la
confluenza cellulare.
Dosaggio dell’attività enzimatica
GAA su biopsia muscolare
È un metodo invasivo ma con tempi di
risposta più rapidi rispetto a quello
eseguito sui fibroblasti
Dosaggio del
gluco-tetrasaccaride
derivante dal glicogeno
• I pazienti affetti da Malattia di Pompe presentano un
aumento dell’escrezione di questo metabolita nelle
urine.
• Questo marker è utile per monitorare l’efficacia della
terapia ma non la diagnosi, anche se la coesistenza di
aumentata escrezione di gluco-tetrasaccaride nelle
urine e diminuizione dell’ attività del GAA portano a
una conferma della diagnosi.
MALATTIA DI POMPE
ATTIVITA’ ENZIMATICA RESIDUA
PATOLOGIA
INSORGENZA INFANTILE*
INSORGENZA TARDIVA
100%
40%
ATTIVITÀ RESIDUA GAA
(FIBROBLASTI CUTANEI)
STATO CLINICO
100%
0%
0%
1
50
ETÀ (ANNI)
*CARDIOMIOPATIA
•
L’attività residua di GAA è generalmente inversamente correlata alla
severità della malattia
Insorgenza infantile
Insorgenza tardiva
<1% del normale
<40% del normale
Hirschhorn R, Reuser AJJ. Glycogen storage disease type II: acid alpha-glucosidase (acid maltase) deficiency. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 8th ed.
New York: McGraw-Hill; 2001:3389-3420.
EREDITARIETÀ
MALATTIA DI POMPE
MODELLO DI EREDITARIETÀ
Eredità autosomica recessiva
Padre portatore
Soggetto affetto
(25%)
Madre portatrice
Sani ma portatori (50%)
Allele
anormale
Sani
(25%)
Allele
normale
Hirschhorn R, Reuser AJJ. Glycogen storage disease type II: acid alpha-glucosidase (acid maltase) deficiency. The Metabolic and Molecular Bases of
Inherited Disease. 8th ed. New York: McGraw-Hill; 2001:3389-3420.
MALATTIA DI POMPE:
GENETICA
EREDITARIETÀ
• Il gene per la GAA è localizzato sul cromosoma 17;
• Il gene contiene 20 esoni di cui il primo non è codificante
• Sono circa 200 le mutazioni del gene GAA a tutt’oggi identificate;
– I difetti includono cambi di coppie di base con mutazioni di
senso e non senso, difetti di splicing e delezioni e inserzioni di
piccole e grandi dimensioni.
– Alcune mutazioni sono comuni nella popolazione generale o in
gruppi etnici specifici; la maggior parte consiste tuttavia in
mutazioni identificate in singoli soggetti.
• Elenco aggiornato delle mutazioni:
www2.eur.nl/fgg/ch1/pompe/mutations.html
Raben N, Plotz P, Byrne BJ. Acid alfa-glucosidase deficiency (glycogenosis type II, Pompe disease). Curr Mol Med. 2002;2:145-166.
Mutations in GSD II. Available at: http://www2.eur.nl/fgg/ch1/pompe/mutations.html.
Analisi molecolare
Dopo conferma della diagnosi mediante test
biochimico, l’identificazione della mutazione
nel gene GAA non è strettamente necessaria.
Tuttavia, il test molecolare è di notevole
importanza perché permette di identificare in
modo inconfutabile il portatore di una
mutazione ed è quindi fortemente consigliato
a tutti i parenti prossimi di un paziente,
soprattutto nel caso questi avessero
l’intenzione di avere un figlio.
Finora sono state identificate più di 200
mutazioni diverse
Biopsia muscolare
La biopsia muscolare viene eseguita:
• quando non abbiamo dati clinici
fortemente indicativi per malattia di
Pompe;
• quando abbiamo dati clinici fortemente
indicativi per malattia di Pompe ma il
dosaggio dell’ attività enzimatica è
normale;
Forma infantile
Ematossilina Eosina e
Tricromica di Engel: presenza
di vacuoli
PAS: i vacuoli appaiono PAS
positivi contenenti glicogeno
Fosfatasi Acida: i vacuoli sono
positivi alla fosfatasi acida
lisosomiale
Forma adulta
Ematossilina Eosina: presenza
di vacuoli
PAS: i vacuoli appaiono PAS
positivi contenenti glicogeno
Fosfatasi Acida: i vacuoli sono
positivi alla fosfatasi acida
lisosomiale
Diagnostica differenziale
Vacuoli presenti nella glicogenosi di tipo II sono
simili a quelli osservati nei pazienti con Malattia
di Danon.
Questa malattia è legata alla mutazione del gene
LAMP2 che codifica per la proteina 2 associata
alla membrana lisosomiale implicata nella
maturazione dell’autofagosoma e fusione al
lisosoma.
Le manifestazioni cliniche ed ereditarie però sono
diverse.
Diagnostica differenziale
Glicogenosi dovuta a deficit dell’enzima
deramificante caratterizzata da vacuoli
PAS positivi ma da un piccolo incremento
della fosfatasi acida e alla microscopia
elettronica il glicogeno non è mai legato
alla membrana e non vi è materiale
autofagico.
MALATTIA DI POMPE A INSORGENZA TARDIVA. Algoritmo diagnostico
American Association of Neuromuscular & Electrodiagnostic Medicine
Muscle & Nerve, 2009
Ipostenia muscoli
cingolo pelvico
Difficoltà
respiratorie
Valutazione neurologica
CK, LDH, AST, ALT
FCV da posizione
seduta e supina
Ipostenia
diaframma
ENMG
Pattern
miopatico
Elementi suggestivi
di una
patologia specifica
Elementi suggestivi di una
malattia di Pompe
o di una miopatia non
specifica
Biopsia muscolare
Attività enzimatica
GAA su sangue
Miopatia vacuolare +
accumulo di glicogeno lisosomiale
Considerare una
diagnosi diversa
Attività enzimatica
normale
Attività enzimatica
ridotta
NO
SI
Attività enzimatica GAA
su muscolo o sangue
Confermare la ridotta attività enzimatica
GAA su un secondo campione
e/o analisi genetica
Attività enzimatica
ridotta
Malattia di Pompe
confermata
Positivo
Negativo
Attività enzimatica
normale
Considerare una
diagnosi diversa
