Indice
INTRODUZIONE:
• Traslocazioni nell’uomo
CAP.1 IL CROMOSOMA Y E LE TRASLOCAZIONI CHE LO
COINVOLGONO
1.1 Il cromosoma Y
1.1.1
Regione AZFa
1.1.2
Regione AZFb
1.1.3
Regione AZFc
1.2 Traslocazioni X/Y
1.3 Traslocazioni Y/autosomi
CAP.2 SCOPO DEL LAVORO
CAP.3 MATERIALI E METODI
3.1 Caso clinico
3.2 Analisi citogenetica
CAP.4 RISULTATI
CAP.5 DISCUSSIONE E CONCLUSIONE
CAP.6 BIBLIOGRAFIA
1
INTRODUZIONE
I riarrangiamenti cromosomici ed in particolare quelli “sbilanciati” de
novo, con i loro punti di rottura, rappresentano, nella ricerca, una risorsa
fondamentale per quanto riguarda il mappaggio e l’identificazione dei genimalattia. Il presupposto da cui si parte è che, se si è verificato un effetto
fenotipico a seguito di un riarrangiamento anche apparentemente
bilanciato, a livello dei punti di rottura, deve esistere un gene (o più geni),
una sequenza di regolazione, essenziale per il normale sviluppo psicofisico
e che il riarrangiamento cromosomico (traslocazione, inversione,
cromosoma ad anello, etc), interrompendo o spostando il locus, provochi
una mancata, ridotta o alterata sintesi di un prodotto genico, con gravi, se
non letali, effetti fenotipici. Di conseguenza, trovare un’alterazione di
questo tipo nell’assetto cromosomico di un individuo affetto da una
patologia o da un quadro sindromico, significa riuscire a reperire
informazioni sulla loro eziopatogenesi.
Le traslocazioni nell’uomo
Tra le anomalie cromosomiche di struttura più frequenti nella specie umana
sono da annoverare le traslocazioni sia reciproche che Robertsoniane, sia
che esse siano bilanciate che sbilanciate.
Un riarrangiamento di struttura viene definito bilanciato quando non
provoca effetti fenotipici nel portatore, indipendentemente dal fatto che vi
sia o meno una perdita o acquisto di DNA, viene invece definito sbilanciato
quando in seguito a perdita o acquisto di DNA nel portatore se ne
evidenziano gli effetti fenotipici.
2
Le traslocazioni così come altri riarrangiamenti strutturali bilanciati
possono però essere causa di infertilità. Sono infatti legate ad un aumentato
rischio riproduttivo in quanto possono essere causa di abortività ripetuta, di
prole giunta a nascita con aneusomia cromosomica, dovuto alla
particolarità degli eventi della profase meiotica Fig 1 e Fig2.
Fig.1 Segregazione della struttura a croce
*Molto più rare sono invece le segregazioni 3:1 o 4:0
3
Alternata
Adiacente 1
Adiacente 2
Fig.2 Traslocazioni Robertsoniane
4
Nel maschio, inoltre, nel 2,2- 8,6 % dei casi, le traslocazioni, così come
altri riarrangiamenti cromosomici, possono causare infertilità,
nel 5%
questa è rappresentata da una riduzione della produzione di gameti
(oligospermia), mentre
nel 16% dalla loro totale mancata produzione
(azoospermia) .
In particolare anche le traslocazioni Robertsoniane bilanciate possono
causare oligospermia nel sesso maschile si riscontrano infatti nell’1,6% dei
maschi oligospermici, contro lo 0,1% della popolazione generale.
Numerose sono quindi le evidenze che nel sesso maschile i riarrangiamenti
cromosomici, in particolare quando questi coinvolgono gli acrocentrici,
provocano un disturbo negli eventi meiotici e di conseguenza un arresto
della spermatogenesi processo che sembra quindi molto più vulnerabile
dell’oogenesi a queste alterazioni cromosomiche strutturali.
Con una bassa frequenza tuttavia questi riarrangiamenti pur “bilanciati” o
apparentemente tali, secondo le metodiche tradizionali, sono associati ad
effetti fenotipici che vanno al di là della fertilità dei soggetti portatori e che
si possono configurare a volte come patologie monogeniche mentre altre
come patologie genomiche, dovute o a deregolazione genica da effetto di
posizione
o
a
mutazione
genica
o,
infine,
a
microdelezione/microduplicazione.
5
1. IL CROMOSOMA Y E LE TRASLOCAZIONI CHE LO
COINVOLGONO
A carico del cromosoma Y sono stati descritti tutti i tipi di riarrangiamento
cromosomico sia bilanciati che sbilanciati.
Le traslocazioni che lo coinvolgono sembrano però eventi poco frequenti
sia per quanto concerne le traslocazioni con il cromosoma X
ma,
soprattutto, le traslocazioni Y/autosoma.
Gli studi di questi riarrangiamenti strutturali ed in particolare gli studi di
correlazione genotipo – fenotipo e genetico – clinici hanno contribuito nel
tempo al sequenziamento dei geni di questo cromosoma ed a comprenderne
la storia evolutiva, la loro funzione fino alla determinazione dei
meccanismi alla base dei quadri clinici correlati.
1.1
Il Cromosoma Y
Il cromosoma Y è un piccolo cromosoma acrocentrico, privo di satelliti che
conta oltre 57 milioni di paia di basi e rappresenta circa lo 0,38% del DNA
nelle cellule del maschio, mentre è assente nelle cellule della femmina.
Esso è caratterizzato da una piccola porzione eucromatica che comprende il
braccio corto (Yp) di circa 8 Mb e la porzione prossimale del braccio lungo
(Yq) di circa 14,5 Mb, in cui si trovano i pochi geni deputati al
differenziamento delle caratteristiche sessuali maschili ed al controllo della
spermatogenesi, mentre i 2/3 distali dell'Yq sono costituiti da un'ampia
porzione eterocromatica . Malgrado la diversa morfologia e la divergenza
di sequenze dell’Y rispetto al cromosoma X, tra i due cromosomi sono
presenti brevi regioni sub - telomeriche, tra le quali può avvenire crossing
over nel corso della meiosi. Tali regioni, fondamentali per una corretta
6
meiosi e note come regioni pseudoautosomiche, sono PAR 1, mappata sul
braccio corto e regione nota come regione di crossing obbligato, ha
un’estensione di 2,6 Mb, contiene 12 geni e la sua perdita è generalmente
associata ad infertilità; e PAR 2 mappata sul braccio lungo, ha
un’estensione di circa 320 bp e non è sempre coinvolta nel crossing over.
Le due suddette regioni fanno da cornice al restante 95% del cromosoma
noto come NRY (non recombining region) o attualmente rinominata MSY
(male specific Y) proprio perché caratteristica del cromosoma Y maschile.
L’MSY risulta essere un mosaico di sequenze di etero cromatina (Yq12) e
di 3 classi di eucromatina (Yq11) che sono:
• X-transposta: presenta il 99% di affinità con la sequenza di DNA
Xq21 ed è così denominata perché derivante da una consistente
trasposizione dalla X all’Y avvenuta oltre 3-4 milioni di anni fa.
All’interno di tale regione, che consta di circa 3,4 Mb, sono stati
identificati solo due geni che hanno entrambi omologhi in Xq21 :
TGIF2LY (TGF beta-induced transcription factor 2-like Y) e
PCDH11Y (Protocadherin 11 Y).
• X-degenerata: tale regione è costellata di geni in singola copia o di
pseudo geni omologhi a ben 27 localizzati sul cromosoma X. Questi
geni mostrano tra il 60% ed il 96% di identità di sequenze
nucleotidiche con i loro omologhi X-linked e sembrano essere
reliquie di antichi autosomi da cui i cromosomi X e Y si sarebbero
co-evoluti. Inoltre tutti i 12 geni MSY ubiquitariamente espressi
risiedono nella regione X-degenerata a differenza degli 11 geni
MSY espressi prevalentemente nel testicolo di cui uno solo, il gene
SRY, appartiene a tale regione.
7
• Ampliconi: sono lunghe sequenze ripetute (dirette o inverse) che
costituiscono la maggior parte dell’eucromatina con una lunghezza
complessiva di circa 10,2 Mb. Tale regione presenta di gran lunga la
più alta densità di geni, sia codificanti che non-codificanti, tra tutte e
tre le regini di eucromatina. Sono state identificate nove diverse
famiglie geniche MSY specifiche con numero di copie che vanno da
2 (VCY, XKRY, HSFY, PRY) a 3 (BPY2) a 4 (CDY, DAZ) a 6
(RBMY) a circa 35 (TSPY). In contrasto con l’espressione
ubiquitaria dei geni della regione X-degenerata, i geni e le unità
trascrizionali degli ampliconi mostrano un’espressione molto più
ristretta: tutte le nove famiglie geniche sono prevalentemente o
esclusivamente espresse nel testicolo.
Fig.3 A: Rappresentazione schematica dell’intero cromosoma Y. B: visualizzazione
ingrandita della regione eucromatica (Zheng Li, 2008).
8
Tabella 1. Skaletsky et al. (Giugno 2003)
9
La mappa cromosomica dell’Y è stata proposta per la prima volta da
Vergnaud che ha diviso il cromosoma Y in 7 intervalli; gli intervalli da 1 a
4 vanno dalla regione telomerica del braccio corto al centromero; gli
intervalli 5 e 6 si trovano nella parte eucromatica Yq, mentre l’intervallo 7
corrisponde alla regione eterocromatica. A livello dell’intervallo 5, si
trovano le sub-regioni Yq11.21 e metà dell’Yq11.22, mentre l’intervallo 6
si trova a metà di Yq11.22-Yq11.23. Paragonato con gli autosomi, il
cromosoma Y ha un numero di gran lunga minore di geni: circa 220 di cui
104 geni codificanti, 111 pseudogeni e altri 5 non ancora classificati. I 104
geni codificano per un totale di circa 48 proteine, di cui 16 scoperte nella
regione AZF correlata con la spermatogenesi. L’associazione tra
azoospermia e microdelezione del braccio lungo del cromosoma Y fu per la
prima volta osservata da Tiepolo e Zuffardi; successivamente invece Vogt
e i suoi collaboratori, studiando 370 uomini con oligospermia idiopatica,
suggerirono che la regione AZF fosse suddivisa in 3 sottoregioni
denominate AZFa, AZFb e AZFc e che queste fossero coinvolte per la
spermatogenesi. (Vogt et al 1999). Kent-First ed i suoi collaboratori
recentemente hanno avanzato l’ipotesi di una quarta sottoregioni AZFd,
presente tra AZFb e AZFc.
1.1.1 Regione AZFa:
La regione AZFa differisce dalle altre due in quanto non contiene sequenze
ripetute e soprattutto per la sua bassa frequenza di delezione, descritta solo
in pochi pazienti. AZFa è localizzata nei pressi del centromero e consta di
1-3 Mb e contiene 4 geni funzionali in singola copia: DFFRY (Drosophila
fats facets related Y), DBY (Dead box Y), Tβ4Y (Thymosin β4 Y) e UTY
(Ubiquitous TPR motif on Y). Il primo, adesso rinominato USP9Y
(Ubiquitin-specific protease 9, Y chromosome), è localizzato in posizione
10
Yq11.21 e codifica per una proteina facente parte della famiglia C19
(cistein peptidasi) che esplica un’azione tipo un’idrolasi C-terminale
dell’ubiquitina. Tale proteina non è però specifica del testicolo visto che è
espresso anche in altri tessuti. Il gene DBY (DDX3Y) invece ha un
omologo strutturale sul braccio corto del cromosoma X denominato DBX
(DDX3X) (Xp11.4). Entrambe le proteine DBY e DBX appartengono alla
famiglia altamente conservata delle DEAD box, che sono elicasi ATPdipendenti dell’RNA . Queste si ritrovano espresse in quasi tutti gli
organismi associate a processi di sintesi e di degradazione delle molecole di
RNA. Inoltre, anche se entrambe i geni sono trascritti in molti tessuti e nei
leucociti, la proteina DBY è stata osservata solo nel tessuto testicolare
mentre la proteina DBX è stata trovata nel cervello e nel rene maschile così
come nel tessuto ovarico femminile. USP9Y occupa una piccola porzione
di AZFa di circa 170 Kb, consta di 46 esoni e codifica per una proteina che
funziona come un’ubiquitina idrolasi C-terminale. Inizialmente si
ipotizzava che la sua delezione fosse associata ad azoospermia e grave
oligospermia; studi successivi, effettuati su eiaculato, hanno invece
dimostrato che abbia un ruolo marginale nella spermatogenesi e che possa
essere considerato più che altro un “fine tuner” della spermatogenesi
umana migliorandone l’efficienza.
1.1.2 Regione AZFb:
La regione misura 1-3 Mb e contiene i geni RBMY, elF-1Y, HSFY, PRY,
SMCY, XKRY, RPS4Y2, CDY1 e DAZ (condiviso anche con la regione
AZFc). In realtà esistono oltre 30 geni e pseudogeni RBMY largamente
diffusi in tutto il cromosoma Y e suddivisi in diverse sottofamiglie. La
sottofamiglia RBMY1 consta di 7 membri tutti raggruppati nella regione
AZFb. Tali geni codificano per specifiche proteine nucleari che contengono
11
un RBM (RNA-binding motif) e 4 copie di un motivo ripetuto SRGY
(serina-arginina-glicina-tirosina). Negli spermatociti RBMY1 si localizza
con un componente dello splicing del pre-mRNA in una zona ristretta del
nucleo; mentre nella fase tardiva della meiosi si localizza in tutto il
citoplasma degli spermatidi. Proprio per tale ragione è stato ipotizzato un
suo coinvolgimento, con ruli distinti, in tutte le fasi della meiosi (Elliot et al
1997). Il suo omologo sul cromosoma X è noto come RBMX. Il gene
CDY (chromodomain on Y chromosome) si trova localizzato nel subintervallo 5 dell’Yq; è un gene multicopia che si esprime in maniera
specifica nel testicolo e dovrebbe essere coinvolto nella modificazione dei
cromatidi durante la spermatogenesi.
1.1.3 Regione AZFc:
La regione maggiormente deleta e perciò più studiata del cromosoma Y è la
regione AZFc. La sua delezione è stata riscontrata nel 12% di maschi
azoospermici e nel 6% di quelli con grave oligospermia. AZFc, localizzato
nella porzione distale dell’intervallo 6, misura 3,5 Mb e contiene 7 famiglie
diverse di geni per un totale di circa 19 geni tutti espressi nel tessuto
testicolare. Il primo gene identificato in tale regione è stato il gene DAZ
che in un primo momento si pensava fosse in singola copia e che fosse il
solo gene a funzionare nell’intervallo AZFc. Studi successivi hanno invece
portato alla luce il fatto che il gene DAZ sia il membro di una famiglia
multigenica, disposta a cluster e che ogni membro della famiglia presenti
delle sequenze altamente ripetitive. Le copie geniche, omologhe tra loro
per il 99%, localizzate nella regione Yq11, sono organizzati in due cluster,
che presentano un orientamento invertito (testa-testa). Queste sono DAZ1e
DAZ2 nella regione palindromica P2 e DAZ3 e DAZ4 nella regione
palindromica P1. Il DAZ presenta un omologo autosomico detto DAZLA
12
localizzato sul cromosoma 3p24. Si ritiene che il DAZ derivi dalla
trasposizione del gene DAZLA dal cromosoma 3 al cromosoma Y, seguito
da duplicazioni e inversioni, che hanno dato luogo ad una famiglia di geni
multicopia. La famiglia genica DAZ codifica proteine espresse
esclusivamente nel testicolo, nei diversi stadi della spermatogenesi, dagli
spermatogoni agli spermatidi allungati e in ultimo anche nella coda degli
spermatozoi. Il DAZ presenta un omologo autosomico detto DAZL (DAZlike) localizzato sul cromosoma 3p24 e BOULE sul cromosoma 2.
Quest’ultimo codifica per un fattore chiave della meiosi delle cellule
germinali maschili che regola l’espressione della fosfatasi cdc25 coinvolta
nella promozione dello sviluppo nel corso della meiosi.
Un altro gene di cui è importante fare menzione è il gene SRY (sexreversal-Y-”Regione determinante il Sesso sul cromosoma Y”) che produce
il “fattore di differenziazione testicolare (TDF)”, in grado di guidare lo
sviluppo della gonade maschile nell’embrione. Il gene è formato da un
singolo esone che codifica per una proteina di circa 204 amminoacidi
contenente un dominio di legame al DNA altamente conservato che consta
di 79 amminoacidi, denominato HMG box. L’SRY appartiene alla famiglia
dei geni SOX (ha omologia con SOX3), molti dei quali sono coinvolti nei
processi di sviluppo durante l’embriogenesi. Uno di questi è il gene SOX9
che codifica per una proteina contenente una HMG box simile a quella di
SRY e che è stato individuato sul braccio lungo del cromosoma 17 clonando
il punto di rottura cromosomico delle traslocazioni presenti in pazienti
affetti da displasia campomelica, una malattia invalidante delle ossa
associata ad un'elevata incidenza di reversione di sesso da maschio a
femmina. E' evidente quindi che questo gene, oltre al ruolo nella
morfogenesi della ossa, è associato con lo sviluppo del testicolo. A riprova
di ciò, nella gonade di embrioni XY l'espressione di questo gene aumenta
13
subito dopo l'inizio dell'espressione di SRY ed è osservata durante la
formazione del testicolo non solo nel topo e in altri mammiferi. Il fatto
inoltre che pazienti femmine con displasia campomelica non presentino
alterazioni nello sviluppo delle gonadi fa pensare che SOX9 agisca insieme
a SRY nel determinare lo sviluppo in senso maschile degli embrioni XY, e
che SRY e SOX9 possano far parte della stessa sequenza di controllo dello
sviluppo embrionale.
Da quanto fin qui detto si evince che la maggior parte delle sequenze
codificanti di questo cromosoma sono deputate, nell’uomo, direttamente o
indirettamente, al differenziamento della gonade ed al controllo della
spermatogenesi, mentre veramente esiguo è il numero dei geni che
controllano altri caratteri.
Il mappaggio di molti di questi geni è stato possibile, come prima detto,
dall’analisi dei riarrangiamenti sia intra che inter cromosomici a carico
dell’Y
1.2 Traslocazioni
X/Y
Le traslocazioni X/Y non sono frequenti nell’uomo e la maggior parte dei
casi descritti sono eventi sporadici, mentre in minore misura sono descritti
casi in cui il riarrangiamento è ereditato.
Più frequentemente le traslocazioni X/Y coinvolgono punti di rottura in
Xp22 e Yq11 ritenuti “hot spots” per appaiamento di porzioni non alleliche
tra Xp e Yq durante la prima divisione meiotica paterna; il conseguente
crossing-over con scambio reciproco di sequenze di DNA può portare o
alla formazione di due cromosomi monocentrici o ad un cromosoma
dicentrico e frammento acentrico.
14
I soggetti con cariotipo 46,Y,der (X)t(X;Y) sono di sesso maschile mentre
quelli con cariotipo 46,X,der(X)t(X;Y) possono essere sia di sesso maschile
che femminile a seconda della porzione del cromosoma Y coinvolta nella
traslocazione e cioè se il gene SRY è contenuto o no nel cromosoma X
derivato dal riarrangiamento.
In
tutti
i
casi
consegnati
alla
letteratura
è
stata
riscontrata
contemporaneamente la perdita della regione Xp22.3→pter e presenza del
braccio lungo del cromosoma Y (Yq11→qter).
Il reciproco prodotto della traslocazione e cioè il cromosoma Y che risulta
costituito da una porzione di Xp su Yq viene riferito meno in letteratura.
Gli individui con cariotipo 46,X,-Y,+der(Y) t(X;Y)(p22;q11) hanno due
copie dei geni di Xpter e sono nullisomici per una porzione di Yq. Dal
momento che questa condizione non dovrebbe essere letale, la rarità del
suo fenotipo o le sue lievi conseguenze cliniche, potrebbero essere alla base
del suo mancato riscontro.
In quei rari casi descritti in letteratura, il quadro clinico di pazienti maschi
caratterizzato da ritardo mentale, dismorfismi e ambiguità dei genitali
sarebbe imputabile alla parziale duplicazione della regione Xp coinvolta
nella traslocazione.
Alla base degli scambi aberranti X/Y ci sarebbero le omologie di sequenza
tanto nella regione PAR dei cromosomi X e Y quanto al di fuori di tale
regione, con sequenze omologhe riscontrate su Xq e sul braccio corto o
sulla regione prossimale del braccio lungo del cromosoma Y, che arrivano
fino al 95% di somiglianza; altri loci nella regione Xpter→Xp22 mostrano
una omologia dell’85-95% con sequenze in Xq11 o nella regione
pericentromerica del cromosoma Y. E’ possibile pertanto, seppure non così
15
frequentemente, che durante la meiosi maschile il braccio corto del
cromosoma X si appai in maniera aberrante con il braccio lungo del
cromosoma Y, con successiva ricombinazione tra queste regioni. In
alternativa i cromosomi X ed Y si potrebbero appaiare casualmente senza il
contemporaneo coinvolgimento della regione PAR.
A differenza di altre traslocazioni germ-line, caratterizzate a livello
molecolare e descritte in letteratura, le traslocazioni X/Y sono le uniche ad
essere favorite dalla estesa omologia di sequenza mostrata dai due
cromosomi.
La perdita della parte terminale del braccio corto del cromosoma X, sia
dovuta a delezione che ad una traslocazione, può produrre un fenotipo la
cui complessità del quadro clinico dipende sia dalla posizione dei punti di
rottura, sia dal numero di geni deleti, che dal sesso dell’individuo affetto.
Gli aspetti clinici principali che si accompagnano comunque più
frequentemente alle traslocazioni X/Y comprendono soprattutto la bassa
statura, dismorfismi facciali, eventualmente ritardo mentale e nei maschi
possibile ittiosi, parziale o generalizzata, ipogonadismo con azoospermia.
Le femmine possono anche essere fenotipicamente normali e fertili.
I maschi infatti, particolarmente quelli con delezioni in Xp22.3, sono
nullisomici per questa regione e conseguentemente possono manifestare
sindromi da geni contigui caratterizzate da differenti combinazioni di
fenotipi in base alla lunghezza della delezione. Queste sindromi,
caratterizzate e studiate negli ultimi anni, possono comprendere
l’associazione delle seguenti malattie mendeliane:
- bassa statura (SS;MIM 312865)
- condrodisplasia punctata X-linked recessiva (CDPX;MIM 302950)
16
- ritardo mentale (MRX;MIM 309530)
- ittiosi X-linked dovuta alla mancanza di STS (XLI;MIM 308100)
- sindrome di Kallman (KAL;MIM 308700)
Sono state descritte in letteratura anche femmine con delezioni terminali o
traslocazioni che coinvolgono la regione Xp22, che possono manifestare
alcune caratteristiche cliniche che appartengono a due malattie mendeliane:
- la sindrome di Aicardi (MIM 30 4050)
- la sindrome di Goltz (MIM 305600)
In alcuni casi la presenza di entrambi i geni malattia associati alle due
sindromi è stata ipotizzata essere dovuta a sindrome da geni contigui, in
altri la somiglianza del fenotipo alle due sindromi, senza però rispondere ai
criteri stretti di diagnosi, ha fatto supporre una eterogeneità genetica delle
due sindromi.
La bassa statura quindi è l’aspetto clinico più frequentemente riscontrato
sia nelle femmine che nei maschi che presentano delezioni terminali del
braccio corto dei cromosomi X e Y.
Le delezioni terminali della regione Xp invariabilmente comportano la
bassa statura, indipendentemente dai siti cromosomici coinvolti nel
breakpoint. Piccole delezioni terminali della regione Yp si accompagnano
anch’esse alla bassa statura per cui da tempo si supponeva che un gene (o
più geni) della crescita risiedesse nella regione PAR1 e che la sua
aploinsufficienza potesse causare come fenotipo dominante una ridotta
altezza.
17
Nella parte distale della PAR 1 (Xp22.3 e Yp11.3) è stato mappato un gene
denominato Short stature HOmeoboX (SHOX)- cointaining gene.
E’un gene che appartiene alla grande famiglia dei geni omeotici; questi
sono considerati “architetti molecolari universali del design del corpo”,
agendo come regolatori nello sviluppo della struttura somatica, dalla
determinazione dell’asse del corpo, alla formazione di strutture complesse.
Il gene SHOX è composto da 7 esoni ed ha almeno due prodotti di
espressione di 1870 bp (SHOXa) e 1349 bp (SHOXb), che codificano
rispettivamente per due proteine di 292 e 225 AA; queste sono il risultato
di splicing alternativo e condividono i primi 724 nucleotidi esonici. Mentre
SHOXa si esprime a livello di muscolo scheletrico, placenta, cuore e
fibroblasti di midollo osseo, mRNA di SHOXb si ritrovano soltanto nel
rene fetale, nel muscolo scheletrico e nei fibroblasti di midollo osseo, nei
quali l’espressione del gene è massima.
SHOX sfugge all’inattivazione e quindi è espresso in doppia copia in
entrambi i sessi, confermando che per questo gene si verifica un effetto
dose nelle aberrazioni cromosomiche che lo coinvolgono.
Il ruolo fondamentale che il dosaggio del gene SHOX riveste nella
determinazione
del
fenotipo
altezza
è
ulteriormente
comprovato
dall’osservazione che casi con copie soprannumerarie di tale gene risultano
in genere alti. Nella sindrome di Klinefelter (47,XXY), ad esempio, in cui
si ha la contemporanea presenza di una copia in più di SHOX e
ipogonadismo, l’alta statura è determinata dall’allungamento degli arti.
Parimenti, in casi nei quali si ha duplicazione di Xp o Yp, senza
compromissione dei valori degli ormoni gonadici, è frequente riscontrare
una crescita maggiore soprattutto delle porzioni distali degli arti.
18
1.3 Traslocazioni Y/Autosoma
Se
le traslocazioni X/Y sono poco frequenti ancora più rare sono le
traslocazioni Y/autosoma dato che, complessivamente, in letteratura ne
sono state descritte una trentina di cui solo due o tre sono riportati come
casi familiari (Tab. 2 e 3) Fenotipicamente sono essenzialmente maschi
tranne il caso descritto da de Ravel T.J.L. (2004) che mostra un fenotipo di
sesso femminile, in una situazione di
traslocazione complessa
coinvolgente il cromosoma 9 ed associata alla perdita della regione
contenente il sex reversal gene, DMRT1.
In relazione al quadro clinico è utile distinguere, oltre al punto di rottura
sull’Y, le traslocazioni che coinvolgono uno qualsiasi degli autosomi da
quelle che interessano i cromosomi acrocentrici.
Infatti, i casi di traslocazione Y/autosoma (non acrocentrico) descritti in
letteratura, mentre mostrano sostanzialmente il mantenimento del braccio
corto del cromosoma Y e parti più o meno estese della regione eucromatica
del lungo, determinando quindi il differenziamento sessuale in senso
maschile, per quanto riguarda invece l’autosoma, in base al punto di
rottura, si producono monosomie parziali, più o meno consistenti,
delle
regioni terminali del braccio corto o lungo del cromosoma interessato. E’
pertanto ovvio che il fenotipo patologico che ne scaturisce, con ritardo
mentale ed anomalie congenite è dovuto all’aneusomia autosomica che si è
determinata.
Nel caso in cui, invece, l’autosoma è un cromosoma acrocentrico questo
perde sostanzialmente il braccio corto, mantenendo o meno il centromero,
pertanto l’effetto fenotipico che si determina, per lo più infertilità da oligoazoospermia, è dato, per quanto fino ad oggi descritto, dal punto di rottura
19
sul cromosoma Y e dall’estensione, essenzialmente del braccio lungo, della
regione eucromatica legata alla spermatogenesi, che va perduta.
Nella descrizione di questi casi, per altro veramente esigui, gli autori
tentano di comprendere se fra gli altri segni clinici si possa contemplare
una diminuzione della statura, in almeno alcuni di questi soggetti, per
cercare di circoscrivere la regione in cui si suppone essere una sequenza, un
gene non ancora identificato, denominato CGY, che si ritiene contribuisca
a controllare l’altezza nel sesso maschile.
20
21
22
Tabella 2 e 3. Chen et al. (Ottobre 2008)
23
2. SCOPO DEL LAVORO
Con questo studio citogenetico-clinico si è voluto contribuire alla casistica,
per altro veramente esigua, dei casi descritti in letteratura di traslocazione
Y/autosoma ed in particolare Y/acrocentrici.
Sono state applicate le metodologie citogenetiche classiche ad alta
risoluzione in combinazione con le tecniche di biologia molecolare ad un
caso di traslocazione Y/21.
Lo scopo prefissato è stato quello
di
restringere il più possibile le regioni in cui sono avvenuti i breakpoints
della traslocazione e contemporaneamente anche di individuare i geni
coinvolti nello sbilanciamento genomico per una corretta correlazione
genotipo-fenotipo, al fine ultimo di contribuire al mappaggio di geni o
sequenze ad oggi non noti nella regione Yq11 prossimale.
24
3. MATERIALE E METODI
3.1 Caso clinico
Il probando, un ragazzo di 14.6 anni di età, è giunto all’osservazione
dell’U.O.C. Laboratorio di Genetica Medica della ASL dell’Aquila, per
effettuare approfondimenti circa la
natura di un importante ritardo di
crescita e di pubertà con sospetto di ipogonadismo ipogonadotropo. Il
paziente era stato precedentemente sottoposto a visita pediatrica dalla quale
si evidenziava una statura inferiore al 1° centile (- 2.8 DS, 143 cm) con
stadio puberale P1G1. Dall’esame ematocitochimico si è rilevato un deficit
parziale di GH e basse concentrazioni di FSH, LH e Testosterone dopo
stimolo con omologo LHRH.
3.2 Analisi Citogenetica
L’analisi citogenetica del paziente è stata eseguita mediante le tecniche
standard su linfociti di sangue periferico coltivati in RPMI 1640 con FCS
(10%) e stimolati con PHA. Le colorazioni differenziali utilizzate sono
state i bandeggi GTG e CBG. Allo scopo di ottenere preparati cromosomici
prometafasici che forniscono una migliore risoluzione, sono state altresì
allestite colture di linfociti periferici sincronizzate secondo un protocollo
modificato del metodo di Yunis et al. del 1981.
Alle metodiche di citogenetica classica sono state affiancate le tecniche di
biologia molecolare di ibridazione in situ fluorescente (FISH) utilizzando le
seguenti sonde commerciali di DNA (tab. 4):
25
Nome Sonda Tipo Di Sonda
Mappa
Sts
SHOX
cosmide
Xp22.33/Yp11.32
DXYS28
SRY
cosmide
Yp11.31
SY14
CENY
alfoide
Centromero Y
DYZ1
KAL
cosmide
Xp22.32
DXS1223 DXS1138
CEN 21
alfoide
Centromero 21
D21Z1
CEN X
alfoide
Centromero X
DXZ1
WCP Y
painting
Tabella 4.
La FISH di tutte le sonde è stata eseguita secondo i protocolli suggeriti
dalle ditte fornitrici delle stesse.
26
4. RISULTATI
Lo studio citogenetico ad alta risoluzione sul probando ha permesso di
determinare il seguente cariotipo: 45,X,der(21)t(21;?) (Fig.4 cariotipo
completo). Una più precisa definizione della traslocazione cromosomica,
riscontrata nel paziente, è stata ottenuta dal confronto dei dati di
citogenetica classica con quelli dell’analisi di FISH (figure A-F) riportati
nella seguente tabella 5:
Presenza sul
Presenza Sul
Nome Sonda
Mappa
der(21)
Cromosoma X
SHOX
Xp22.33/Yp11.32
+
+
SRY
Yp11.31
+
-
CENY
Centromero Y
+
-
KAL
Xp22.32
-
+
CEN 21
Centromero 21
+
-
WCP Y
Y
+
-
CEN X
Centromero X
-
+
Tabella 5.
27
Fig. 4 Cariotipo del probando.
28
Fig. A: FISH con sonda per il gene SHOX (in rosso) e per il centromero del
cromosoma X (in acqua).
29
Fig. B: FISH con sonda per il gene SRY (in rosso).
30
Fig. C: FISH con sonda per il centromero del cromosoma X (in verde) e per il
centromero del cromosoma Y (in rosso).
31
Fig. D: FISH con sonda per il centromero del cromosoma X (in verde) e per il gene
KAL (in rosso).
32
Fig. E: FISH con sonda per il centromero del cromosoma 21 (in rosso).
33
Fig. F: FISH con sonda per il centromero del cromosoma X (in verde), per il
centromero del cromosoma Y (in verde) e painting del cromosoma Y (in rosso).
34
Da tale analisi risulta che il cromosoma marker è il cromosoma dicentrico
derivativo della traslocazione Y/21 con punti di rottura in q11.1 e p11; in
esso è assente tutta la regione del braccio lungo del cromosoma Y (Figure
5a e 5b).
Y
21
Fig.5a: Parziale del cromosoma 21
Dic(Y;21)
Fig.5b:Punti di rottura del cromosoma Y e 21
Il cariotipo pertanto risulta essere :
45,X,dic(Y;21)(q11.1;p11)
45,X,dic(Y;21)(pter
q11.1::p11
qter)
35
5. DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
Come premesso nel capitolo introduttivo, fino ad oggi in letteratura sono
stati descritti in tutto circa trenta casi di traslocazioni Y/autosoma che
possono essere distinti, sia dal punto di vista genetico che clinico,
sostanzialmente in due tipi, in relazione all’autosoma coinvolto se questo è
o meno un cromosoma acrocentrico.
Infatti, quando l’autosoma non è un acrocentrico la traslocazione dà luogo,
dal punto di vista clinico, ad un quadro sindromico, essenzialmente per
monosomia parziale, relativo alla regione sbilanciata dell’autosoma
interessato. Allorché
invece la traslocazione riguarda un cromosoma
acrocentrico, come per altro precedentemente detto, il fenotipo associato
dipende essenzialmente dal tratto del cromosoma Y perduto. Entrambi i
gruppi degli acrocentrici sono comunque parimenti coinvolti e non sembra
emergere un cromosoma preferenziale. Il caso qui riportato, coinvolge il
cromosoma 21e, ad oggi, sembrerebbe essere il terzo caso descritto di
traslocazione Y/21.
Se si analizzano i fenotipi dei casi riportati in letteratura delle traslocazioni
Y/autosoma (tab. 2 e 3) si può notare che due articoli riportano casi
familiari, pertanto i punti di
rottura a carico del cromosoma Y sono
avvenuti a valle della regione DAZ, preservando la spermatogenesi e
quindi le capacità riproduttive dei soggetti. Due casi sono, invece, associati
ad un quadro clinico con malformazioni minori e ritardo mentale, ma, a
parte il fatto che uno dei due è descritto come un caso di mosaicismo con
la linea 45,X senza il derivato della traslocazione, gli stessi autori
attribuiscono l’effetto fenotipico riscontrato ad altra causa, presupponendo
36
una concomitanza di eventi non correlati. I casi rimanenti, esclusi quelli in
età prepubere, sono stati accertati in quanto soggetti infertili/sterili con
oligo/azoospermia con un punto di rottura sull’Y che è a monte o coinvolge
la regione di controllo della spermatogenesi.
E’ interessante, però, notare che da osservazioni fatte sui casi riportati in
letteratura con perdita del braccio lungo del cromosoma Y, la cui frequenza
popolazionistica è stimata in circa 1/1000 maschi, l’aberrazione è spesso
legata, oltre che all’infertilità anche alla bassa statura, tanto che negli anni è
stato ipotizzato che nella parte prossimale della regione eucromatica del
braccio lungo del cromosoma Y sia presente un gene di controllo della
crescita denominato GCY. La crescita lineare nell’uomo è un processo
dinamico, regolato da una moltitudine di differenti eventi molecolari che
insieme determinano l’altezza di una persona e che, pertanto, questo
carattere è un complesso carattere multifattoriale. Nell’uomo, tuttavia, gli
individui di sesso maschile sono generalmente più alti di quelli di sesso
femminile e quindi sul cromosoma Y deve essere presente un gene che
controlla o comunque influenza l’altezza. L’ipotesi è anche supportata dal
fatto che donne XY sono più alte delle donne XX, che maschi XY sono a
loro volta più alti dei maschi XX, che maschi XYY siano più alti di quelli
XY . Ulteriori conferme vengono dalla letteratura, come il caso descritto da
Spranger S. et al 1997, di una donna con delezione della regione PAR1 a
seguito di una traslocazione X/Y, e quindi con perdita del gene SHOX, che
però mostrava, contrariamente all’attesa, un’altezza normale. L’autore in
base al punto di rottura del cromosoma Y in q11.2 ipotizza una
compensazione della perdita di SHOX con il mantenimento
GCY. Si
ritiene che almeno tre parametri influenzino l’altezza finale di un soggetto
che abbia una aberrazione del cromosoma Y, il numero di copie del gene
37
SHOX, il mosaicismo con la linea cellulare 45,X e la presenza/assenza
della regione Yq11
Il gene GCY che, così come del resto il gene SHOX sarebbe in grado di
modificare l’espressione dell’altezza di 7 – 10 cm, non è ancora stato
mappato con precisione, anche se sempre più si sta restringendo l’intervallo
della regione cromosomica interessata. Il problema nasce dal fatto che i
casi descritti di delezione del braccio lungo del cromosoma Y presentano
punti di rottura molto diversi fra loro e che quelli che riguardano la regione
prossimale, che è la regione in cui il gene sarebbe presente, sono pochi e
spesso il fenotipo è influenzato da altro, inoltre non sempre è semplice
identificare la diminuzione di 7-10 cm in uomini ai limiti bassi della curva
di crescita in relazione alla popolazione di appartenenza. Infatti fino al
2000, quando Kirsch S., restrinse la regione interessata ad un intervallo di
2Mb molto prossima al centromero fig. 6, poi (2002) ulteriormente
circoscritta dallo stesso autore ad un intervallo di 700 kb fig. 7, la regione
candidata aveva una estensione di 4,5 Mb. La precisa localizzazione potrà
venire solo dallo studio dei casi che presentano una delezione della parte
molto prossima al centromero, ancor meglio se interstiziale, casi purtroppo
che in letteratura sono molto rari, ad oggi nel mondo ne sono noti solo due,
tre.
38
Fig. 6: Possibile localizzazione del gene GCY nella regione prossimale Yq11
(S.Spranger, 1997).
39
40
La regione circoscritta nell’intervallo dei marker SKY8 e sY83 (Kirsch S.
et al 2002) non contiene nessun gene noto né alcun ESTs specifico dell’Y,
pertanto viene ipotizzata per questo gene una struttura inusuale ad esempio
un gene formato da un unico esone o un gene la cui espressione sia
estremamente ristretta nel tempo o nello spazio o possa rappresentare una
regione di controllo trascrizionale .
Il caso di delezione del braccio lungo del cromosoma Y da noi riportato,
presenta un apparente ipogonadismo, che andrà valutato nel tempo, così
come la sua fertilità, presenta però associato un importante ritardo di
crescita 1° centile (- 2.8 DS, 143 cm), dovuto a nostro avviso al punto di
rottura in Yq11.1, molto prossimo al centromero come dimostrato dallo
studio citogenetico in FISH.
Il nostro caso, oltre che essere la terza traslocazione descritta di Y/21,
rappresenta quindi uno di quei rari eventi che, da una parte confermano i
dati di Kirsch ma permetteranno anche una migliore definizione della
regione di intervallo critico per il mappaggio del gene GCY o della regione
di controllo trascrizionale .
Le review effettuate ci inducono, comunque, ad azzardare un’ulteriore
ipotesi circa la natura della regione di controllo della statura, e che potrebbe
essere un tratto di DNA regolativo piuttosto che un gene
41
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