Borsa di studio - Associazione OFFICIUM

Identificazione e caratterizzazione di batteriofagi ad ampio spettro d’azione contro
Pseudomonas aeruginosa, con potenziale terapeutico per le infezioni batteriche
polmonari in pazienti con fibrosi cistica.
Rationale
Nei pazienti affetti da Fibrosi Cistica (FC), le infezioni polmonari sono la principale causa di morbidità e mortalità. In
particolare, Pseudomonas aeruginosa, per la sua peculiare attitudine a formare a livello del tratto respiratorio FC biofilm,
è uno dei patogeni estremamente difficile da eradicare. Nella continua ricerca di nuove strategie terapeutiche, è
particolarmente convincente la possibilità di utilizzare i batteriofagi (o fagi), virus che infettano specificatamente le
cellule batteriche,direttamente come agenti antibatterici o come adiuvanti della terapia antibiotica per trattare le infezioni
polmonari sostenute da questo patogeno.
Scopo principale di questo Progetto di Ricerca è individuare e caratterizzare nuovi fagi con attività litica nei confronti di
Pseudomonas aeruginosa al fine di definire le loro potenzialità per un eventuale uso nel trattamento di infezioni
sostenute da questo patogeno. Lo studio prevede la collezione, a partire da campioni di acque e dall’espettorato di
pazienti FC, di una serie di fagi litici, i quali saranno successivamente classificati per la loro capacità di uccidere
rapidamente ceppi di Pseudomonas aeruginosa isolati da pazienti FC. I fagi più promettenti saranno saggiati per la loro
capacità sia di attaccare e distruggere biofilm batterici, sia di prevenire e/o curare infezioni da P. aeruginosa in modelli
animali. I risultati di questo studio possano fornire delle informazioni importanti per il futuro sviluppo di cocktail di fagi
idonei per la terapia fagica delle infezioni da Pseudomonas aeruginosa in pazienti affetti da FC.
OBIETTIVI
Gli obiettivi specifici dello studio sono :
1. Isolare nuovi fagi P. aeruginosa-specifici in campioni ambientali e clinici.
La ricerca di fagi litici attivi contro P. aeruginosa verrà effettuata sia in campioni di acque (5 campioni raccolti in diverse
aree geografiche della nostra Regione e negli scarichi del nostro Ospedale) sia nell’espettorato di 10 pazienti FC con
infezione intermittente e cronica da Pseudomonas aeruginosa, utilizzando come batteri ospiti i ceppi di riferimento PAO1
e PA14, il cui genoma è stato completamente sequenziato, e isolati clinici di Pseudomonas aeruginosa. Abbiamo
ipotizzato di ottenere, in base all’abilità di formare placche con questi batteri “indicatori”, circa 10 fagi derivanti da
differenti sorgenti.
2.Caratterizzare i fagi identificati a livello molecolare, morfologico e funzionale.
Ciascun fago verrà caratterizzato per genoma mediante tecniche di pyrosequencing (454 Roche); l’osservazione al
microscopio elettronico a trasmissione (TEM) verrà utilizzata per la caratterizzazione morfologica dei fagi, mentre la
caratterizzazione funzionale verrà condotta attraverso la valutazione della durata del ciclo litico (curve di crescita “onestep”),
3. Determinare l’attività anti-biofilm dei fagi caratterizzati
I fagi di interesse verranno inoltre testati in vitro per la loro abilità a distruggere biofilms preformati di PAO1 e di
selezionati ceppi clinici di Pseudomonas aeruginosa fago-sensibili sia su superfici abiotiche (plastica) che su cellule
IB3-1, una linea cellulare derivata da cellule epiteliali bronchiali di un paziente FC.
4. Determinare lo spettro di attività litica dei fagi identificati
La capacità litica dei fagi identificati verrà testata utilizzando una collezione di 50 ceppi clinici di Pseudomonas.
aeruginosa, con diverso morfotipo, isolati da pazienti FC in fallow-up presso l’Ospedale Bambin Gesù. I fagi saranno
classificati sulla base del loro profilo litico e della cellula batterica ospite; i batteriofagi che esprimono attività litica
superiore e ampio spettro d’azione contro Pseudomonas aeruginosa saranno utilizzati in studi preclinici in modelli
cellulari ed animali.
STATO ATTUALE DELLE CONOSCENZE
I batteriofagi o fagi sono virus che infettano i batteri e, nel caso dei fagi litici, ne determinano la morte. Subito dopo la
loro scoperta, agli inizi del 1900, fu proposto l’uso di batteriofagi per trattare infezioni batteriche in ambito umano. Nel
corso degli anni, questa pratica si sviluppò e si implementò soprattutto nei Paesi dell’Europa dell’Est e in alcuni Istituti
dell’ex Unione Sovietica (Eliava Institute, Tblisi, Georgia; Hirzfield Institut, Polonia). L’avvento degli antibiotici decretò la
fine di questo approccio terapeutico nella medicina occidentale; attualmente la terapia fagica è autorizzata in Russia, in
Georgia e, negli ultimi tempi,anche in Polonia, dove preparazioni di fagi sono disponibili in farmacia.
Recentemente, soprattutto in seguito all’emergenza di batteri resistenti agli antimicrobici, è stato osservato un rinnovato
interesse per il potenziale terapeutico dei batteriofagi. L’efficacia di fagi specifici per patogeni umani è stata testata in
modelli animali e risultati incoraggianti sono stati ottenuti in infezioni sostenute da ceppi multi-resistenti di
Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecium ,Escherichia coli O157:H7 e Acinetobacter
baumannii (Gorski et al.2009; Maura e Debarbieux 2011). In pazienti sofferenti per otite cronica da Pseudomonas
aeruginosa è stato condotto un trial di fase II, in accordo con la normativa europea (Whright et al.2009).
Altri studi hanno descritto il potenziale terapeutico dei fagi per trattare infezioni batteriche polmonari in modelli animali. In
un modello murino di infezione acuta polmonare da Burkholderia cenocepacia, la somministrazione intraperitoneale di
batteriofagi specifici ha determinato una significativa riduzione della carica microbica e dei fenomeni infiammatori
associati. (Carmody et al.2009). Ulteriori incoraggianti osservazioni sono state ottenute in un modello animale di
infezione polmonare acuta da un isolato clinico FC di Pseudomonas aeruginosa (Debarbieux et al.2013; Morello et
al.2011). In particolare, è stato dimostrato che la somministrazione intranasale di un cocktail di fagi preservava l’animale
pre-trattato dall’infezione e riduceva la mortalità degli animali infetti.
Complessivamente, le evidenze disponibili sono un forte incentivo per la identificazione e la caratterizzazione di nuovi
fagi al fine di ottimizzare un cocktail fagico con potenziale terapeutico per il trattamento di infezioni polmonari.
RISULTATI ATTESI
I risultati attesi del presente Progetto di Ricerca sono:
a) una collezione di batteriofagi con attività litica nei confronti di Pseudomonas aeruginosa (PAO1 e PA14) provenienti
da differenti ecosistemi e da campioni clinici.
Nella prospettiva di una possibile applicazioni clinica, una raccolta di fagi rappresenta un patrimonio con alto valore
scientifico. E' ben nota la capacità dei fagi di adattarsi rapidamente alla popolazione batterica ospite. Questo elevato
potenziale evoluzionistico potrebbe essere sfruttato per selezionare fagi che hanno come target l'agente etiologico di
uno specifico processo infettivo. Una modalità relativamente semplice per ingegnerizzare un fago terapeutico consiste
nel "training" in vitro (Pirnay et al. 2012). Questa procedura, che possiamo definire come una forma di evoluzione
sperimentale, già usata, ad esempio, nell'allestimento di un vaccino, prevede passaggi seriali del batteriofago sulla
popolazione ospite. Questo approccio permetterà di ottenere un fago con elevata capacità infettante nei confronti
dell'ospite utilizzato nell'interazione. Possiamo ipotizzare che il fago ingegnerizzato abbia il potenziale per essere usato
per la disinfezione delle superfici negli ambienti di cura oppure somministrato preventivamente nei soggetti a rischio nel
corso di una epidemia, con un minor rischio di resistenza batterica se comparato ai metodi convenzionali.
b) identificazione e caratterizzazione di 5 diversi tipi di batteriofagi con un ampio spettro d'azione nei confronti di ceppi
clinici di Pseudomonas aeruginosa, isolati dalle secrezioni respiratorie di pazienti FC italiani.
La caratterizzazione a livello molecolare, strutturale e funzionale è il presupposto fondamentale per l'uso dei fagi
selezionati come agenti terapeutici. I fagi saranno inoltre classificati per la loro abilità ad alterare biofilms strutturati di
Pseudomonas aeruginosa ed uccidere le cellule batteriche all'interno dei biofilms. Questo aspetto non è stato mai
investigato in precedenza, sebbene sia noto che nella colonizzazione cronica del polmone FC, Pseudomonas
aeruginosa vada incontro ad uno switching fenotipico cosiddetto mucoide che rende il patogeno resistente sia
all'azione degli antimicrobici che al sistema immune dell'ospite.
RICADUTE CLINICHE ATTESE
Focus del presente Progetto è lo sviluppo di una terapia fagica per trattare le infezioni da Pseudomonas aeruginosa,
principale causa del declino della funzionalità polmonare e di mortalità in pazienti FC. Il rationale è basato sulla nozione
che la terapia fagica può rappresentare una valida alternativa per trattare infezioni batteriche recalcitranti alla
convenzionale terapia antimicrobica, come dimostrato in modelli animali di infezione polmonare da Pseudomonas
aeruginosa. Inoltre, è anche noto che affinchè la terapia fagica verso una specifica infezione batterica abbia successo, è
cruciale ottimizzare il cocktail fagico. Il cocktail "ideale" consiste in batteriofagi con attività litica nei confronti di un range
ampio di ceppi appartenenti a una determinata specie microbica (e.g. varianti fenotipiche di Pseudomonas aeruginosa),
abili a raggiungere e uccidere i batteri nel sito di infezione e, se possibile, a riconoscere recettori differenti sulla
superficie batterica, al fine di ridurre la probabilità di comparsa di mutanti fago-resistenti. E' anche da considerare,
inoltre, che la situazione epidemiologica è differente da paese a paese in termini di batteri e fagi circolanti. Pertanto la
composizione del cocktail fagico deve essere continuamente verificata ed aggiornata per combinarsi con il ceppo
dominante in una determinata area geografica ed essere anche attivo nei confronti di ceppi batterici emergenti. Alla luce
di queste considerazioni, la identificazione e caratterizzazione di fagi con attività litica nei confronti di ceppi di
Pseudomonas aeruginosa isolati dalle secrezioni respiratorie di pazienti FC è il primo step per l'allestimento di un
cocktail fagico con potenziale terapeutico per il trattamento " personalized" delle infezioni polmonari.
Piano sperimentale del 1° anno di Dottorato
1. Identificazione di nuovi batteriofagi litici per Pseudomonas aeruginosa da campioni ambientali e clinici (mesi 1 -7)
Con l'obiettivo di isolare fagi da differenti aree geografiche, verranno prelevati 5 campioni di acque da diversi ecosistemi.
Più precisamente, 2 prelievi verranno effettuati nel fiume Arrone, mentre altri 3 verranno raccolti dalla rete fognaria del
nostro Ospedale. Per l'isolamento dei fagi, appropriate diluizioni dei campioni, dopo filtrazione attraverso filtri con pori
del diametro di 0.45 µm, verranno cimentate con i batteri ospiti PAO1, PA14 e 6 isolati clinici appartenenti alla
Collezione del Laboratorio di Microbiologia della Fibrosi cistica dell’Ospedale. Attraverso almeno 3 passaggi seriali in
una soluzione tampone, i batteriofagi della zona di lisi verranno purificati; la collezione dei fagi ottenuti sarà conservata a
4°C. Una aliquota sarà congelata a -80°C. Per ottenere fagi da pazienti FC, aliquote di 10 campioni di espettorato di
pazienti con infezione polmonare da Pseudomonas aeruginosa intermittente o cronica, dopo diluizione, centrifugazione
e filtrazione, verranno "spottate" su uno strato di batteri ospiti PAO1 e PA14. I fagi delle zone di lisi (placche) verranno
purificati secondo la procedura descritta in precedenza e conservati per ulteriori analisi.
2.Caratterizzazione dei fagi selezionati (mesi 8-11)
Ciascun fago verrà caratterizzato per genoma mediante tecniche di pyrosequencing (454 Roche). Il DNA fagico verrà
preparato seguendo le procedure standard. La caratterizzazione funzionale verrà condotta attraverso la valutazione
della durata del ciclo litico (curve di crescita “one-step”),mentre l’osservazione al microscopio elettronico a trasmissione
(TEM) verrà utilizzata per la caratterizzazione morfologica dei fagi selezionati.
3.Determinazione dell'attività anti-biofilm dei fagi di interesse (mesi 11-12)
I fagi di interesse verranno inoltre testati in vitro per la loro abilità a distruggere biofilms preformati di PAO1 e di
selezionati ceppi clinici di Pseudomonas aeruginosa fago-sensibili su superfici abiotiche (polistirene) .
Attività da programmare per il 2° e 3° anno di ricerca
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Training dei fagi caratterizzati
L’efficacia dei fagi, dopo passaggi consecutivi in colture liquide con diversi fenotipi (mucoide, sfrangiato,puntiforme,
rugoso) di Pseudomonas aeruginosa, sarà valutata e comparata con l’efficacia osservata nei confronti di PAO1.
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Determinazione dell'attività litica dei fagi “trained”
Lo spettro dell'attività litica dei fagi “trained” verrà determinato utilizzando una collezione di 70 ceppi clinici di
Pseudomonas aeruginosa isolati da pazienti in follow-up presso il Centro FC del nostro Ospedale (5 microlitri di ogni
sospensione virale verranno distribuiti sullo strato di ogni batterio ospite). I fagi saranno classificati per capacità litica e
range dell'ospite.
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Determinare l’efficacia di un set di batteriofagi (cocktail) con dimostrata attività litica verso Pseudomonas
aeruginosa nei confronti di secrezioni respiratorie (sputo) di selezionati pazienti con FC.
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Studi preclinici in modelli cellulari