relazione secondo anno

REGIONE LIGURIA
ASSESSORATO
AGRICOLTURA E TURISMO
Trasferimento e dimostrazione nella realtà operativa dell’uso di saggi
diagnostici rapidi per l'applicazione di adeguate strategia di difesa contro
le infezioni di tospovirus (TSWV e INSV) e tobamovirus (ToMV) su
specie ornamentali e orticole
Regolamento CE n. 1257/1999
Misura c (3) Formazione Professionale - sottomisura 3.3 “Progetti dimostrativi”
RELAZIONE SECONDO ANNO
ANNO 2002
Introduzione
Le produzioni floricole e orticole appaiono oggi di fondamentale importanza nella realtà produttiva
ed economica Ligure. Numerosi, però, possono essere gli ostacoli di tipo tecnico che la loro
coltivazione incontra. Il rischio di presenza di infezioni virali è, a tale riguardo, di grave attualità,
causando, spesso, danni non solo in fase avanzata di produzione, ma già a partire dal materiale
propagativo che può risultate infetto già in vivaio o nelle prime fasi di coltivazione in campo. In tali
condizioni operative appare di grande importanza poter disporre di metodi diagnostici rapidi e
efficienti in grado di permettere una rapida conoscenza dello stato fitosanitario della coltura almeno
per quanto riguarda la presenza di virus. Con il presente progetto si intende, pertanto, trasferire
nell'uso pratico un sistema diagnostico rapido in grado di permettere il rapido riconoscimento di
infezioni di due temibili e diffusi tospovirus (TSWV e INSV) e di ToMV, anch'esso dannoso e
diffuso sulle colture liguri.
Occorre, infatti, rammentare che ad oggi contro i virus delle specie vegetali estremamente limitati
sono i sistemi di lotta applicabili. Ad esclusione, infatti, di alcuni esempi di utilizzo di mezzi
genetici di lotta (ovvero impiego di selezioni resistenti di specie vegetali, peraltro di complessa se
non impossibile applicazione nei settori della floricoltura ligure a causa della elevata variabilità di
specie vegetali utilizzate e della orticoltura ligure a causa dell'impiego di selezioni orticole locali di
ridotta importanza nel panorama cultivarietale nazionale), la difesa nei confronti delle virosi si basa
essenzialmente su attività di tipo preventivo a cui il sistema oggetto dell'attività di progetto
appartiene.
Sempre più pressanti e generalizzate appaiono, peraltro, le richieste del mercato delle specie da
orticole e floricole prodotte con tecniche a basso impatto ambientale e, in particolare, realizzate con
un ridotto e ragionato impiego di mezzi di difesa chimici. La lotta a numerosi virus, purtroppo,
viene spesso effettuata mediante una lotta talora non troppo ragionata verso potenziali vettori
animali. Certamente, però, il riconoscimento delle infezioni virali nelle prime fasi potrebbe
permettere non tanto la razionalizzazione degli eventuali interventi, quanto, soprattutto, una
migliore attività preventiva basata su strategie agronomiche che tendano ad escludere il rischio
infettivo. In particolare, il riferimento non è solo alla adozione di tecniche che permettano la
eliminazione degli ospiti infetti man mano che essi si rendono manifesti, ma soprattutto è riferito
alla possibilità di controllo del materiale propagativo che potrebbe essere effettuato in fase
preliminare rispetto alla messa a dimora in campo. Partire da materiale sano, infatti, è la prima
preoccupazione che il coltivatore dovrebbe avere al fine di garantire il buon esito della coltura. In
particolare il riferimento è a molte specie vegetali auto prodotte dai coltivatori (dimorfoteca, agatea,
margherita, crisantemo, alcune selezioni locali di pomodoro, etc.) in condizioni di sanità non
sempre eccellente per quanto riguarda i virus. Successivi controlli sulla sanità delle piante in
coltura, comunque, appaiono determinanti soprattutto in quei casi ove determinante è questo tipo di
conoscenza per decidere sulla tecnica di gestione agronomica generale da mantenere o sulla
convenienza alla eliminazione o al mantenimento della coltura stessa. per quei virus caratterizzati.
In tale panorama il rischio connesso alla presenza di infezioni dei tospovirus Tomato spotted wilt
virus (TSWV) e Impatiens necrotic spot virus (INSV) e del tobamovirus Tomato mosaic virus
(ToMV) appare spesso particolarmente grave.
I due tospovirus sono stati ritrovati in Liguria agli inizi degli anni 90 e l’elenco di specie orticole ed
ornamentali ritrovate infette è estremamente elevato, interessando la maggior parte delle specie
coltivate. La loro pericolosità deriva dalla loro vastissima gamma di piante ospiti che include circa
1000 specie appartenenti ad almeno 70 famiglie e dall’elevata efficienza di trasmissione del loro
principale vettore, il tripide Frankliniella occidentalis, estremamente polifago e di difficile
controllo con insetticidi. Gravi danni continuano a verificarsi in specie orticole quali il peperone e il
pomodoro e in svariate specie ornamentali quali crisantemo, gerbera, ciclamino e come riportato
recentemente anche in margherita. Questi virus sono inoltre soggetti alla specifica normativa di
legge che impone severi controlli per il materiale vivaistico prodotto dalle aziende.
Discorso a parte è quello relativo al tobamovirus ToMV. Si tratta di un virus che nelle condizioni
naturali infetta soltanto il pomodoro producendo gravi danni quali riduzione dello sviluppo delle
piante, maculature e necrosi dei frutti. ToMV non ha artropodi vettori noti eccetto una trasmissione
in pomodoro con insetti impollinatori ma è altamente infettivo per cui viene diffuso con estrema
facilità durante le operazioni colturali, rimane nel suolo per lungo tempo e può contaminare le
strutture delle serre. In pomodoro è inoltre trasmesso per seme. Tale virus rappresentava uno dei
maggiori problemi virologici del pomodoro negli anni 70, superato in parte con l’uso di cv resistenti
anche se sono stati successivamente ritrovati nuovi patotipi in grado di infettare le piante resistenti.
Negli ultimi anni il Liguria si è nuovamente diffusa la coltura di selezioni locali di pomodoro
estremamente pregiate e redditizie tipo Cuore di bue ma anche molto suscettibili al virus. Sempre
più frequenti sono i danni prodotti dal virus, tali da rendere non più commerciabili i frutti.
Parallelamente si è diffusa la pratica dell’innesto per ovviare a problemi di patogeni tellurici; alcuni
dei portainnesti più validi sono resistenti al virus e fenomeni di collasso delle piante potrebbero
essere dovuti all’infezione del virus.
Al fine di verificare la sanità delle colture la semplice analisi visiva della sintomatologia non è
sufficiente in quanto le infezioni virali possono essere confuse con altre patologie o fattori abiotici.
Una diagnosi accurata è pertanto necessaria. Per questi tre differenti virus sono oggi utilizzati saggi
diagnostici di laboratorio, essenzialmente di tipo sierologico come la tecnica immunoenzimatica
ELISA. Tale tecnica richiede una discreta attrezzatura di laboratorio, oltre a personale
sufficientemente addestrato. I risultati si ottengono generalmente dopo due giorni dal ricevimento
del campione in laboratorio. Tale tecnica è stata utilizzata ampiamente presso l’Istituto di
Fitovirologia Applicata nel corso delle indagini effettuate in Liguria, valutando accuratamente la
validità degli antisieri utilizzati, anche prodotti specificamente con isolati locali dei virus.
Sulla base delle informazioni sopra riportate appare, quindi, evidente che i tempi di attesa e gli
aspetti prettamente logistici delle verifiche diagnostiche (prelevamento del campione,
conservazione, spedizione al laboratorio, etc…..) sono fortemente limitanti e penalizzanti, anche in
termini di costi finali. Con questo progetto dimostrativo si è voluto illustrare, pertanto, agli
agricoltori una innovazione assoluta nel settore della diagnosi "di campo" dei tre virus sopra citati.
Si tratta di sistemi diagnostici rapidi messi a punto dall'Istituto di Fitovirologia Applicata del C.N.R.
di Torino in grado di azzerare, o comunque di ridurre fortemente, tutte quelle fasi precedentemente
indicate (prelevamento del campione, conservazione, spedizione al laboratorio, ritorno in azienda
per comunicare, etc…..). Questo tipo di test, introdotto per la prima volta nel 1988 per la diagnosi di
stati di gravidanza, è ora usato per la determinazione di moltissimi analiti in clinica umana e
veterinaria (ormoni, microrganismi, virus, marcatori tumorali e di stati d’infarto, droghe d’abuso).
Diversa la situazione in campo vegetale. I primi lavori su patogeni delle piante furono pubblicati nel
1992, seguiti nel 1997 da un’applicazione degli stessi metodi su virus delle orchidee. Nessuno di
questi test venne mai messo in commercio ma furono usati solo per scopi di ricerca. Nel 2000 fu
introdotto sul mercato un kit prodotto dal CSL, il laboratorio del Ministero dell’Agricoltura inglese,
aprendo una nuova strada alla diagnostica vegetale. Attualmente gli unici produttori di kit per i più
importanti virus vegetali sono lo stesso CSL e la ditta americana AGDIA.
Il vantaggio principale di tali saggi risiede nella loro estrema semplicità d’uso che non richiede
assolutamente attrezzature di laboratorio e nella rapidità della risposta, ottenuta dopo pochi minuti.
Per i virus delle piante solo una ditta americana ed una inglese hanno proposto questo tipo di
saggio, che tuttavia non è stato sufficientemente confrontato con altre metodiche ed inoltre è stato
prodotto con anticorpi specifici per patogeni che potrebbero essere differenti da quelli presenti in
Liguria. Altro fattore limitante è il prezzo estremamente elevato di vendita in Italia. L’uso di un
saggio di questo tipo ma prodotto con anticorpi di cui è nota la reattività verso i patogeni locali crea
la premessa indispensabile al suo uso, dopo opportuna verifica dell’affidabilità in confronto a
metodiche tradizionali. Presso l’IFA sono stati studiati questi saggi di tipo immunocromatografico e
prodotti artigianalmente. Sono stati utilizzati per il rilevamento di TSWV, INSV e ToMV in poche
specie di piante infettate sperimentalmente dimostrando la loro validità in termini di sensibilità
rispetto al tradizionale metodo ELISA. Premessa indispensabile al loro uso da parte di operatori non
specializzati del settore è la verifica della loro affidabilità in condizioni di campo in confronto al
rilevamento dei virus con la tecnica ELISA e l’istruzione del personale.. In particolare con i
tospovirus è da verificare il loro rilevamento in specie vegetali differenti.
L'attività dimostrativa, quindi, ha permesso una validazione delle possibilità applicative di tale
sistema diagnostico rapido innovativo permettendo di porre a confronto il sistema in oggetto con il
metodo ELISA, ordinariamente adottato a fini diagnostici, ma spesso troppo dispendioso e,
soprattutto, non applicabile direttamente in condizioni di campo. Tale attività di validazione è stata
effettuata sulla base delle esperienze di ricerca maturate dall'IFA e direttamente con l' apporto
tecnico e scientifico di tale struttura. Accanto al processo di validazione, è avvenuta la progressiva
diffusione della conoscenza della disponibilità di questi test; tale disponibilità, per due anni, quindi,
gratuita per agricoltori e tecnici, è stata particolarmente apprezzata dagli uni e dagli altri,
contribuendo a individuare problemi e situazioni a rischio, favorendone la tempestiva soluzione. In
questi termini il progetto ha avuto pieno successo e pieno sostegno da parte delle imprese e dei
professionisti operanti nel settore agrario.
Risultati conseguiti
I risultati conseguiti sono stati essenzialmente la diffusione della conoscenza e, quindi, l’uso di
questo tipo di tecnica diagnostica, attraverso la dimostrazione dell'applicabilità, la verifica della
affidabilità del risultato e l'illustrazione delle metodologie che devono essere adottate direttamente a
tecnici e coltivatori.
Questa iniziativa, unica in ambito regionale, ha rappresentato un momento di trasferimento
dell’innovazione da sfruttare per aumentare gli strumenti tecnici che i coltivatori possono impiegare
per la buona riuscita delle proprie coltivazioni, per il mantenimento della propria competitività sul
mercato europeo e per la riduzione dell'impatto ambientale anche in agricoltura convenzionale.
Le attività si sono basate sull’esecuzione e sulla dimostrazione pratica, in condizioni operative
ordinarie, di tecniche diagnostiche rapide applicate in parallelo a tecniche diagnostiche classiche
(ELISA), ma più complesse.
Sono stati invitati gli agricoltori e i tecnici, oltre che a partecipare agli incontri programmati, a
portare al laboratorio fitopatologico del CeRSAA campioni di piante sospettate di essere infette da
virus per poterle sottoporre a verifica rapida presso il laboratorio fitopatologico del CeRSAA stesso
e, successivamente, anche da quello virologico dell’IFA – CNR di Torino.
La raccolta dei dati ottenuti su campioni analizzati secondo tali due tecniche ha permesso di
stabilire il grado di confidenza dei test rapidi oggetto dell'attività dimostrativa, garantendo, pertanto,
il ragionato trasferimento. Il vantaggio indubbio è poter disporre di una tecnica direttamente
applicabile nelle condizioni operative riducendo al minimo i tempi di attesa precedentemente
necessari per l'esecuzione dell'analisi di laboratorio classica (ELISA).
La realizzazione di un protocollo operativo standard con il quale procedere alla verifica di analisi
con test rapido appare come procedura necessaria al fine di ridurre rischi di errori durante
l'applicazione del test.
Viste le caratteristiche del sistema rapido di diagnosi, i tempi di esecuzione estremamente contenuti,
la possibilità di applicazione diretta in condizioni di campo anche preventivamente alla
manifestazione dei primi sintomi delle citate alterazioni virali, detto sistema rapido si configura non
semplicemente come un sistema di diagnosi, ma anche quale fondamentale supporto decisionale per
la scelta della corretta strategia di difesa e gestione della coltura già a partire dalla fase di vivaio.
Tutta questa serie di conoscenze permetterà di poter sfruttare a pieno questi test rapidi oggi in fase
di iniziale commercializzazione, permettendo, inoltre, di sviluppare tra tecnici e coltivatori
conoscenze e capacità tecniche sull'uso di sistemi diagnostici di campo oggi non disponibili.
In sintesi, la tecnologia conosciuta come “lateral flow”, di tipo immunocromatografico, presenta
alcuni vantaggi di primaria importanza:
•
la semplicità di esecuzione, che ne fa un sistema alla portata di tutti e utilizzabile in qualunque
contesto;
•
i risultati sono immediati e di facile lettura;
•
i test sono stabili anche se conservati nelle condizioni più diverse;
•
i costi di produzione sono relativamente bassi.
Il procedimento produttivo
Il “lateral-flow” è un metodo immunocromatografico omogeneo e qualitativo: anticorpi virus
specifici sono immobilizzati su una membrana di nitrocellulosa a formare una linea perpendicolare
alla direzione di flusso; un reagente rivelatore (formato dagli stessi anticorpi coniugati su lattice o
su un metallo colloidale), è depositato ed essiccato su una fibra di vetro chiamata conjugate pad.
Quando il campione è deposto sull’apposito sample pad, rapidamente viene bagnato anche il
conjugate pad sottostante.
Il rivelatore viene risolubilizzato e comincia a diffondere lungo la membrana per capillarità. Se
l’analita è presente, allora verrà legato dagli anticorpi specifici del rivelatore, e appena il complesso
passa sulla linea degli anticorpi di cattura immobilizzati, verrà trattenuto secondo uno schema “a
sandwich”. Il colore si sviluppa con intensità proporzionale alla quantità di analita presente nel
campione. L’eccesso di particelle continua a migrare fino alla linea di controllo, di anti-anticorpi, e
formerà una seconda banda. Se questa linea non compare, il test non ha funzionato correttamente e
va ripetuto. Riassumendo, l’interpretazione dei risultati è estremamente facile: due linee colorate
corrispondono un campione positivo, una sola linea indica un campione negativo per quel virus
specifico.
Campione positivo
Campione negativo
Presso l’Istituto di Virologia Vegetale (IVV) del CNR di Torino, è stato sviluppato, inizialmente,
kit per la ricerca di Tomato mosaic virus (ToMV), Tomato spotted wilt virus (TSWV), Pepino
mosaic virus (PepMV) e Impatiens necrotic spot virus (INSV).
I due Tospovirus TSWV e INSV sono diffusi su tutto il territorio ligure e tra le centinaia di piante
ospiti segnalate a livello mondiale, quelle di maggior interesse per la Liguria sono la margherita, il
ciclamino, il crisantemo, la dimorfoteca, la gerbera, l’agatea, il peperone, il pomodoro e altre. Il
pomodoro, soprattutto la pregiata varietà Cuore di bue, è molto colpito da infezioni di ToMV. Il
PepMV non è invece stato ancora segnalato, ma una nota del Ministero dell’Agricoltura ne impone
il controllo.
Questi quattro virus sono stati oggetto delle attività all’interno del progetto dimostrativo, costituito
da due aspetti principali: la validazione della diagnosi e l’esposizione al pubblico.
Per quel che riguarda la prima parte, il lavoro è stato così organizzato: presso il CeRSAA di
Albenga venivano effettuate su campioni di campo le analisi con i test prodotti dal CNR per ToMV,
INSV, TSWV e PepMV. I risultati e i campioni stessi venivano poi inviati all’IVV, dove si
provvedeva ad eseguire sullo stesso materiale il saggio ELISA, scelto come metodo di riferimento. I
risultati ottenuti in questo modo sono stati assunti come veri e confrontati con quelli ottenuti con il
lateral flow. In alcuni casi dubbi è stato necessario confermare la diagnosi con tecniche di supporto
o alternative quali microscopia elettronica o inoculazione su piante indicatrici.
In tabella sono riportati i risultati del confronto tra ELISA e lateral flow. Con PDpos si indica la
predittività positiva, vale a dire la probabilità che ad un risultato positivo ottenuto con il lateral flow
corrisponda un effettivo stato di malattia. In altre parole, l’inverso della PDpos è la probabilità di
avere un falso positivo. Discorso analogo vale per la PDneg. La sensibilità indica invece quanti
campioni positivi sono stati determinati, rispetto al totale dei campioni infetti. Per INSV e PepMV
non è stato possibile calcolare alcuni valori per via del numero ridottissimo di campioni positivi.
TSWV
INSV
PepMV
ToMV
Numero di campioni
238
144
77
207
PDpos
92.2 %
Non calcolabile
Non calcolabile
98.6 %
PDneg
98.9 %
98.6 %
98.7 %
96.3 %
Sensibilità
88.7 %
Non calcolabile
Non calcolabile
93.4 %
Come si vede, l’attività ha dato risultati apprezzabili e importanti incentivi per il prosieguo del
lavoro. La tecnica lateral flow si è dimostrata precisa e affidabile, oltre che rapida, ed è quindi
auspicabile un suo utilizzo sempre più massiccio. I kit valutati in questi due anni sono ora in
commercio, mentre la ricerca si è spostata verso lo sviluppo di test per i virus delle Cucurbitacae
(ZYMV, WMV-2, PRSV), per CMV, BCMV, per i virus dei fruttiferi (CTV, CPsV, PDV, PPV,
ApMV, ACLSV, PNRSV), per TYLCV. Per ognuno di questi sistemi è decisamente auspicabile
un’analoga validazione rispetto ad altri metodi. Un ulteriore passo avanti potrebbe infine essere
rappresentato da un multi-test per la diagnosi simultanea di più virus patogeni.
L’aspetto divulgativo del progetto dimostrativo si è invece svolto interamente presso la sede del
CeRSAA di Albenga ed è consistito nell’esecuzione di piccole prove dimostrative di campo e
nell’esporre a tecnici, coltivatori, ricercatori del settore e studenti delle scuole medie superiori e
universitari, i principi teorici della tecnologia e l’illustrazione pratica delle modalità d’impiego del
test. Il riscontro del pubblico è stato positivo: la buona affluenza agli incontri e l’interesse partecipe
riscontrato in tali occasioni, dimostrano come i vantaggi di questa tecnologia siano innegabili,
evidenti e condivisi da tutti. In tal senso, l’obiettivo è di poter continuare in questa necessaria opera
di promozione, al fine di rendere sempre più comune l’utilizzo dei kit rapidi di diagnosi.
Concludendo, si può affermare che i vantaggi di questa attività siano biunivoci: da una parte è stato
possibile, con una massiccia attività su campioni di campo, confermare il buon funzionamento della
tecnica lateral flow, sia in termini di affidabilità che di rapidità; dall’altro, gli operatori del settore
sono venuti, per la prima volta in Italia, in contatto con questa nuova tecnologia, apprezzandone i
pregi e imparandone l’utilizzo.
Una comunicazione orale su parte di questo lavoro è stata presentata al IX Convegno Nazionale
SIPaV, tenutosi a Roma l’1-2 ottobre 2002 sul tema “Innovazioni in Patologia Vegetale”. Si allega
copia del riassunto.
CONFRONTO TRA LATERAL FLOW E ELISA PER LA DIAGNOSI DI
TOMATO MOSAIC VIRUS IN POMODORO
Alberto Salomone1, Cinzia Bruzzone2, Giovanni Minuto2, Andrea Minuto3 and Piero
Roggero1,*. 1Istituto di Virologia Vegetale, CNR, Str delle Cacce 73, 10135 Torino, Italy; Fax:
+39011343809; e-mail [email protected] 2Ce.R.S.A.A.-C.C.I.A.A di Savona, Albenga (SV),
3
Di,Va.P.R.A. –Patologia Vegetale, Università di Torino, Torino.
L’infezione del tobamovirus Tomato mosaic virus (ToMV) è uno dei più gravi problemi virologici
per la coltivazioni di cultivar di pomodoro non resistenti a questo virus. L’elevata infettività, la
facilità di trasmissione durante le operazioni colturali e per seme, rendono indispensabile una
diagnosi tempestiva per ridurre il danno. La sola analisi sintomatologica di foglie e frutti è
inaffidabile. Attualmente la tecnica di laboratorio più usata è l’ELISA, ma i risultati si ottengono
solo dopo alcuni giorni. Il Lateral Flow (LF) è una nuova tecnica rapida e di campo, che permette
la diagnosi di un virus in pochi minuti e senza alcuna attrezzatura particolare. Abbiamo messo a
punto test LF per ToMV utilizzando anticorpi policlonali coniugati su oro colloidale e per attivare
le membrane di nitrocellulosa; successivamente abbiamo confrontato i risultati ottenuti con quelli
del test ELISA, analizzando in parallelo gli stessi campioni. Il sistema LF permette il rilevamento
del virus in foglie, frutti e semi di pomodoro; il limite di rilevabilità è solo leggermente più elevato
dell’ELISA. Negli ultimi due anni sono stati analizzati 180 campioni di pomodoro, prima
direttamente in campo con LF e dopo in laboratorio con l’ELISA: sono stati ottenuti gli stessi
risultati su 66 campioni positivi e 109 negativi, mentre in 5 casi si è avuto un risultato positivo in
ELISA e negativo in LF. In conclusione, il LF sembra essere un’affidabile tecnica di campo per la
diagnosi di ToMV in pomodoro, fornendo risultati simili all’ELISA ma in tempo reale,
permettendo così decisioni più rapide per la coltivazione delle piante.