National Sanitariy Gathering of Studies
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Leishmaniosi
Utilizzo dell’associazione di Enrofloxacin
(Baytril) e Metronidazolo nella cura della
leishmaniosi del cane.
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Capitolo
1
introduzione
Eziologia e ciclo biologico
La Leishmania è un protozoo appartenente alla Famiglia dei Trypanosomatidae.(24)
Inizialmente le specie rilevate erano tre: la Leishmania Braziliensis presente soprattutto in
America latina e ritenuta responsabile della patologia muco-cutanea; la Leishmania Tropica
accertata in Medio-Oriente, in nord-Africa, in Russia ed in Grecia, agente della Leishmaniosi
cutanea ; la Leishmania Donovani presente in Oriente, Asia, Africa e Russia, causa della
forma viscerale della malattia. Successivamente nuovi studi classificarono il ceppo Chagasi
presente in America latina ed il ceppo Infatum presente nell'Europa. Quest'ultima
probabilmente è l'unica responsabile della Leishmaniosi nel nostro paese.
1)
Oggi, la forma viscerale e cutanea della parassitosi sono considerate stadi evolutivi di
una medesima malattia nel cane, mentre nell'uomo le due forme sono distinte. Il
parassita è presente in natura in tre diversi stadi:
2)
L' Amastigote presente nell'ospite vertebrato (cane , alcuni mammiferi e uomo) in
localizzazione endocellulare, di forma rotondeggiante od ovoidale di 2-5 micron di
diametro senza flagello;
3)
la forma Promastigote si trova invece nell'insetto vettore in forma libera ed è
caratterizzata da un lungo flagello libero, il corpo è allungato e può raggiungere i 15
micron;
4)
la Paramastigote è un ulteriore forma del ciclo nell'ospite vettore. Il parassita presente
nella saliva dell'insetto ematofago in forma di promastigote penetra nel sangue
dell’ospite vertebrato attraverso la puntura dell’insetto. Raggiunto il circolo sanguigno
2
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.. fagocitato dai macrofagi. In ambito cellulare si compie la trasformazione del
viene
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protozoo dalla forma promastigote alla forma amastigote. Quindi si ha un forte
(24)
replicazione degli amastigoti per scissione binaria, fino alla rottura della cellula ospite. Gli
amastigoti liberi nel sangue vanno a parassitare altre cellule macrofaghe invadendo così
l'organismo.
5)
Il ciclo si compie allorché il flebotomo (pare che sia solo la femmina a pungere...)
attraverso un pasto di sangue infetto (Volf P. and Rohousova I. 2001), introduce nel suo
intestino la Leishmania amastigote che in 30 ore circa compie la trasformazione in
promastigote, si riproduce, e in 3-15 giorni migra nell'apparato buccale dell'insetto ed è
pronta a reinfestare nuovi ospiti.
Tabella 1 : Ciclo vitale della Leishmania
Patogenesi nel cane
Quando penetra nell’organismo la Leishmania stimola la reazione del sistema
immunocompetente. Alcune volte si può avere una neutralizzazione subitanea del parassita.
Oppure si stabilisce un temporaneo stato di equilibrio tra agente aggressivo e sistema
immunitario, in cui la Leishmania allo stato latente è pronta a infestare l'organismo ad un
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minimo.cedimento delle difese immunitarie. Ma spesso, essendo proprio le cellule deputate
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alla fagocitosi ad essere parassitate, la malattia prende facilmente il sopravvento, in quanto il
protozoo resiste all'interno della cellula ai sistemi enzimatici difensivi del macrofago. Il
continuo stimolo dell'antigene parassitario sul sistema immunitario turba seriamente
l'equilibrio umorale, si ha una iperproduzione di anticorpi che però non riesce a distruggere il
parassita.Questa disfunzione è alla base dei processi patologici della malattia.
Tabella 2 : Ciclo del parassita all’inteno dei macrofagi e ospiti recettivi
Una delle principali alterazioni che s'instaurano è una grave alterazione del quadro sieroproteico, con aumento della protidemia totale, con riduzione delle albumine e aumento delle
gammaglobuline Il rapporto tra queste due proteine plasmatiche, che nei cani sani si aggira
intorno ad 1, nei soggetti ammalati scende a valori di 0,1 e 0,45. La verifica di questo valore
è un dato importante ai fini diagnostici. Altro grave problema è la formazione di
immunocomplessi dovuta alla unione di un antigene solubile con un anticorpo precipitante.
La precipitazione può avvenire in tutti i distretti organici, ma con maggiore frequenza gli
organi colpiti sono il rene (glomeruli), l'occhio (uvea) , le membrane sinoviali e la cute. Tale
situazione determina un’attivazione degli agenti flogogeni e la liberazione di anafilotossine
con gravi danni tissutali e scompensi funzionali. Si osservano inoltre granulomatosi diffusa,
amiloidosi, e una grave immunodepressione. Tutte le cellule del sistema reticolo-endoteliale
sono parassitate.
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Sintom atologia
. clinica
Il periodo d'incubazione può variare da 1 mese sino a 3 anni e oltre. L'età dei soggetti
colpiti varia da uno a undici anni, con una percentuale maggiore dei cani di età
compresa tra i 4 e i 6 anni. La sintomatologia è molto varia e il decorso è normalmente
subacuto-cronico. E' stata rilevata anche una rara forma acuta della Leishmaniosi che
colpisce i cani giovanii ed è accompagnata da febbre alta, tremori diffusi, con esito
fatale dopo pochi giorni. I primi sintomi classici dell'infezione sono dati da una perdita di
vivacità del cane, dimagrimento, facile affaticamento, aspetto emaciato, atrofia delle
masse muscolari con maggiore evidenza dei rilievi ossei, soprattutto a livello di bacino,
articolazioni e testa. Inoltre possono essere presenti, ma meno frequentemente: una
modesta febbre remittente, vomito, diarrea, zoppia (dovuta ad artriti prevalentemente
articolari), sete intensa e poliuria ( in caso di danno renale), epistassi, fotofobia e cecità.
L'epistassi è dovuta ad una riduzione del numero delle piastrine ed alla presenza di
erosioni della mucosa nasale.
In circa il 75% dei cani ammalati sono presenti le lesioni cutanee. A livello della pelle si
può avere una alopecia diffusa con cute ispessita e paracheratosica. A volte si ha solo
una forte desquamazione furfuracea, di aspetto amiantaceo refrattaria ad ogni
trattamento.
Tabella 3 : Infezione e lesioni cutanee tipiche in cordo di Leishmaniosi
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Nel 30 % dei soggetti colpiti sono presenti delle ulcere cutanee, soprattutto a livello
delle zampe, del muso e delle orecchie. In queste piaghe di aspetto crateriforme è
possibile isolare la Leishmania. E' possibile la presenza d'infiltrazioni granulomatose,
visibili come noduli cutanei, che richiamano le lesioni cutanee dell'uomo note come
bottone d'oriente. Più rara è la dermatite pustolosa a diffusione generalizzata. Un segno
molto probante di malattia, quando è presente, è l'onicogrifosi (allungamento delle
unghie), dovuto allo stato di flogosi della matrice ungueale. I sintomi a carico dell'occhio
talvolta rappresentano gli unici segni iniziali della malattia. Sono dovuti sia all'azione
diretta del parassita e sia alla formazione degli immunocomplessi precedentemente
menzionati. La dermatite esfoliativa secca sulla cute palpebrale del cane è un altro dei
segni caratteristici della Leishmaniosi. Essa è bilaterale e conferisce il classico aspetto,
descritto come cane con gli occhiali. Spesso si ha cherato-congiuntivite, uveite, irite che
portano alla formazione di un forte edema corneale, per cui l'occhio appare ricoperto da
uno strato opaco, biancastro, che va a nascondere completamente la pupilla. Edemi
sotto retinici sono responsabili del distacco della retina e della cecità del soggetto. La
reticolo-endotelite diffusa porta nel 90 % dei casi ad un aumento di volume degli organi
interessati. La palpazione dei linfonodi esplorabili soprattutto dei prescapolari e dei
poplitei e quindi l'apprezzamento della linfoadenomegalia è un altro fattore molto
importante da tenere in considerazione assieme a tutti gli altri segni, per una diagnosi
clinica. L'alterazione del Sistema Reticolo Endoteliale porta ad un aumento della attività
emo-cateretica e quindi ad una diminuzione del numero dei globuli rossi con
consecutiva anemia, apprezzabile anche all'esame ispettivo delle mucose. Quando
sussistono più sintomi tipici della malattia, la diagnosi di Leishmaniosi risulta
abbastanza agevole al clinico, senza dover utilizzare il laboratorio. Ma frequentemente,
la parassitosi decorre in forma subdola con uno o lievissimi sintomi che possono
soltanto far nascere il sospetto della patologia. In questi casi la conferma definitiva della
diagnosi ci verrà data dagli esami di laboratorio.
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Esam i diagnostici di laboratorio
Un aiuto alla diagnosi clinica, senza dover ricorrere ad esami specifici, può esserci dato
da un profilo generale ematologico. La diminuzione degli eritrociti e nel 50% dei casi
delle piastrine, l'aumento della VES, e l'aumento delle proteine totali con aumento delle
gammaglobuline e diminuzione delle albumine( valutazione del tracciato elettroforetico),
sono dati costanti in corso di Leishmaniosi. Nelle urine si rileverà la presenza di
proteinuria più o meno marcata. In caso di elevato danno renale si noterà un aumento
della creatinemia e della azotemia sierica. Ma per una diagnosi definitiva, occorre
senza dubbio avvalersi degli esami che mirano alla ricerca diretta della Leishmania o
dei suoi antigeni. Per la ricerca primaria del parassita si effettuano gli esami bioptici:
aspirazione ad ago sottile del linfonodo; biopsia midollare; biopsia cutanea
(impressione del derma); impressione diretta o per raschiamento di ulcere e granulomi.
Per la ricerca degli antigeni si adoperano i test sierologici: immunofluorescenza
indiretta; emoagglutinazione indiretta; ELISA; controimmunoelettroforesi; Dot ELISA.
Talvolta un singolo esame non basta a svelare la positività della malattia, per cui in
caso di forte sospetto di Leishmaniosi, occorre combinare più esami per un risultato di
certezza.
Tabella 4 : Valori clinici medi di un cane affetto da leishmaniosi
INTERVALLO DI RIFERIMENTO
min
max
(g/dT,)
Proteine Totali
(g/dl):
7.8
5.7
7.7
Albumina (%):
30.81
40.00
60.00
2.40
Globuline ALFA
(%):
13.77
11.50
22.20
1.07
Globuline ALFA1
(%):
3.11
1.50
4.20
0.24
Globuline ALFA2
(%):
10.66
10.00
18.00
0.83
Globuline BETA
(%):
30.84
18.00
27.00
2.41
Globuline BETA1
(%):
17.52
1.37
Globuline BETA2
(%):
13.32
1.04
Globuline GAMMA
(%):
24.58
7.00
15.00
7
1.92
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Terapia convenzionale
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La Leishmaniosi canina è una patologia di difficile soluzione. Mentre in campo umano, per
fortuna, la terapia porta ad una percentuale di guarigione completa di circa il 96 % dei casi,
nei nostri amici animali purtroppo tale percentuale scende drasticamente. Spesso si
confonde una guarigione clinica (regressione di tutti i sintomi, in cui il parassita rimane
latente nell'organismo) con la guarigione completa (negativizzazione dei test sierologici ) e
costanti sono le ricadute della malattia in forme sempre più gravi e refrattarie ai
trattamenti.(25,26) Se la malattia è diagnosticata all'inizio, quando non sussiste una
sintomatologia conclamata e il soggetto è giovane al disotto dei due anni, con un'opportuna
cura, la percentuale di guarigione può anche essere intorno al 40%. Con l'avanzare dell’età,
ma soprattutto con la Leishmaniosi in stato avanzato (manifestazione della sintomatologia
tipica) questa percentuale scende variabilmente a secondo dei soggetti dal 5 al 15% . Alcuni
ricercatori addirittura, sostengono che la guarigione completa costituisce un evento
rarissimo. I farmaci d'elezione per la terapia anti-leismania sono i composti pentavalenti
dell'Antimonio.(16,26) In Italia i più usati sono l'antimoniato di N-metilglucamina e l'antimoniato
di meglumine (glucantime).Vari sono i protocolli di somministrazione. Il classico è quello di
100mg/kg di metilglucamina ( in un unica somministrazione)per due cicli di 15 giorni
ciascuno intervallati da due settimane di sospensione. Tale dosaggio, secondo recenti studi,
può essere aumentato sensibilmente (tenendo sotto controllo la funzionalità renale ed
epatica) e il ciclo di somministrazione dovrebbe durare fino ad una normalizzazione del
quadro proteico. Personalmente preferisco utilizzare una sottodose (50 mg/kg per un mese
senza interruzione) al fine di garantire una maggiore permanenza in circolo del farmaco
unitamente alla somministrazione di metronidazolo (25 mg/kg) ogni 9 ore. Avendo
l'antimonio un tempo di emivita breve (da ricerche è emerso che dopo 6 ore dalla
somministrazione circa il 95% del farmaco viene eliminato dall'organismo) è opportuno
suddividere la somministrazione in due dosi giornaliere per esercitare un'azione
antiparassitaria continua.
Per combattere la formazione degli immunocomplessi si usa il cortisone. Questo farmaco
però, deve essere usato solo in caso di necessità, in quanto il cortisone deprime il sistema
immunitario, e la parassitosi ha il suo punto di forza nello inceppamento di questo sistema.
In effetti studi negli Stati Uniti hanno dimostrato l'efficacia di alcune sostanze
immunostimolanti ai fini terapeutici. Altri farmaci usati sono: l'amminosidina
(aminofarma),l'allopurinolo e l'amphotericina B. Quest'ultimo è il farmaco di prima scelta per
la cura della Leishmaniosi umana. Ma, prescindendo il suo elevatissimo costo, sembra
purtroppo che l'amphotericina B non abbia la stessa efficacia dimostrata in campo umano,
per la cura dei nostri animali.
Capitolo
8
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2
Scopo della
sperim entazione
La scelta di provare questa terapia è stata dettata da motivazioni estremamente diverse tra
loro:
La scarsa presenza in commercio di Glucantim ;
La difficoltà di avere risultati certi e costanti mediante terapia con antimoniali ;
La possibile resistenza agli antimoniali da parte del parassita ;
La frequente tossicità epato-renale dello stesso ;
Ma soprattutto l’aver notato una regressione della malattia in alcuni soggetti da me trattati
con Baytril e Metronidazolo per la cura di alcune paradontiti. La sinergia tra l’enrofloxacin e il
metronidazolo era già stata evidenziata da alcune ricerche della Bayer ma per scopi
terapeutici e dosaggi differenti. La capacità di entrambe le sostanze di interferire con la
sintesi del DNA del parassita (entrambi si legano alle Topoisomerasi II e IV) mi hanno
convinto a sperimentare questo tipo di terapia. Ho optato per un'unica somministrazione
giornaliera di enrofloxacin e somministrazioni ripetute di metronidazolo (ogni 9 ore) per la
scarsa permanenza in circolo di quest’ultimo (possiede un tempo di semi-eliminazione di
4,5 ore), al fine di garantire al paziente una copertura più estesa.
Lo scopo della sperimentazione è quello di verificare l’efficacia dell’asociazione Baytril e
Metronidazolo nella cura della leishmaniosi del cane. La scelta dei due farmaci è stata fatta
in base a caratteristiche chimico-biologiche del farmaco ed in base alla morfologia e struttura
biochimica del parassita, (2,5,20,21) soprattutto, a passate esperienze personali.
Brevi richiam i farm acologici
Enrofloxacina
Chemical group: Quinolone carboxylic acid derivative.
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.. name: 3-Quinolinecarboxylic acid, 1-cyclopropyl-7-(4-ethylChemical
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1-piperazinyl)-6-fluoro-1,4-dihydro-4-oxo.
Molecular formula: C19H22FN3O3.
Molecular weight: 359.4.
Description: Pale yellow crystals with a melting point of 219 to 221 °C.
Solubility: Slightly soluble in water at pH 7.
Proprietà generali dei fluoro-chinoloni.(11,12,13,14)
L’enrofloxacina è un Acido Chinolon-Carbossilico e possiede (unitamente ad altri chinoloni)
gruppi funzionali altamente specifici per l’attività antibatterica. Inoltre i composti di ultima
generazione, tra cui l’enrofloxacina, possiedono strutture specifiche che garantiscono una
attività specifica contro la cellula bersaglio. Ad esempio, la presenza in posizione 6 si un
atomo di fluoro permette di allargare lo spettro di azione antibatterico sia nei confronti dei
germi gram–positivi e gram-negativi, che dei micoplasmi e della clamidie. Inoltre
l’introduzione di un anello piperazinico in posizione 7 ne aumenta significativamente la
penetrazione nei tessuti e nei batteri con conseguente incremento dell’attività.; l’introduzione
di un atomo di ossigeno in posizione 8 ne comporta un miglioramento delle attività nei
confronti nei confronti dei gram-positivi e dei microrganismi anaerobi senza interferire con il
profilo battericida.
Attività antibatterica (16,17)
Meccanismo d’azione: i chinoloni inibiscono l’enzima di batterico DNA-girasi
(topoisomerasi) che è responsabile del superavvitamento del DNA che può quindi avvolgersi
in un numero di domini cromosomici e fissarsi intorno al nucleo dell’RNA. Perché ciò
avvenga anche il cromosoma deve essere momentaneamente inciso prima di fissarsi.
Quando la DNA-girasi viene inibita dai chinoloni, si verifica una riduzione del
“Superavvitamento” con conseguente alterazione dell’orientamento spaziale del DNA. Le
incisioni esposte attivano delle esonucleasi che degradano il DNA cromosomico in piccoli
frammenti.
Anche le topoisomerasi dei mammiferi presentano analoga attività, ma questi enzimi sono
sostanzialmente differenti dalla girasi batterica e non è suscettibile di inibizione ad opera dei
chinoloni. Una similitudine biochimica a quella batterica è però presente nella struttura
genomica di alcuni tripanosomi , e l’attività dei chinoloni potrebbe interferire anche con la
replicazione del DNA del parassita. In alcune esperienze in vitro si evidenziò la sinergia di
azione dei fluorochinoloni e del metronidazolo, sinergia di azione che si rende ancor più
manifesta nei confronti di anaerobi obbligati e di parassiti endocellulari. Ma nessuna prova
sperimentale in vivo è presente in letteratura.
Resistenza batterica : Sebbene si sviluppi rapidamente per alcuni chinoloni, nei nuovi
composti è stata riconosciuta una bassa frequenza di resistenza di tipo cromosomico e non
pone problemi rilevanti. In vitro non vi sono state mai segnalazioni di resistenze mediate da
plasmidi ma solo di tipo cromosomico (alterazione del sito di attacco dell’enzima girasi).
Metronidazolo
Meccanismo di azione : I 5-nitroimidazoli rappresentano una classe di composti dotata di
attività antibatterica e antiprotozoaria, il metronidazolo è stato impiegato con successo in
passato per le giardasi e delle amebiasi e per molti anni è stao anche utilizzato per infezioni
causate da batteri anaerobi obbligati. Il suo esatto meccanismo di azione non è
completamente chiarito, certamente la sua attività si esplica sul DNA batterico, in effetti
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alcune .prove sperimentali hanno dimostrato che il metronidazolo, una volta penetrato
.
nell’organismo sensibile, impedisce l’avvolgimento della doppia elica del DNA batterico e
che la sua attività sia di inibire la Dna-girasi (responsabile del superavvitamento del DNA), I
siti di attacco del farmaco non sono stati mai identificati con precisione ma in vitro manifesta
sinergia di azione con l’enrofloxacina (chinolone in grado di alterare la topoisomerasi I e IV).
D’altra parte, l’utilizzo di farmaci appartenenti a questo gruppo (ketoconazolo) è stato
largamente utilizzato e studiato come farmaco antiprotozoario. (6,8)
Prove sperimentali sulla sua efficacia nella leishmaniosi umana e canina sono presenti in letteratura ma non
hanno mai dato risultati confortanti (Pennisi, 2001) e comunque non tali da permettere una valida alternativa
all’utilizzo dei farmaci antimoniali. (4,7,18,19) Ma, la sinergia di azione con i fluorochinoloni sul DNA
batterico e protozoario (dimostrata in vitro) potrebbe costituire una valida motivazione a testare in vivo
l’efficacia sul parassita.
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