LA GENETICA MEDICA DI SAN GIOVANNI ROTONDO AL SERVIZIO
DELL’ASSOCIAZIONE A.C.A.R. ONLUS
Dott. Leonardo D’Agruma
Servizio di Genetica Medica - Dipartimento dell’Età Evolutiva
I.R.C.C.S. “Casa Sollievo della Sofferenza”
San Giovanni Rotondo (FG)
13 Aprile 2013
San Giovanni Rotondo 13-04-2013
INTRODUZIONE
Le esostosi multiple ereditarie (HME) rappresentano una malattia
a trasmissione autosomica-dominante caratterizzata dallo sviluppo
di tumori benigni delle ossa, chiamati esostosi o osteocondromi
multipli. Essi riguardano soprattutto le metafisi delle ossa lunga.
La prevalenza alla nascita è stimata intorno a 1:50.000 e la severità
della malattia presenta una discreta variabilità interfamiliare e
intrafamiliare. Le esostosi possono causare varie complicazioni
cliniche (dolori articolari, deformità ossee ed accorciamento delle
ossa lunghe, ridotta mobilità articolare e compressioni di nervi e
vasi sanguigni). Sul piano clinico la conseguenza piu’ importante
delle esostosi multiple ereditarie è la trasformazione maligna negli
adulti (0,5 - 5 % dei casi).
FORME DI PRESENTAZIONE CLINICA DELLE ESOSTOSI
• OSTEOCONDROMA (85% dei casi in forma sporadica)
• ESOSTOSI MULTIPLE EREDITARIE (HME) (15% dei casi)
GENETICA DELLE ESOSTOSI MULTIPLE EREDITARIE
(HME)
Le esostosi multiple ereditarie costituiscono un disordine eterogeneo
dal punto di vista genetico. Esse sono associate a mutazioni nei geni
EXT1 ed EXT2 che sono considerati essere “tumour suppressor genes”.
Tali geni codificano due proteine chiamate esostosina 1 ed esostosina 2.
Si tratta di proteine ad attività glicosiltransferasica coinvolte nella
biosintesi dell’eparan-solfato. Molte mutazioni (frameshift o nonsense)
in questi due geni causano la produzione di proteine tronche e non
funzionanti, mentre le mutazioni missense (cambio amminoacidico)
sono rare e meno deleterie.
GENI EXT e LOCALIZZAZIONE CROMOSOMICA
• Gene EXT1 localizzato sul cromosoma 8q23-q24
• Gene EXT2 localizzato sul cromosoma 11p11-p12
• Gene EXT3 localizzato sul braccio corto del cromosoma 19 ?
Famiglia di geni EXT-like:
EXTL1 (cromosoma 1p36)
EXTL2 (cromosoma 1p11-p12)
EXTL3 (cromosoma 8p12-p22)
Espressione ubiquitaria, alta omologia di sequenza tra di loro
nella regione carbossiterminale.
E’ stato dimostrato che i geni in cui sono localizzate
le alterazioni che determinano l'insorgenza dell'EME
chiamati EXT1, EXT2 ed EXT3 sono
localizzati
rispettivamente sui cromosomi 8, 11 e 19. Le
mutazioni sono più frequentemente riscontrabili in
EXT1 localizzato sul cromosoma 8.
EXT1…
…ed EXT2
…ed EXT3 ?
Possibile localizzazione gene EXT3
(Studi di linkage)
Struttura del gene EXT1
Struttura del gene EXT2
FUNZIONE DEI GENI EXT1 ed EXT2
EXT1 ed EXT2 svolgono un ruolo importante in un complesso
enzimatico coinvolto nella biosintesi dell’eparansolfato (HS),
complesso polisaccaridico lineare composto da acido
hexuronico e residui di glucosammina. Esso è un costituente
fondamentale
della matrice cartilaginea e delle epifisi ossee.
Mutazioni in questi due geni portano ad un ridotto contenuto di
HS e ad una difettiva polimerizzazione della catena
polisaccaridica. Tutto ciò si traduce in un’alterata espressione
del signalling che regola l’ossificazione endocondrale.
L’eparansolfato è coinvolto in diverse funzioni: attivazione di
fattori di crescita; signalling recettoriale, proliferazione e
differenziazione cellulare.
ALTERAZIONI DEI GENI EXT1 ed EXT2
Double somatic inactivation
Forme sporadiche di:
OSTEOCONDROMA
ESOSTOSI ISOLATE NON
FAMILIARI
Germline+Somatic inactivation
ESOSTOSI MULTIPLE
EREDITARIE (HME)
Tecniche di studio di Biologia Molecolare
utilizzate per le indagini genetiche
ESTRAZIONE e DOSAGGIO DNA
AMPLIFICAZIONE IN VITRO (PCR) DELLE REGIONI
CODIFICANTI DEI GENI EXT1 ED EXT2.
PURIFICAZIONE DEI PRODOTTI DI AMPLIFICAZIONE
SEQUENZIAMENTO AUTOMATICO
MLPA
Processo di analisi molecolare
Elettoferogrammi relativi alla identificazione della
mutazione p.S220N riscontrata nell’esone 1 del
gene EXT1 allo stato eterozigote in un paziente con
esostosi multiple a livello dell’articolazione del
ginocchio. Nella parte superiore è illustata la
sequenza wild-type mentre nella parte inferiore la
sequenza mutata.
Elettoferogrammi relativi alla identificazione della
mutazione p.R340S riscontrata nell’esone 2 del
gene EXT1 allo stato eterozigote in un paziente con
esostosi multiple a livello del radio e ulna. Nella
parte superiore è illustata la sequenza wild-type
mentre nella parte inferiore la sequenza mutata.
Sequenze di pazienti con esostosi multiple
p.Q406X
p.L562P
c.1244_1247delATTT
p.W184Y
c.362_363delTC
MUTAZIONE
Q700X
L562P
Y629X
C.913 del.G
c.1244_1247del ATTT
c.546 del. C
R340S
c.369_370 del. AG
R340C
C339T
Q406X
C339Y
c.968_974 del.7
Y117X
W184Y
c.362 del. TC
S220N
c.1163_1164 del.AG
c. 1940_1967del.28 ins CC
c. 1146_ 1153 del. CAGTTGTC
c. 678 del. C
ESONE
GENE
TIPO DI MUTAZIONE
11
8
10
5
4
1
2
1
2
6
4
6
2
1
1
1
1
1
10
1
1
EXT1
EXT1
EXT1
EXT2
EXT1
EXT1
EXT1
EXT1
EXT1
EXT2
EXT1
EXT2
EXT1
EXT1
EXT1
EXT1
EXT1
EXT1
EXT1
EXT1
EXT1
nonsense mutation
missense mutation
nonsense mutation
frameshift mutation
frameshift mutation
frameshift mutation
missense mutation
frameshift mutation
missense mutation
missense mutation
nonsense mutation
missense mutation
frameshift mutation
nonsense mutation
missense mutation
frameshift mutation
missense mutation
frameshift mutation
frameshift mutation
frameshift mutation
frameshift mutation
EXT1
-
-
-
+
L562P
-
+
c.1644delC
-
-
+
c.369_370delAG
EXT1
+
+
c.1723-1G>T
+
+
+
?
+
+
+
?
+
+
+
+
c.1468_1469insG
+
+
EXT2
+
+
+
+
-
+
+
R23X
K285X
R182X
+
c.913delG
+
+
+
+
+
RISULTATI DELLO STUDIO GENETICO SULLE HME
(SAN GIOVANNI ROTONDO 2006-2011)
Pazienti esaminati: 90
Famiglie: 30
Mutazioni identificate in 67 pazienti (74,4%)
Mutazioni identificate:67
27 frameshift (40,2%)
16 missense, (23,9%)
17 nonsense(25,4%)
6 mutazioni di splicing (9%)
1 delezione del gene EXT2 (1,5%)
21 nuove mutazioni identificate: 20 puntiformi + 1 delezione
Mutazioni in EXT1: 79,2%
Mutazioni in EXT2: 20,8%
c.963-1G>T
c.1722+1G>T
DATI EPIDEMIOLOGICI-GENETICI DELLE HME
Mutazioni del gene EXT1 sono più frequenti nei pazienti europei o
nord-Americani di origine Caucasica, mentre pazienti cinesi o di
origine orientale presentano mutazioni più frequenti in EXT2.
Pazienti con mutazioni del gene EXT1 tendono ad essere colpiti più
severamente rispetto a pazienti con mutazioni in EXT2 (altezza,
numero di esostosi e ridotta mobilità).
La possibilità di trasformazione maligna dell’esostosi (sarcoma)
sembra essere più alta nelle famiglie con mutazioni in EXT1 rispetto a
quelle con mutazioni in EXT2.
Pazienti con mutazioni in EXT2 presentano un fenotipo clinico
moderato.
CONSULENZA GENETICA I
• La diagnosi di HME è basata su dati clinici e/o radiografici che
evidenziano esostosi multiple in uno o più membri della
famiglia.
• Nei bambini e negli adulti affetti è previsto un protocollo clinico
annuale di sorveglianza dei siti assiali delle esostosi.
• Negli individui adulti è importante il monitoraggio delle
dimensioni delle esostosi ed i vari segni di sofferenza articolare
o di mobilità ossea. Questo aspetto è da tenere in particolare
considerazione per il rischio del 0,5-5 % di sviluppare
osteocondrosarcomi.
CONSULENZA GENETICA II
•
L’analisi molecolare dei geni EXT1 ed EXT2 è possibile nei casi di
diagnosticata a livello clinico o radiografico.
Un individuo affetto ha una probabilità del 50% di trasmettere la
malattia alla discendenza.
HME
Sono descritti casi di HME insorti de novo.
La diagnosi prenatale è possibile solo nel caso di mutazione nota
nella famiglia e va discussa dal punto di vista etico con il genetista.
DIAGNOSI PRENATALE
• VILLOCENTESI (11a settimana di gestazione)
• AMNIOCENTESI (16a-18a settimana di gestazione)
ATTIVITA’ PRESENTI E PROSPETTIVE FUTURE
• Identificazione del terzo gene malattia nelle famiglie senza
mutazioni nei geni EXT1 ed EXT2 (10-15 % circa dei casi
familiari sono non risolti).
• Studio funzionale di mutazioni nei geni EXT1 ed EXT2 per una
migliore comprensione dei meccanismi molecolari alla base del
difetto.
• Studio della Loss of Heterozigosity (LOH)
• Next Generation Sequencing
• Migliore comprensione dei processi della crescita ossea:
differenziazione prematura dei condrociti che porta alla
formazione delle esostosi.
Servizi offerti dalla Genetica Medica dell’I.R.C.C.S. «Casa
Sollievo della Sofferenza» di San Giovanni Rotondo
• Accettazione dei pazienti e delle famiglie
• Consulenza genetica pre-test
• Esame molecolare geni EXT1 ed EXT2
• Consulenza genetica post-test
• Diagnosi prenatale
• Consulenza multispecialistica ( pediatra, radiologo,
chirurgo ortopedico, fisiatra)
GRAZIE PER L’ATTENZIONE
