Ciclo di Krebs

Il ciclo di Krebs
e
la fosforilazione ossidativa
La respirazione cellulare
• Sono i processi molecolari in cui è
coinvolto il consumo di O2 e la
formazione di CO2 e H2O da parte
della cellula.
• E’ suddivisa in 3 fasi:
• Fase 1: Produzione di acetil-CoA da
parte di aminoacidi, acidi grassi e
carboidrati
• Fase 2: Ossidazione dell’acetil-CoA
(Ciclo di Krebs)
• Fase 3: Trasferimento degli elettroni
e fosforilazione ossidativa (Catena
respiratoria)
Il mitocondrio
• Sono presenti 2 membrane:
- membrana esterna che circonda
tutto l’organello
- membrana interna con numerosi
ripiegamenti, le creste.
• Il compartimento interno, la
matrice, è una soluzione acquosa
che contiene un’elevata
concentrazione di enzimi e
intermedi coinvolti nel metabolismo
energetico.
• Sono i più importanti produttori di
ATP
• Si riproducono per divisione di un
mitocondrio preesistente
• Contengono DNA che codifica per
alcune proteine specifiche della
membrana mitocondriale interna.
Ciclo di Krebs
(ciclo degli acidi tricarbossilici o dell’acido citrico)
• Processo ossidativo centrale della respirazione attraverso cui
tutti i combustibili metabolici sono catabolizzati nei tessuti
• E’ localizzato nei mitocondri
• E’ costituito da 8 tappe
• Si possono distinguere due fasi:
- ossidazione di 2 atomi di C a CO2 (dalla reazione 1 alla 4)
- rigenerazione dell’ossalacetato (dalla reazione 5 alla 8)
• 3 tappe sono irreversibili:
- Formazione del citrato
- Ossidazione dell’isocitrato
- Ossidazione dell’α-chetoglutarato
Sono tappe fortemente esoergoniche
• E’ una via anfibolica: entra sia nei processi anabolici sia in
quelli catabolici
Ciclo di Krebs
• Un gruppo acetilico,
sotto forma di acetilCoA (2 atomi di C), è
introdotto nel ciclo,
combinandosi con
l’ossalacetato.
• 2 atomi di C escono dal
ciclo sotto forma di CO2
a livello dell’ossidazione
dell’isocitrato e dell’αchetoglutarato.
• Alla fine del ciclo si
rigenera ossalacetato.
Reazioni del ciclo di
Krebs: fase ossidativa
o
1.Formazione del
citrato
Enzima: citrato
sintasi.
La reazione è
fortemente
esoergonica.
2. Formazione
dell’isocitrato
attraverso il
cis-aconitato.
Enzima: aconitasi.
La reazione è
reversibile
3. Ossidazione
dell’isocitrato ad
α-chetoglutarato
e CO2.
Enzima: isocitrato
deidrogenasi
4. Ossidazione dell’α-chetoglutarato a succinil-CoA
e CO2.
Enzima: complesso dell’α-chetoglutarato
deidrogenasi.
Sono reazioni essenzialmente irreversibili nella cellula.
La decarbossilazione ossidativa determina la
liberazione di CO2 e la riduzione di NAD+ a NADH.
Fase rigenerativa
5. Conversione del succinil-CoA a
succinato
Enzima: succinil-CoA sintetasi
L’energia rilasciata dalla rottura
del tioestere viene utilizzata per la
sintesi di GTP, che può donare il
suo gruppo fosforico a ADP per
formare ATP, reazione catalizzata
dalla nucleoside difosfato chinasi
6. Ossidazione del succinato a
fumarato
Enzima: succinato deidrogenasi
(legata alla membrana).
Gli elettroni passano dal FAD alla
catena di trasporto degli elettroni
della membrana mitocondriale
interna.
7. Idratazione del fumarato
per produrre malato
Enzima: fumarasi
L’enzima è altamente
specifico e reagisce solo con il
fumarato e non il suo isomero
trans, il maleato.
8. Ossidazione del malato ad
ossalacetato.
Enzima: malato deidrogenasi
Una molecola di NAD+ viene
ridotta a NADH. Nonostante
il ΔG della reazione sia
positivo, l’equilibrio è spostato
verso i prodotti grazie alla
continua rimozione
dell’ossalacetato.
Bilancio energetico del ciclo di Krebs
• Nel ciclo di Krebs, l’energia
rilasciata dall’ossidazione di
una molecola di acetil-CoA
viene conservata riducendo
contemporaneamente i
trasportatori di elettroni NAD
e FAD rispettivamente a
NADH e FADH2 e producendo
una molecola di ATP
• → rendimento totale di una
molecola di Acetil-CoA=
3NADH + FADH2 + GTP =
10 ATP
CH3CO-CoA + 3H2O + 3NAD+ + GDP + FAD + Pi →
2CO2 + CoASH+ 3NADH + 3H+ + GTP + FADH2
Ossidazione di una molecola di glucosio
• Il rendimento del processo di ossidazione di una
molecola di glucosio e` del 40% rispetto alla quantità
di energia ricavabile dall’ossidazione completa di una
molecola di glucosio (1160kj su 2840kj per mole di
glucosio).
• Il rimanente 60% è utilizzato per la produzione di
calore corporeo e per far si’ che la reazione proceda
nel senso indicato.
Bilancio netto in ATP:
• Glicolisi: 4ATP+ 2NADH (2.5x2 ATP)-2ATP= 7
• Piruvato
acetil-CoA: 2NADH (2.5 x 2)= 5
• Ciclo di Krebs: 6NADH (2.5x6) + 2 FADH2 (1.5 x
2) +2 GTP= 20 ATP
Totale= 32 ATP
Componenti del ciclo di krebs
•
Il ciclo di Krebs è il
cuore del metabolismo
intermedio.
•
E’ una via anfibolica:
•
Catabolismo dei
carboidrati, degli acidi
grassi e degli aminoacidi
•
Gli intermedi sono
precursori per molte vie
anaboliche.
•
I composti utilizzati
sono rimpiazzati
mediante reazioni
anaplerotiche.
(es. Carbossilazione del
piruvato tramite CO2 per
formare ossalacetato,
catalizzata dalla
piruvato carbossilasi).
Regolazione del ciclo di Krebs
Fattori che regolano la velocità del
ciclo:
• disponibilità di substrato
• inibizione da accumulo di prodotti
• inibizione allosterica retroattiva (a
feedback) dei primi enzimi del ciclo
da parte degli ultimi intermedi
Regolazione del ciclo di Krebs
Tre tappe fortemente
esoergoniche catalizzate da:
• Citrato sintasi
• Isocitrato deidrognasi
• α-chetoglutarato deidrogenasi
• NADH: ↓ le deidrogenasi
• Accumulo di prodotti: ↓ delle
tre reazioni
• ATP: ↓ citrato sintasi e
isocitrato deidrogenasi
• ADP: ↑ citrato sintasi
• Ca2+: ↑ isocitrato e αchetoglutarato deidrogenasi
La respirazione cellulare
• Fase 1: Produzione di
acetil-CoA da parte di
aminoacidi, acidi grassi
e carboidrati
• Fase 2: Ossidazione
dell’acetil-CoA (Ciclo di
Krebs)
• Fase 3: Trasferimento
degli elettroni (Catena
respiratoria) e
fosforilazione
ossidativa
La Fosforilazione Ossidativa
• E’ la sintesi di ATP guidata dal
trasferimento di elettroni
all’ossigeno.
• Determina la riduzione
dell’ossigeno molecolare ad
acqua.
• Gli elettroni sono forniti da
NADH e FADH2 (sotto forma di
ioni idruro H-).
• Avviene nei mitocondri
Il flusso elettronico
mitocondrile
• La membrana mitocondriale
esterna è permeabile a
piccole molecole e ioni grazie
alla presenza di numerosi
canali costituiti dalla
proteina porina.
• La membrana mitocondriale
interna è impermeabile a
quasi tutti gli ioni e piccole
molecole compresi i protoni;
le specie chimiche che
possiedono uno specifico
trasportatore sono in grado
di attraversare la membrana.
• In questa struttura sono
localizzati la CATENA
RESPIRATORIA e IL
COMPLESSO ENZIMATICO
CHE SINTETIZZA ATP
La Teoria Chemiosmotica di P. Mitchell (1961):
Trasduzione di energia
attraverso gradienti protonici transmembrana
• La fosforilazione ossidativa è un flusso di elettroni attraverso
intermedi proteici redox, trasportatori legati alla membrana
mitocondriale che comprendono chinoni, citocromi e proteine
ferro-zolfo.
• L’energia libera resa disponibile da questo flusso esoergonico di
elettroni è accoppiata al trasporto endoergonico di protoni (H+)
attraverso una membrana impermeabile ai protoni (la membrana
mitocondriale interna); questo trasporto crea un potenziale
elettrochimico (forza motrice protonica, differenza di
concentrazione di protoni e di carica).
• Il flusso transmembrana di protoni in senso inverso, mediato da
specifici canali protonici, fornisce l’energia libera per la sintesi di
ATP.
Teoria chemiosmotica
La catena respiratoria
• Gli elettroni sono incanalati in trasportatori di elettroni
universali (NADH) che interagiscono con la catena
respiratoria.
• La catena respiratoria è costituita da una serie di
trasportatori di elettroni, la maggior parte dei quali sono
proteine integrali di membrana contenenti gruppi
prostetici in grado di accettare e di donare uno o due
elettroni.
•Ogni componente della catena
può accettare elettroni dal
trasportatore che lo precede e
trasferirli a quello che lo segue,
generando una sequenza
specifica.
NADH + H+ + ½O2 →H2O + NAD+
Trasportatori di elettroni della catena
respiratoria
• NAD
• FAD/FMN
• Ubichinone (coenzima Q): è una moleocola di piccole
dimensioni, lipofila, che diffonde liberamente
attraverso la membrana e può agire da ponte tra
trasportatori di elettroni meno mobili.
• Citocromi: sono proteine contenenti ferro che
trasferiscono gli elettroni localizzati nella membrana
interna. L’atomo di ferro è localizzato nel gruppo
eme.
• Proteine ferro-zolfo: il ferro è associato ad atomi
di zolfo di residui di cisteina della proteina;
trasferiscono un elettrone per volta
Trasferimento di elettroni
• Nella catena respiratoria i trasportatori sono organizzati in 4
complessi e gli elettroni sono trasferiti da un complesso all’altro.
• Complesso I (NADH deidrogenasi): dal NADH all’ubichinone→ gli
elettroni vengono ceduti dal NADH al gruppo FMN e poi ai centri FeS del complesso I che li trasferisce all’ubichinone, determinando uno
spostamento di protoni dalla matrice allo spazio intermembrana.
• Complesso II (succinato deidrogenasi): dal succinato all’ubichinone →
gli elettroni vengono trasferiti dal succinato all’ubichinone dalla
succinato deidrogenasi, l’unico enzima del ciclo di Krebs legato alla
membrana mitocondriale.
• Complesso III : da ubichinone a citocromo c→
l’ubichinone-citocromo c ossidoreduttasi catalizza
il trasferimento di elettroni dall’ubichinone al
citocromo c rilasciando protoni nello spazio
intermembrana.

Complesso IV: riduzione
dell’O2→ il complesso
enzimatico della
citocromo ossidasi
trasferisce elettroni dal
citocromo c all’O2 che
viene ridotto ad acqua e
contemporaneamente
pompa protoni nello
spazio intermembrana.
Sintesi di ATP: fosforilazione di ADP
• Il trasferimento di elettroni
lungo la catena respiratoria è
accompagnato da un pompaggio
di protoni attraverso la
membrana mitocondriale
interna che porta ad una
differenza di concentrazione
di protoni.

Il gradiente elettrochimico (forza motrice
protonica) generato rappresenta la
conservazione di parte dell’energia liberata
dalle ossidazioni. La forza motrice protonica
viene utilizzata per la sintesi di ATP
catalizzata dall’ATP sintasi.
ATP sintasi
• L’ATP sintasi è un
complesso enzimatico
formato da due componenti
principali, la porzione di
membrana F0 e l’unità F1
che sintetizza ATP ed è
costituita da varie
subunità. Le due unità
formano il canale
attraverso cui si genera il
flusso di protoni dallo
spazio intermembrana alla
matrice mitocondriale.
Meccanismo di sintesi dell’ATP
•
•
•
•
•
•
•
Nell’unità F1 l’enzima possiede tre siti di legame dei nucleotidi
adeninici tra loro equivalenti.
In un dato momento uno dei tre siti è nella conformazione T
(legame forte), un altro è nella conformazione L (legame debole) e
il terzo è nella conformazione O (aperto o vuoto, legame molto
debole).
All’inizio di un ciclo catalitico una molecola di ATP è legata al sito
T mentre il sito L lega ADP + Pi.
La forza motrice protonica, passando attraverso il canale,
determina emissione di energia che altera la conformazione: il sito
T si converte nel sito O con dissociazione di ATP e il sito L in T
dove ADP e Pi si convertono in ATP.
Il sito O diventa sito L e lega anche se debolmente ADP e Pi.
Il ciclo ricomincia con il canale ruotato di una subunità.
L’ATP non può essere rilasciato da un sito se ad un altro sito non vi
sono legati ADP + Pi.
Regolazione della
fosforilazione ossidativa
• La velocità della fosforilazione ossidativa è
regolata dal rapporto [ATP]/[ADP].
• Questo rapporto è normalmente molto elevato
([ATP] > [ADP]).
• Quando all’interno della cellula la velocità di
qualche processo che richiede energia, e che
quindi consuma elevate quantità di ATP, tende ad
aumentare, il rapporto diminuisce per un aumento
della concentrazione di ADP.
• Avendo a disposizione più ADP la velocità della
fosforilazione ossidativa aumenta, determinando
la rigenerazione di ATP.
La produzione di calore
• I mitocondri del grasso bruno (presente nel neonato
e nei mammiferi che vanno in letargo) utilizzano ATP
per produrre calore.
• La membrana interna di questi mitocondri contiene
una proteina chiamata termogenina o proteina
disaccoppiante. Questa proteina genera una via di
ritorno dei protoni nella matrice senza dover
attraversare l’ATP sintasi.
• Per effetto di questo cortocircuito, l’energia
prodotta dalle ossidazione non viene conservata
sotto forma di ATP ma dissipata come calore, che
contribuisce a mantenere la temperatura del corpo.
Quesiti:
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
Quale è la funzione del ciclo di Krebs? Dove avviene e quale è il prodotto di partenza e di
arrivo del ciclo?
In quali fasi può essere suddiviso il ciclo Krebs e quali sono gli enzimi chiave del ciclo?
Quali sono i fattori che regolano la velocità del ciclo di Krebs?
Perché è considerato una via anfibolica?
Quale è il significato delle reazioni anaplerotiche? Fare almeno un esempio di tali reazioni
Quale funzione hanno Catena respiratoria e fosforilazione ossidativa
Quali sono i principali trasportatori di elettroni nella catena respiratoria
Come avviene la produzione di ATP nel processo di fosforilazione ossidativa? Quale è
l’enzima chiave e quali sono i fattori che stimolano la produzione di ATP?
Quali sono le caratteristiche del grasso bruno?