33 La catena respiratoria La catena respiratoria è costituita da una serie di trasportatori, molti dei quali sono proteine integrali di membrana (interna), i cui gruppi prostetici sono in grado di accettare e cedere uno o due elettroni. L'accettore finale è l'ossigeno. Il complesso I è una NADH deidrogenasi su cui vengono incanalati tutti i NADH prodotti nelle ossidazioni compreso quello glicolitico dello shuttle malato-aspartato. Gli ioni idruro vengono trasferiti all'ubichinone (UQ)detto anche coenzima Q secondo la reazione: NADH + H+ + UQ ———→ NAD+ + UQH2 (ubichinolo) Il flusso di elettroni attraverso il complesso I è accompagnato da spostamento di protoni dalla matrice allo spazio intermembrana. Il complesso II è la succinato deidrogenasi, enzima del ciclo di Krebs ed è la sede sella riossidazione del FADH2. Anch'esso, come il complesso I trasferisce gli elettroni all'ubichinone, riducendolo ad ubichinolo. Anche la glicerolo 3-P deidrogenasi, enzima di membrana rivolto verso lo spazio intermembrana (non presente in figura) che riossida il NADH citosolico trasportato dalla shuttle del glicerolo 3-P, trasferisce gli elettroni all'ubichinone. L'ubichinone, in figura CoQ, è una molecola idrofobica, completamente immerso nella membrana mitocondriale nella quale diffonde liberamente spostandosi nel doppio strato lipidico. La sua forma ossidata contiene due gruppi carbonilici che possono accettare due elettroni e due protoni riducendosi completamente a ubichinolo avente due gruppi alcolici. UQ + 2e + 2H ———→ UQH2 + L'UQH2 diffonde dal complesso I al complesso III, dove viene riossidato. Il complesso III è il complesso che riossida l'ubichinolo ed è costituito da citocromi b e c. Il citocromo c è una proteina solubile che, come tutti i citocromi, ha come gruppo prostetico l'eme, contenente Fe che accetta elettroni passando da ferro ferrico a ferro ferroso e viceversa. Esso può spostarsi nella parte polare della membrana per la sua possibilità di fare legami elettrostatici. E' di notevole interesse osservare come il citocromo c sia una proteina presente in tutti gli organismi aerobi con una sequenza aminoacidica che è cambiata di poco nella scala evoluzionistica, segno di una elevata efficienza nel trasportare elettroni che si è selezionata tra tutte quelle possibili. La riossidazione dell'ubichinolo è accompagnata da un secondo spostamento di protoni dalla matrice allo spazio intermembrana. Si incrementa così il gradiente di concentrazione protonica, iniziato a livello del complesso I, tra le facce della membrana che realizza una differenza di potenziale elettrico e un gradiente di pH. 34 Il complesso IV, chiamato citocromo ossidasi, contiene ioni rame che partecipano al trasferimento degli elettroni all'ossigeno. Il flusso di elettroni dal citocromo c all'ossigeno determina un nuovo ed ultimo spostamento di protoni dalla matrice verso lo spazio intermembrana. In conclusione, nei mitocondri, l'azione dei complessi I, III e IV porta elettroni dal NADH all'ossigeno e quello dei complessi II, III e IV, dal succinato (FADH2) all'ossigeno. La reazione complessiva NADH + H+ + 1/2 02 ———→ H2O + NAD+ ha un ΔG0 ≈ - 52Kcal/mole 0 Quella che parte dal succinato invece ha un ΔG ≈ - 36 Kcal/mole (si salta un sito di spostamento protonico) Quindi il trasferimento esoergonico di elettroni lungo la catena respiratoria produce energia più che sufficiente per "spingere" la reazione endoergonica che porta alla sintesi di ATP: ADP + Pi ———→ ATP Come tale energia viene incanalata nella sintesi dell'ATP è un processo che prende il nome di fosforilazione ossidativa La fosforilazione ossidativa Abbiamo visto che il flusso di elettroni attraverso la catena respiratoria produce una notevole quantità d'energia. Resta ora da capire come questa energia, liberata dalle ossidazioni biologiche operate dalle deidrogenasi possa rendersi disponibile per la fosforilazione dell'ADP. Per capire come avvenga l'accoppiamento dell'ossidazione con la fosforilazione dobbiamo conoscere un'altra proteina integrale di membrana: l'ATPsintasi. L'ATPsintasi è un complesso di membrana formato da due subunità principali, Fo e F1. Come si vede in figura F1 si protende nella matrice ed è il complesso che lega ATP e ADP in diversi siti . Il complesso Fo contiene un canale protonico asimmetrico e proteso verso la matrice mitocondriale. Esiste una teoria che accoppia l'ossidazione dei substrati alla fosforilazione ed è la teoria chemiosmotica proposta da P. Mitchell nel 1960 e che è alla base dell'attuale ricerca nel campo della trasduzione energetica. Il flusso elettronico attraverso la membrana interna dei mitocondri è accompagnato da un pompaggio di protoni dalla matrice allo spazio intermembrana. Ciò genera una differenza di potenziale elettrico e una differenza di pH tra i due lati della membrana rendendo quello che guarda la matrice più alcalino. Questa concentrazione protonica e queste separazione di cariche determinano una energia elettrochimica che prende il nome di forza motrice protonica che rappresenta la forma di conservazione dell' energia prodotta e liberata nelle ossidazioni biologiche. Il pompaggio contro gradiente protonico avviene con consumo d'energia e quindi avrà un ΔG > 0. La membrana mitocondriale è impermeabile ai protoni che non possono così rientrare per annullare il gradiente elettrochimico. Ma quando questi potranno fluire attraverso i canali protonici specifici posti nel complesso F o dell'ATPsintasi in direzione del gradiente elettrochimico, si renderà disponibile una quantità di energia pari al ΔG consumato per il trasporto in senso contrario (reso possibile dal flusso elettronico). Il complesso F1 condenserà un fosfato all'ADP per generare ATP. In definitiva quindi la generazione di ATP dai nutrienti, ed in particolare dal glucosio seguirà le seguenti tappe: Energia radiante —→ Glucosio —→ coenzimi ridotti—→ energia elettrochimica di membrana —→ATP Per ogni NADH riossidato si ha un flusso protonico in tre siti e si otterranno 3 moli di ATP. Per ogni FADH2 riossidato si avranno solo 2 ATP perché viene bypassato il complesso I. Lo stesso vale per il NADH citosolico trasportato dal glicerolo 3-P. 35 L'ATP prodotto nella matrice mitocondriale deve essere esportato fuori dai mitocondri ma sappiamo che la membrana interna è impermeabile a quasi tutte le sostanze a meno che non abbiamo sistemi di trasporto proteici specifici. Vi sono importanti sistemi di trasporto nella membrana mitocondriale interna che operano il trasporto di ADP e P i nella matrice e consentono l'uscita dell'ATP neo formato. L'enzima fondamentale è l'ATP-ADP traslocasi che funziona come un antiporto. Il fosfato entra nella matrice con un simporto favorito dal rientro degli ioni idrogeno a favore di gradiente. Quindi la forza motrice protonica fornisce l'energia necessaria alla sintesi di ATP e nel contempo favorisce il trasporto dei substrato (ADP e Pi) nella matrice e i prodotti della reazione (ATP).