ISTITUTO TECNICO PER ATTIVITÀ SOCIALI
“GIORDANO BRUNO”
PERUGIA
LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA
Realizzato da Massimo Trauzzola e Rossana Baglioni
Febbraio 2008
REPERTORIO DEI MODULI
E DELLE UNITÀ DIDATTICHE
1. ALLA SCOPERTA DEI MICRORGANISMI
1.1 IL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA
1.2 L’UBIQUITÀ DEI MICRORGANISMI
pag. 3
pag. 10
2. OSSERVARE I MICRORGANISMI
2.1 COLORAZIONE SEMPLICE CON BLU DI METILENE
2.2 COLORAZIONE NEGATIVA CON NIGROSINA
2.3 COLORAZIONE STRUTTURALE DELLE SPORE
2.4 COLORAZIONE STRUTTURALE DELLA CAPSULA
2.5 COLORAZIONE DIFFERENZIALE DI GRAM
pag. 13
pag. 16
pag. 18
pag. 21
pag. 23
3. LA COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMI
3.1 ALLESTIMENTO DI COLTURE BATTERICHE CON DIVERSE
TECNICHE DI SEMINA
3.2 I BATTERI DELLO YOGURT
3.3 EFFETTO DI DIVERSI FATTORI AMBIENTALI SULLA
CRESCITA DEI MICRORGANISMI
pag. 25
pag. 31
pag. 33
4. CRESCITA E CONTROLLO DELLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI
4.1 CONTA MICROBICA IN PIASTRA
4.2 CONTA SU TERRENO LIQUIDO
4.3 CONTA PER FILTRAZIONE SU MEMBRANA
4 4 ANALISI MICROBIOLOGICA DELL’ACQUA
4.4
DELL ACQUA POTABILE
4.5 VALUTAZIONE DELL’AZIONE INIBENTE DI ALCUNI
DISINFETTANTI DI USO COMUNE
4.6 ANTIBIOGRAMMA
pag. 37
pag. 40
pag. 42
pag 46
pag.
pag. 52
pag. 56
5. CARATTERISTICHE METABOLICHE DEI MICRORGANISMI
5.1 UTILIZZAZIONE DELL’AMIDO
5.2 UTILIZZAZIONE DI CARBOIDRATI DIVERSI
5.3 OSSIDAZIONE E FERMENTAZIONE
5 4 UTILIZZAZIONE DI AMINOACIDI
5.4
5.5 ENTEROTUBE
pag. 61
pag. 64
pag. 67
pag 70
pag.
pag. 73
6. INTERAZIONE MICRORGANISMI/UOMO
6.1 PROTEINA C REATTIVA
6.2 TITOLO ANTI-O-STREPTOLISINICO
pag. 77
pag. 79
APPENDICE
TERRENI DI COLTURA
BIBLIOGRAFIA
pag. 81
pag. 90
1
2
1. ALLA SCOPERTA DEI MICRORGANISMI
U.D. 1.1 IL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA
• REGOLE GENERALI PER LA SICUREZZA
3 Non portare mai nulla alla bocca (matite, pennarelli), non mangiare, bere e fumare in
laboratorio.
3 Non
N sedersi
d i sopra i banconi
b
i e non appoggiarsi
i i agli
li strumenti.
t
ti
3 Indossare il camice, i guanti e gli occhiali protettivi quando si eseguono operazioni pericolose.
3 E’ compito di ciascuno mantenere i camici puliti e in buone condizioni.
3 I capelli devono essere raccolti in modo da evitare contatti con superfici sporche o con la
fiamma del bunsen.
3 Non lasciare mai senza controllo reazioni in corso o apparecchi in funzione.
3 Non appoggiare recipienti o apparecchi sul bordo del bancone.
3 Non portare in tasca forbici, tubi di vetro o oggetti taglienti e appuntiti.
3 Il lavaggio delle mani deve essere effettuato durante e, in particolare, alla fine dell’attività
lavorativa dopo la manipolazione di materiale biologico.
3 Le apparecchiature di laboratorio devono essere sistemate e ripulite in modo corretto dopo
l’uso.
Sull’etichetta dei reagenti sono riportati:
3 nome del prodotto
3 composizione chimica
3 simboli di pericolosità
3 frasi di rischio e sicurezza
SIMBOLI DI PERICOLO
Tossico: sostanza chimica che
può causare danni acuti o
cronici all’organismo
Infiammabile: qualsiasi sostanza
liquida, solida, vapore o gas che si
infiammi
facilmente
e
bruci
rapidamente.
Materiale ossidante: sostanza in
grado di rilasciare ossigeno che
può incrementare o accellerare la
combustione.
Esplosivo: materiale che produce un
istantaneo e improvviso rilascio di
pressione, gas o calore quando sottoposto
ad un brusco shock, pressione o
temperatura.
Corrosivo: sostanza chimica
che provoca distruzione visibile
o alterazione irreversibile dei
tessuti organici nel punto di
contatto.
Irritante: materiale non corrosivo che
causa effetti infiammatori reversibili sui
tessuti viventi attraverso l’azione chimica
nel punto di contatto in funzione della
concentrazione e del tempo di esposizione.
3
• TECNICHE DI ASETTICITA’
Le finalità di queste tecniche sono:
a)
ottenere e mantenere pure le colture di microrganismi
b)
svolgere il lavoro in laboratorio di microbiologia con sicurezza
Una “coltura pura” è costituita solo da una specie di microrganismo.
La contaminazione delle colture è a rischio in qquanto i microbi si trovano ovunque,
q sulla
pelle, nell’aria, sulle superfici dei piani di lavoro.
Le regole fondamentali delle tecniche di asetticità sono:
-
usare terreni e attrezzature sterili
lavorare vicini alla fiamma del bunsen
sollevare i coperchi delle piastre Petri solo parzialmente
tenere i tappi delle provette tra le dita e non appoggiati sul bancone
flambare il collo della superficie esterna delle provette prima e dopo il prelievo
arroventare le anse e gli aghi da inoculo alla fiamma per l’intera lunghezza dell’astina
metallica, sia prima che dopo i prelievi
la fiamma del bunsen in uso deve essere ossidante, blu e alta circa 5 cm
quando il bunsen non si usa si deve lasciare la fiamma gialla, in modo da poterla
vedere facilmente
sterilizzare la vetreria e il materiale monouso usati,
usati dopo ll’uso
uso dentro apposite buste
autoclavabili
disinfettare il bancone di lavoro accuratamente
sistemare tutto il materiale utilizzato in modo corretto
INCUBAZIONE DELLE COLTURE
Scrivere sulla base della piastra Petri prima
dell’inoculo indicando il nome dell’operatore, la
data, il nome del microrganismo, in modo da
riconoscere la piastra e sapere ciò che contiene.
Le colture pure in piastra devono essere sigillate con
nastro adesivo.
4
• TECNICHE DI STERILIZZAZIONE
Sterilizzazione: trattamento termico, chimico e gassoso per eliminare ogni forma di vita.
Può essere realizzata con:
a- calore secco
b- calore umido
c- filtrazione
CALORE SECCO
a) aria calda
La stufa a secco, utilizza temperature molto alte e serve a sterilizzare la vetreria
messa in contenitori metallici o ricoperta con carta di alluminio.
I parametri d’uso della stufa sono:
160° per 60’
150° per 120’
140° per 180’
b) flambatura
Alla fiamma del bunsen, si può sterilizzare la superficie esterna delle provette, o
delle beute.
La fiamma del bunsen esercita un’azione germicida nell’aria intorno alla fiamma per
un raggio di circa 10 cm, creando una zona sterile.
c) arroventamento
Alla fiamma del bunsen, è anche possibile sterilizzare l’ansa o l’ago prima e dopo i
prelievi.
Pinze o spatole si sterilizzano dopo averle immerse in alcool e poi passate alla
fiamma.
TEMPERATURE DELLA FIAMMA DEL BUNSEN
5
CALORE UMIDO
a) tindallizzazione
La soluzione da sterilizzare viene esposta a vopore fluente ad una temperatura di 100°
100 C
con un trattamento ripetuto per 3 giorni. Il trattamento è indicato per terreni nei quali
possono crescere spore, le quali sfuggite al primo riscaldamento, vengono eliminate con
il secondo e il terzo.
b) vapore sotto pressione
Per questa tecnica si usa l’autoclave che unisce l’azione del calore alla pressione.
Il potere di penetrazione del vapore acqueo nel substrato viene aumentato.
La sterilizzazione viene effettuata di solito a 121° per 15’
15’.
Tabella di sterilizzazione in autoclave:
Temperatura
Pressione (atm)
tempo (minuti)
110
0,5
150
115
0,75
50
120
1
15
125
1,35
6,5
FILTRAZIONE
a) filtri millipore
Si utilizza per le sostanze che non possono essere
sterilizzate a caldo (zuccheri, latte, vitamine), si usano filtri
porosi di acetato di cellulosa, capaci di trattenere i batteri di
grandezza superiore ai loro pori.
b) membrane filtranti
Per filtrare campioni liquidi, al fine di trattenere i batteri in
esso presenti, si utilizzano opportune membrane con
l’apposito apparato di filtrazione.
c) cappa a flusso laminare
Serve per eseguire al suo interno manipolazioni
microbiologiche per eliminare la contaminazione dei
prodotti ma anche dell’operatore e dell’ambiente.
6
• APPARECCHIATURA DA LABORATORIO
MICROSCOPIO
Strumento capace di fornire un'immagine ingrandita di un piccolo
oggetto osservato attraverso di esso.
Il microscopio è composto di:
- una parte meccanica detta stativo
- una parte ottica
USO DEL MICROSCOPIO
- accendere la luce
- porre il vetrino sul tavolino traslatore, sistemare il preparato rivolto verso l’alto e in prossimità
dell’apertura centrale del tavolino
- avvicinare il tavolino all’obiettivo più piccolo (4x) mediante la vite macrometrica
- mettere a fuoco
f
con la
l vite
i micrometrica
i
i
- regolare l’intensità della luce
- regolare l’apertura del diaframma considerando che con l’obiettivo 100x il diaframma deve avere la
massima apertura
- spostare il preparato sul tavolino mediante il sistema di viti poste al di sotto di esso
- individuare un buon campo e quindi ruotare l’obiettivo successivo (10x) e passare poi al 40x
mantenendo sempre il fuoco
- abbassare
bb
l
leggermente
il tavolino
li traslatore,
l
mettere una goccia
i di olio
li da
d immersione
i
i
all centro del
d l
vetrino, abbassare l’obiettivo 100x con cautela verso la goccia e mettere a fuoco
- descrivere quanto osservato
PRECAUZIONI D’USO DEL MICROSCOPIO
- non lasciare i vetrini sul tavolino traslatore
- togliere
t li l’olio
l’ li dall’obiettivo
d ll’ bi tti 100X ddopo averlo
l usato
t utilizzando
tili
d la
l carta
t imbevuta
i b t di alcool
l l
- non far toccare gli obiettivi al preparato
- non forzare alcuna manopola e non svitare gli obiettivi o gli oculari
CAPPA A FLUSSO LAMINARE
La cappa consente la protezione dell’operatore e dell’ambiente
dal rischio di contaminazione con batteri e permette di lavorare in
condizioni di sterilità. Il flusso continuo di aria sterile, all’interno
della cabina, impedisce la fuoriuscita verso l’esterno, di microbi. La
sterilizzazione viene realizzata facendo passare l’aria attraverso dei
filtri. E’ opportuno accendere la cappa circa 20’ prima di iniziare a
lavorare per assicurare una completa sterilità all’interno della stessa.
7
AUTOCLAVE
L’autoclave viene usata per sterilizzare terreni di coltura, soluzioni acquose e
colture
lt
di rifiuto.
ifi t Nel
N l processo di sterilizzazione,
t ili
i
viene
i
usato
t il vapore add alta
lt
pressione, di solito 121°C. I microbi si eliminano meglio con il caldo umido che
con quello secco della stufa, perché il vapore denatura le loro proteine.
Assicurarsi prima di tutto che ci sia acqua sufficiente che copra la serpentina di
rame in modo che non scaldi a secco durante il processo. Il coperchio deve essere
perfettamente chiuso prima di iniziare il ciclo di sterilizzazione, quando questo è
completato, si attende che l’autoclave sia raffreddata prima di aprirla. L’apertura
anticipata del coperchio può causare l’ebollizione dei liquidi nei recipienti.
PRECAUZIONI D’USO DELL’AUTOCLAVE
Esistono due fattori critici per la riuscita del processo:
- tutta l’aria deve fuoriuscire dall’autoclave in modo tale che il vapore entri a contatto con la superficie di
ciò che deve essere sterilizzato. In caso contrario la temperatura resterebbe più bassa.
- i materiali
t i li non devono
d
essere sigillati,
i ill ti tappi
t i e coperchi
hi devono
d
essere appena avvitati.
it ti In
I tal
t l modo
d l’aria
l’ i
contenuta al loro interno può uscire liberamente.
- il tempo deve essere sufficiente per permettere al vapore di penetrare nei contenitori.
TERMOSTATO
Apparecchio a circolazione d’aria calda, termoregolato, che permette
di mantenere costante la temperatura. Ha un intervallo di temperatura
compresa tra 20 e 80°C. Internamente ci sono dei ripiani forati per
favorire la circolazione dell’aria. Le colture batteriche, dopo la
semina nei terreni appositi, vengono poste ad incubare nei termostati
dove la temperatura è impostata a 37° in quanto ottimale per il loro
sviluppo.
BAGNOMARIA
Apparecchio che consente di mantenere terreni di colture a temperatura costante
in bagni di acqua. Ha un intervallo di temperatura compresa tra 25 e 98°C.
All’i t
All’interno
contiene
ti
d i portaprovette,
dei
t
tt il coperchio
hi è a timpano
ti
per permettere
tt
all’acqua di condensazione di ricadere all’interno. Il bagnomaria si usa per tenere
in incubazione test sierologici a 37°C e per l’agar fuso pronto per l’uso per le
semine in dispersione.
BILANCIA TECNICA
Strumento destinato alla misura dei pesi. Permette di pesare quantità fino
a 2000 g circa, con sensibilità di 0.01 g.
8
CENTRIFUGA
La centrifugazione è un metodo di separzione della fase liquida nelle sospensioni,
per mezzo della forza centrifuga.
centrifuga La centrifuga è costituita da un rotore parte
mobile e girevole, con logge fisse per la collocazione delle provette. Sul pannello
frontale sono inseriti un orologio per regolare la durata della centrifugazione, una
manopola per regolare la velocità, un freno automatico per abbreviare i tempi di
arresto. Prima di centrifugare è necessario che le provette nel rotore siano
equilibrati. Il rotore deve poi essere portato progressivamente alla velocità
desiderata.
CONTACOLONIE DIGITALE QUEBEC
Apparecchio per l’osservazione e il conteggio delle colonie cresciute in piastra
attraverso l’impiego di una lente di ingrandimento (x1,5), un piano d’appoggio
centimetrato e illuminato. Un contatore digitale registra automaticamente i dati
ottenuti esercitando una lieve ppressione,, con una ppenna,, sulla superficie
p
della
piastra, in corrispondenza di ogni colonia.
STUFA
Apparecchio a circolazione d’aria calda utilizzabile sia
per asciugare che per sterilizzare la vetreria. La temperatura di
esercizio è compresa tra +50° e +290°C.
PHMETRO
Strumento che consente di misurare il valore del pH delle
soluzioni acide o basiche. Si basa sulla misura della differenza di
potenziale che si istaura fra due elettrodi immersi nella
soluzione da saggiare.
FRIGORIFERO
Apparecchio che serve a incubare a basse temperature e per la conservazione di
campioni
i i e materiale.
t i l Il frigorifero
f i if
i f tti permette
infatti
tt la
l batteriostasi,
b tt i t i cioè
i è l’assenza
l’
di crescita o di riproduzione della coltura. Gli aerobi possono essere conservati
per mesi in agar inclinato, gli anaerobi infissi in agar. La conservazione in frigo
ha degli svantaggi quali la breve durata di immagazzinamento, quindi l’obbligo di
trapianti frequenti e la facile inquinabilità delle colture.
9
U.D. 1.2 UBIQUITÀ DEI MICRORGANISMI
OBIETTIVO:
Scoprire che i microrganismi hanno la capacità di popolare qualsiasi ambiente ed osservare i
caratteri morfologici delle colonie che si sono sviluppate.
PRINCIPIO:
L’ubiquità dei microrganismi può essere messa in evidenza contaminando con diversi ambienti
(acqua, latte, polpastrelli, aria, terriccio…) piastre di Petri riempite con Nutrient agar per
contatto diretto o per esposizione.
Poiché il terreno Nutrient agar possiede i nutrienti capaci di far crescere un gran numero di
microrganismi,
i
i i la
l loro
l
presenza in
i ambienti
bi ti diversi
di
i saràà evidenziata
id i t dallo
d ll sviluppo
il
di colonie
l i
visibili ad occhio nudo.
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Acqua di pozzo (lago o fiume),
fiume) latte fresco o pastorizzato,
pastorizzato yogurt,
yogurt polpastrelli delle dita,
dita
aria di una stanza, terriccio o torba….
TERRENI DI COLTURA
Nutrient agar
VETRERIA, ...
Piastre sterili monouso, contenitori sterili, spatole sterili monouso, pipette pasteur
monouso, beuta, provette, bacchette vetro
STRUMENTI
Bilancia, autoclave, bunsen, termostato, contacolonie o lente di ingrandimento
10
METODICA
(1a FASE) A CURA DELL’INSEGANTE
1
Preparare il terreno.
2
Distribuire in provettoni con tappo metallico
(18-20 ml per provettone).
3
Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15’.
4
Piastrare in ambiente sterile.
(2a FASE) A CURA DEGLI STUDENTI
Seminare:
a) una piastra con 0,1ml di acqua, una con 0,1ml di
g pper spatolamento
p
latte ed una con 0,1ml di yyogurt
1
b) una piastra appoggiando delicatamente i
polpastrelli sul terreno per qualche secondo
c) una piastra lasciandola aperta per circa 20-30’
nella stanza prescelta
d) una piastra con 0,1 ml di sospensione di terriccio
preparata prelevando 2/3 spatolate di terriccio,
sciolto in 50 ml di acqua distillata sterile
- lasciare una piastra senza seminarla come prova in bianco
- siglare le piastre con il proprio nome e il tipo di
batteri seminati
2
Incubare le piastre capovolte a 37° C per 48 h.
11
(3a FASE) A CURA DEGLI STUDENTI
1
Osservare le colonie formatesi e descriverle in relazione a:
a) numero
b) forma
c) margine
d) profilo
puntiforme
intero
piatto
e) superficie
liscia
f) consistenza
compatta
rotonda
lenticolare
irregolare
rizoide
filamentosa
ondulato
convesso
umbonato
rugosa
lucida
opaca
sfaldabile
pastosa
mucosa
g) colore
Disegna ciò che hai osservato
12
2. OSSERVARE I MICRORGANISMI
U.D. 2.1 COLORAZIONE SEMPLICE CON BLU DI METILENE
OBIETTIVO:
Osservare la forma di diversi microrganismi utilizzando una colorazione semplice.
PRINCIPIO:
I coloranti usati in microbiologia sono sostanze organiche nelle quali sono presenti gruppi
funzionali detti “cromofori” associati alla produzione di colore. Si distinguono in coloranti
basici (blu di metilene, violetto di genziana, safranina) e acidi (nigrosina, fucsina acida). La
colorazione aumenta il contrasto con l’ambiente rendendo più visibili le cellule. Poiché i batteri
sono ricchi di acidi nucleici, si colorano molto bene con coloranti basici come il Blu di
metilene.
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Escherichia coli e Staphilococcus epidermidis
MATERIALI CHIMICI
Blu di metilene, olio da immersione
VETRERIA, ...
Vetrini portaoggetto, ansa, vaschetta per colorazione, spruzzetta, pinza di legno
STRUMENTI
Microscopio, bunsen
Blu di metilene 1%:
aggiungere, in una bottiglia con contagocce, ad 1 g di blu di metilene 99 ml di acqua
distillata. Agitare fino a completa dissoluzione.
13
METODICA
(1a FASE) fissazione
1
Prelevare con un ansa sterile un po’ di materiale
batterico da una colonia isolata.
2
Distendere il materiale su un vetrino dove era stata
precedentemente messa una goccia di acqua
distillata.
3
Essiccamento: lasciare asciugare a temperatura
ambiente fino a completa evaporazione dell’acqua.
Fissazione: passare velocemente il vetrino, tenuto con
una pinza, sulla zona più calda della fiamma del becco
b
bunsen,
per almeno
l
tre volte.
l
(2a FASE) colorazione
1
Dopo aver appoggiato il vetrino su una vaschetta per
la colorazione, aggiungere qualche goccia di blu di
metilene.
Attendere circa 3 minuti, quindi lavare con acqua
mediante una spruzzetta.
Eliminare buona pparte dell’acqua
q
di lavaggio
gg
inclinando il vetrino; asciugare delicatamente, prima
con carta da filtro, poi all’aria.
14
METODICA
(1a FASE) osservazione al microscopio
Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo,
pprocedendo pper ggradi,, dagli
g obiettivi a secco a ppiccolo
ingrandimento, fino all’obiettivo ad immersione e
registrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno.
1
I più comuni tipi morfologici dei batteri
cocchi
bastoncelli
streptococchi
stafilococchi
vibrioni
15
diplococchi
spirilli
U.D. 2.2 COLORAZIONE NEGATIVA CON NIGROSINA
OBIETTIVO:
Osservare la forma di diversi microrganismi utilizzando una colorazione che, non richiedendo
fissazione, permette una visione senza artefatti della morfologia batterica.
PRINCIPIO:
La Nigrosina è un colorante acido che non è in grado di penetrare all’interno dei batteri e forma
dunque un deposito scuro attorno alle cellule che vengono evidenziate per contrasto.
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus
MATERIALI CHIMICI
Nigrosina, olio da immersione
VETRERIA, ...
Vetrini portaoggetto,
portaoggetto ansa,
ansa vaschetta per colorazione,
colorazione spruzzetta,
spruzzetta pinza di legno
STRUMENTI
Microscopio, bunsen
Nigrosina 2%:
aggiungere, in una bottiglia con contagocce, a 2 g di nigrosina 99 ml di acqua
distillata. Agitare fino a completa dissoluzione.
16
METODICA
(1a FASE) colorazione
1
Deporre una goccia di nigrosina su un vetrino
portaoggetti.
2
Prelevare con un ansa sterile un po’ di materiale
batterico da una colonia isolata e miscelarla con
la nigrosina.
3
Distendere uniformemente il materiale sul vetrino
asciugare all’aria non scaldare e non fissare alla
fiamma.
(2a FASE) osservazione al microscopio
1
Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo,
procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo
ingrandimento, fino all’obiettivo ad immersione e
registrare i risultati ottenuti anche mediante un
disegno.
17
U.D. 2.3 COLORAZIONE STRUTTURALE DELLE SPORE (secondo Shaeffer e Fulton)
OBIETTIVO:
Osservare la presenza di endospore e spore libere.
PRINCIPIO
PRINCIPIO:
Le endospore, colorate a caldo con verde malachite, sono in grado di trattenere il colorante
anche dopo lavaggio, a differenza delle altre parti della cellula che assumono il colore del
colorante di contrasto (safranina).
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Bacillus subtilis
MATERIALI CHIMICI
Verde malachite 5%, safranina, olio da immersione
TERRENI DI COLTURA
Agar al manganese
VETRERIA, ...
Vetrini portaoggetto, ansa, vaschetta per colorazione, spruzzetta, pinza di legno, piastre
sterili, beuta, provette
STRUMENTI
Microscopio, autoclave, termostato, bilancia, bunsen
Agar al manganese:
- Nutrient broth
8g
- Agar
A
20 g
- MnCl2 1%
0,5 ml
- Acqua
1000 ml
Unire al brodo l’agar e scaldare, aggiungere poi 0,5 ml di MnCl2 1% in acqua.
Preparazione soluzione di safranina:
1 g di safranina sciolta in 10 cc di alcool, aggiungere acqua fino a 100 cc.
18
METODICA
(1a FASE) a cura dell’insegnante
1
Preparare delle provette con 16-18 ml di agar al
manganese.
2
Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15’.
3
Piastrare in ambiente sterile e lasciar solidificare.
4
S
Seminare
i
per striscio
t i i un’ansata
’
t ddella
ll coltura
lt
iin
esame.
5
Incubare a 35° per 18-24 h.
19
METODICA
(2a FASE) a cura dello studente
1
Allestire e fissare un vetrino con una delle colonie
ottenute nella 1a FASE.
Appoggiare
A
i
il vetrino
ti
su un sostegno
t
sopra una
vaschetta contenente acqua la quale verrà portata
all’ebollizione.
Colorare abbondantemente con verde malachite,
lasciare il vetrino esposto al vapore che si sviluppa
per 3-5’ e aggiungere ancora il colorante facendo
attenzione che il vetrino non rimanga a secco.
(per evitare che il vetrino cada nella vaschetta
(p
trattenerlo con una pinza di legno)
2
3
Lavare con acqua e colorare con safranina per 5’.
Dopo aver lavato abbondantemente con acqua
asciugare delicatamente.
(2a FASE) osservazione al microscopio
1
Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo,
procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo
ingrandimento, fino all’obiettivo ad immersione e
registrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno.
20
U.D. 2.4 COLORAZIONE STRUTTURALE DELLA CAPSULA
OBIETTIVO:
Osservare la presenza di batteri capsulati utilizzando una colorazione che, non richiedendo
fissazione, permette una visione senza artefatti della morfologia batterica.
PRINCIPIO:
La capsula dei batteri non ha alcuna affinità per i coloranti perciò per metterla in evidenza si fa
ricorso a colorazioni negative.
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Sospensione batterica (inoculo di terra)
MATERIALI CHIMICI
Inchiostro di china al 10%
VETRERIA, ...
V t i i portaoggetto,
Vetrini
t
tt vetrini
t i i coprioggetto,
i
tt ansa, vaschetta
h tt per colorazione,
l
i
spruzzetta,
tt
pinza di legno
STRUMENTI
Microscopio, bunsen
21
METODICA
(1a FASE)
1
Deporre una goccia di inchiostro di china diluito al
10% su un vetrino portaoggetti.
2
Prelevare con un ansa sterile un po’ di materiale
batterico da una colonia isolata.
3
Sospendere il materiale sull’inchiostro di china e
coprire con un vetrino coprioggetto.
(2a FASE) osservazione al microscopio
1
Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo,
obiettivo
procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo
ingrandimento, fino all’obiettivo ad immersione e
registrare i risultati ottenuti anche mediante un
disegno.
22
U.D. 2.5 COLORAZIONE DIFFERENZIALE DI GRAM
OBIETTIVO:
Questa colorazione consente la suddivisione di tutti i batteri in due categorie: i Gram+ e i Gram-.
PRINCIPIO:
L diversa
La
di
colorazione
l
i
che
h assumono i batteri
b tt i con questa
t tecnica
t i dipende
di d dalle
d ll differenze
diff
esistenti nella loro parete cellulare.
La parete dei Gram+ è costituita in gran parte da uno spesso strato di peptidoglicano che non
permette la decolorazione della cellula batterica (colorata precedentemente con il colorante
basico cristal violetto) da parte del decolorante. I Gram+ rimangono dunque colorati in violetto.
I Gram- hanno una parete multistratificata che, per la sua composizione chimica, risulta
permeabile all’agente decolorante. Questi batteri dunque si colorano con il colorante di
contrasto, la Safranina, assumendo una colorazione rosa.
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus e
Escherichia Coli
MATERIALI CHIMICI
Cristal violetto, liquido di Lugol, safranina, decolorante alcool-acetone, olio da
immersione
VETRERIA, ...
Vetrini portaoggetto, ansa, vaschetta per colorazione, spruzzetta, pinza di legno
STRUMENTI
Microscopio, bunsen
Le soluzioni coloranti vengono preparate come soluzioni idroalcooliche che si
allestiscono
ll ti
sciogliendo
i li d nell’alcool
ll’ l l il colorante:
l
t
Sostanza colorante in polvere
g 10
Alcool etilico assoluto
ml 100
Si lascia a contatto per qualche giorno ottenendo una soluzione satura. Queste
soluzioni necessarie a mantenere a lungo i coloranti, non sono adatte ad essere usate
direttamente nelle colorazioni. Pertanto, con una diluizione in acqua, si ottengono
soluzioni idroalcooliche:
Soluzione alcoolica madre del colorante
ml 10
Acqua distillata
ml 90
23
METODICA
(1a FASE) fissazione e colorazione
1
Prelevare con un ansa sterile un po’ di materiale
batterico da una colonia isolata.
2
Distendere il materiale su un vetrino dove era
stata pprecedentemente messa una ggoccia di
acqua distillata.
Essiccamento: lasciare asciugare a temperatura
ambiente fino a completa evaporazione dell’acqua.
3
4
Fissazione: passare velocemente il vetrino, tenuto
con una pinza,
pinza sulla zona più calda della fiamma del
becco bunsen, per almeno tre volte.
a) colorare il preparato depositando, mediante una
pipetta qualche goccia del 1° colorante (cristal
violetto), lasciare agire per 1’
b) lavare con acqua distillata e poi coprire con il
liquido di Lugol e lasciare agire per 1’, lavare ancora
con acqua
c) decolorare con soluzione alcool-acetone e
sciacquare immediatamente
d) colorare con la soluzione di contrasto (safranina)
per 1’, sciacquare accuratamente e asciugare il
vetrino.
Dopo aver lavato abbondantemente con acqua
asciugare
g delicatamente
(2a FASE) osservazione al microscopio
1
Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo,
procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo
ingrandimento, fino all’obiettivo ad immersione e
registrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno.
24
3. LA COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMI
U.D. 3.1 ALLESTIMENTO DI COLTURE BATTERICHE CON DIVERSE
TECNICHE DI SEMINA
OBIETTIVO:
Acquisire la corretta manualità nelle varie tecniche di semina e la consapevolezza degli scopi
per i quali la semina viene effettuata.
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche
TERRENI DI COLTURA
Terreni di coltura liofilizzati (Nutrient agar, TSA, TSB, Nutrient broth, Gelatina)
VETRERIA, ...
Piastre Petri sterili, pipette graduate sterili, provettoni, provette, tamponi faringei sterili,
spatole sterili, anse, aghi, cilindri
STRUMENTI
Bilancia, autoclave, termostato, bunsen
UTILIZZO DEI TERRENI DI COLTURA DISIDRATATI
Solubilizzazione:
pesare il terreno e porlo in una beuta e aggiungere la metà del volume di acqua
distillata richiesta. Agitare per solubilizzare poi aggiungere l’acqua rimanente lavando
le pareti della beuta. Utilizzare sempre beute di volume almeno 2 volte e mezzo quello
della sospensione. Riscaldare per ottenere una completa solubilizzazione agitando
continuamente fino ad arrivare all’ebollizione. La completa solubilizzazione dopo
alcuni minuti di ebollizione, è indicata dalla trasparenza della soluzione.
25
SEMINA IN TERRENO SOLIDO
1
Tecnica di trasferimento per striscio su piastra (a)
Operare in ambiente sterile, passare l’ansa alla fiamma e,
dopo averla raffreddata, prelevare un po’ di patina batterica
da una piastra o da una provetta. Trasferire il materiale su
una piastra sterile strisciando l’ansa con movimenti ampi a
zig-zag senza incidere il terreno, non tornare sui punti già
seminati. Sterilizzare l’ansa dopo l’uso.
La crescita si manifesta con formazione di colonie
confluenti e isolate presenti sulla superficie dell’agar.
2
Tecnica di trasferimento per striscio su piastra (b)
3
2
1
Sempre operando in ambiente sterile, passare l’ansa alla
fiamma e, dopo averla raffreddata, prelevare un po’ di
patina batterica. Trasferire il materiale su una piastra sterile
strisciando l’ansa con movimenti a zig-zag senza incidere il
) Sterilizzare e raffreddare
terreno solo su metà ppiastra ((1).
l’ansa, ruotare la piastra e riprendendo dal punto interrotto,
strisciare l’altra metà della piastra (2); ripetere l’operazione
un’altra volta in modo da ottenere tre strisci in tre diverse
direzioni (3).
La crescita si manifesta con formazione di colonie
confluenti nella prima metà e isolate nella seconda metà
d ll piastra,
della
i
presentii sulla
ll superficie
fi i dell’agar.
d ll’
26
SEMINA IN TERRENO SOLIDO
1
Tecnica di trasferimento pper striscio su ppiastra ((c))
Nel caso in cui si voglia ottenere una crescita compatta, si
può effettuare lo striscio con tamponi sterili che vengono
passati più volte e in più direzioni sul terreno. Immergere
un tampone in un brodo e trasferire il materiale su una
piastra sterile strisciando più volte sulla superficie. Ruotare
la piastra e strisciare ancora; sterilizzare
sterili are il tampone dopo
l’uso.
La crescita si manifesta con formazione di una patina più o
meno omogenea.
2
Tecnica dello spatolamento in piastra (d)
Operando sotto una cappa sterile o accanto alla fiamma
del bunsen, prelevare con una pipetta sterile 0,1 ml di
brodocoltura e trasferirlo al centro di una piastra con
agar nutrient. Con una spatola sterile distribuire
ll’inoculo
inoculo sulla superficie dell
dell’agar
agar in tutte le direzioni.
Rovesciare la piastra ed incubarla a 28°-32° per 2448h.
Deporre la spatola nell’apposito sacchetto per la
sterilizzazione.
La crescita si manifesta con lo sviluppo di una patina
ppresente sulla superficie
p
dell’agar.
g
27
SEMINA IN TERRENO SOLIDO
1
Tecnica della inclusione o diffusione in piastra (e)
Nell’inclusione usiamo pipette sterili graduate per
trasferire volumi precisi di inoculi nelle piastre.
Successivamente si riempie la piastra con terreno di
coltura sterile mantenuto fuso a b.m. a 45°C. Se la
sospensione da seminare è concentrata, si procede ad
una diluizione come nella sezione 4.1.
La crescita si manifesta con lo sviluppo di colonie
isolate presenti sulla superficie dell’agar ma soprattutto
in profondità.
2
Dil i i
Diluizione
ed
d iinclusione
l i
(f)
Diluire la brodocoltura quando è particolarmente
concentrata procedendo ad una diluizione come nella
sezione 4.1. Predisporre 4 piastre nelle quali verserete
1 ml di ogni diluizione preparata mettendo nella prima
piastra l’inoculo concentrato (conc. 100). Versare il
terreno sterile, mantenuto fuso a b.m., nelle piastre
seminate, chiuderle e miscelare con un movimento
rotatorio lasciar solidificare.
rotatorio,
solidificare
Le colonie crescono sia in superficie che in profondità
e se la semina è stata fatta bene, le colonie saranno in
progressiva diminuzione, di aspetto uniforme e più
piccole
dove
il
numero
è
maggiore.
Contaminazione
Bassa (+)
Media (++)
Alta (+++)
28
Altissima (++++)
SEMINA IN TERRENO SOLIDO
1
Tecnica di isolamento e striscio su “slant”
Operare in ambiente sterile, passare l’ansa alla fiamma e,
dopo averla raffreddata, prelevare un po’ di patina batterica
da una piastra. Aprire e flambare la provetta, trasferire il
materiale strisciando l’ansa con movimenti a zig-zag senza
incidere il terreno ppartendo dal fondo della pprovetta.
Sterilizzare l’ansa dopo l’uso.
La crescita si manifesta attraverso la presenza di veli o
patina di consistenza cremosa o secca.
2
Tecnica di trasferimento per striscio da slant a slant (o “becco di clarino”)
Sempre operando in ambiente sterile, passare l’ansa alla
fiamma e raffreddarla. Impugnare le due provette con una
mano, togliere i tappi e flambare l’imboccatura alla fiamma.
Prelevare un po’ di patina batterica dalla prima provetta,
trasferire il materiale strisciando l’ansa con movimenti
mo imenti a
zig-zag senza incidere il terreno partendo dal fondo della
seconda provetta. Flambare e tappare le due provette.
Sterilizzare l’ansa dopo l’uso.
Anche qui la crescita si manifesta attraverso la presenza di
veli o patina di consistenza cremosa o secca.
3
Tecnica per infissione in agar o gelatina
Si utilizza questa semina con un ago per inoculare terreni
solidificati in provetta. L’ago consente di inserire le cellule
lungo una linea verticale e in profondità, per permettere lo
sviluppo dei batteri anaerobi e favorire l’osservazione di
forme mobili che si diffondono a partire dalla linea
d ll’i
dell’inoculo.
l
29
SEMINA IN TERRENO LIQUIDO
1
Tecnica di trasferimento da “slant” a brodo
Disporre le provette con il ceppo di Escherichia
Coli e il brodo sterile da seminare vicino alla
fiamma. Sterilizzare e raffreddare l’ansa, togliere i
tappi dalle provette e flambarle. Prelevare con
l’ansa un po’ di patina batterica dallo slant, inserire
l’ansa con l’inoculo nel brodo sterile e stemperare.
Flambare e tappare le provette. Sterilizzare l’ansa
dopo l’uso.
2
Tecnica di trasferimento mediante pipetta
Disporre le provette con l’inoculo in brodo e il
brodo sterile da seminare vicino alla fiamma,
togliere i tappi dalle provette e flambarle.
Prelevare con una pipetta sterile 1 ml di inoculo
dalla prima provetta e trasferirla nella seconda.
Flambare e tappare le provette. Deporre la pipetta
nell’ apposito sacchetto per la sterilizzazione.
nell
La crescita in brodo si evidenzia a occhio nudo
attraverso:
- intorbidamento del terreno;
- formazione di un sedimento sul fondo della
provetta che agitato sale verso l’alto;
- formazione di fiocchi o granuli in sospensione.
3
Incubare i terreni seminati insieme ad alcuni non
seminari, come controllo, a 37° per 24-48h
30
U.D. 3.2 I BATTERI DELLO YOGURT
OBIETTIVO:
Isolamento in coltura pura dei fermenti lattici nello yogurt
PRINCIPIO:
Nello yogurt sono generalmente presenti due gruppi batterici: il Lactobacillus bulgaricus e lo
Streptococcus thermophilus, che trasformano il lattosio presente nel latte in acido lattico.
Lo striscio, in MRS agar, permette l’isolamento dei lattobacilli, mentre l’M17 favorisce la
crescita degli streptococchi lattici e inibisce quella del Lactobacillus bulgaricus.
Pur essendo improbabile, per l’acidità dello yogurt e per le norme igieniche di produzione e
conservazione la presenza di microrganismi contaminananti,
conservazione,
contaminananti è tuttavia possibile verificare
l’eventuale presenza di batteri coliformi Gram- seminando in Levine EMB Blue agar che
consente di differenziare le colonie di E. coli in base alla presenza di riflessi verdi metallici e
alla colorazione violacea con centro nero.
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Yogurt
MATERIALI CHIMICI
Sol. di Ringer, reattivi per anaerobiosi, cartina indicatrice
TERRENI DI COLTURA
g , M17 agar,
g , EMB blue agar
g
MRS agar,
VETRERIA, ...
Beute, cilindri, bacchette, provette, beuta da 100 ml, piastre sterili, ansa
STRUMENTI
Bilancia, autoclave, termostato, giara per anaerobiosi, bunsen
Soluzione di Ringer
Sodio cloruro 9 g, Potassio cloruro 0,42 g, Calcio cloruro anidro 0,24 g, Sodio
bicarbonato 0,2 g, acqua distillata 1 litro. Viene impiegata nella diluizione di 1:4 con
acqua distillata.
distillata
In alternativa soluzione di Ringer in tavolette
Sciogliere 1 tavoletta in 500 ml di acqua distillata sterile.
31
METODICA
1
Preparere i terreni e la sol. di Ringer, sterilizzare dopo
aver controllato il pH dei terreni (pH 6,2) con la cartina
indicatrice.
2
Piastrare i tre diversi terreni e raffreddare.
3
Prelevare 10 g di yogurt sterilmente, diluirlo in 100 ml
di Ringer sterile omogenizzando bene.
4
5
Per striscio seminare 3 piastre dei terreni diversi.
anaerobiosi
Poiché i lattobacilli crescono bene in anaerobiosi,
aggiungere sopra lo striscio un altro strato di MRS e
solidificare. In alternativa usare la giara come all’unità
3.3
Mettere in termostato a 37
37° per 2 o 3 giorni.
giorni
Controllare la crescita e la presenza di colonie isolate,
confermare il tipo di microrganismo per mezzo della
colorazione di gram.
Coltura mista di Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus
thermophilus dello yogurt al microscopio elettronico
32
U.D. 3.3 EFFETTO DI DIVERSI FATTORI AMBIENTALI
SULLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI
OBIETTIVO:
Verificare l’adattamento di alcune specie microbiche a condizioni differenti di
ossigenazione e di pH del mezzo di crescita.
PRINCIPIO:
Ogni specie microbica presenta esigenze nutrizionali e colturali diverse. Variando in
modo controllato alcuni fattori ambientali si può valutare la risposta di ciascuna specie
microbica in esame attraverso l’osservazione della crescita in coltura.
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Brodocolture di Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccaromyces cerevisiae
MATERIALI CHIMICI
Reattivi per anaerobiosi (catalizzatori, indicatori), cartina indicatrice (test a)
Soluzioni di HCl 1 M (100 ml), HCl 0,1 M (100 ml), NaOH 1 M (100 ml) e
NaOH 0,1 M (100 ml) (test b)
TERRENI DI COLTURA
Glucose agar (test a)
TSB (test b)
VETRERIA, ...
Beute, cilindri, bacchette, provette, beker 100 ml, piastre sterili con setto,
ansa, piastre sterili, pipette sterili da 1 ml
STRUMENTI
Bilancia, autoclave, termostato, giara per anaerobiosi, phmetro, bunsen
33
METODICA
test a) Influenza dell’ossigeno atmosferico sulla crescita
Ri
Ricerca
di aerobi,
bi anaerobi
bi e anaerobi
bi facoltativi
f lt ti i
(1a FASE 1° parte)
1
Sciogliere il terreno per una prova in doppio, più il controllo.
2
Distribuire in provette, controllare il pH con la cartina
indicatrice e autoclavare.
3
Piastrare e raffreddare il terreno.
(1a FASE 2° parte)
1
Seminare in ciascuna metà della piastra, in maniera
sterile, mediante striscio, l’inoculo dei due ceppi
batterici. Una piastra va messa in termostato e l’altra
in giara.
34
Giara:
sistemare le piastre capovolte nella giara, inserire
l’indicatore per anaerobiosi e il reattivo per eliminare
l’ossigeno (il reattivo va attivato aggiungendo 10 ml
di acqua nella bustina operando lontano dalla
fiamma per la presenza di idrogeno altamente
i fi
infiammabile);
bil ) la
l reazione
i
viene
i
portata
t t a termine
t
i in
i
circa 60’, dopodiché controllare la pressione nel
manometro (1 atm. circa). Dopo 2-3 ore controllare
se l’indicatore per l’anaerobiosi è virato al rosso.
Riporre la giara e la seconda serie di piastre in termostato a 37° per 48 h. Dopo incubazione
aprire la giara sotto cappa,
cappa controllare la crescita nelle piastre e registrare i risultati secondo
la seguente scala:
-
= assenza di crescita
+
= crescita scarsa
++
= crescita normale
+++
= crescita abbondante
NB: il catalizzatore è situato nell’apposita sede posta sotto il
coperchio della giara; tra un impiego e l’altro va asciugato
riscaldandolo in stufa a 160° per 90’.
35
METODICA
test b) Influenza del pH del mezzo sulla crescita
Si verifica l’influenza del pH sulla crescita coltivando i batteri in terreni in cui
viene variato il pH per aggiunta di acidi o di basi.
(1a FASE 1° parte)
1
Sciogliere il terreno, distribuirlo in 4 beute.
2
Preparare le soluzioni di HCl 1 M (100 ml), HCl 0,1 M
(100 ml), NaOH 1 M (100 ml) e NaOH 0,1 M (100 ml) e
correggere il pH in ognuna delle beute con i valori 3,0-4,57,0-9,0 controllandole con il phmetro.
METODICA
PHMETRO
Accendere il pHmetro almeno 10’ prima dell’uso ed effettuare
la calibrazione. Selezionare il tasto pH e automatico, inserire
l’elettrodo nel campione a pH 7. Pigiare il tasto cal e attendere
che lo strumento si stabilizzi. Lavare e asciugare l’elettrodo e
ripetere
i t l’operazione
l’
i
con il campione
i
a pH
H 4 o 10.
10 Effettuare
Eff tt
l
la
lettura dei vari campioni pigiando il tasto read o = lavando
accuratamente l’elettrodo tra una lettura e l’altra.
3
Distribuire 10 ml in ogni provetta in modo da ottenere 4
provette per ogni prova.
prova Sterilizzare a 121° per 15
15’ e
ricontrollare infine il pH.
(1a FASE 2° parte)
Seminare 1 ml delle due brodocolture in ogni provetta,
incubare sia i tubi seminati che quelli non seminati a 36°
per 24-48 h.
4
Controllare la crescita nei tubi e registrare i risultati secondo la seguente scala:
+
++
+++
= assenza di crescita
= crescita scarsa
= crescita normale
= crescita abbondante
36
4. CRESCITA E CONTROLLO DELLA CRESCITA DEI
MICRORGANISMI
U.D. 4.1 CONTA MICROBICA IN PIASTRA
OBIETTIVO:
Determinare il numero complessivo di microrganismi presenti in un determinato campione
(carica microbica totale): analisi quantitativa.
PRINCIPIO:
Ogni cellula microbica viva, inoculata in piastra per inclusione e incubata, si riproduce
formando una colonia isolata. Contando le colonie sviluppatesi nel terreno si può risalire al
numero di microrganismi presenti in un volume noto del campione.
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Colture batteriche
TERRENI DI COLTURA
N t i t agar
Nutrient
VETRERIA, ...
Beute, cilindri, bacchette, provette, piastre sterili, ansa, pipette sterili da 1 ml
STRUMENTI
Bilancia, autoclave, termostato, bunsen
37
METODICA
Conta dei batteri mediante semina per inclusione in piastra (previa diluizione in serie)
1
Preparare il terreno agar nutrient e sterilizzarlo.
2
Partendo dalla sospensione in esame, preparare
diluizioni scalari 1:10, 1:100, 1:1000 come segue:
prelevare, con una pipetta sterile, 1 ml del
campione in esame e porlo in una provetta
contenente 9 mll di soluzione
l i
fi i l i sterile.
fisiologica
il
Ripetere l’operazione per le successive diluizioni
cambiando opportunamente la pipetta ogni volta.
3
Numerare 4 piastre
10° campione non diluito
10-11 fattore
f tt
di diluizione
dil i i
1:10
1 10
-2
10 fattore di diluizione 1:100
10-3 fattore di diluizione 1:1000
quindi seminarci 0,1 ml di ogni diluizione.
4
5
Versare il terreno sterile mantenuto fuso a b.m.
nelle piastre seminate, chiuderle e miscelare con
un movimento rotatorio, lasciar solidificare.
Incubare a 37° per 48h poi contare al contacolonie,
le colonie ben isolate quando sono comprese tra 100
e 300.
Le colonie crescono sia in superficie che in
pprofondità e se la semina è stata fatta bene, le
colonie saranno in progressiva diminuzione, di
aspetto uniforme e più piccole dove il numero è
maggiore.
38
Predisporre una tabella per i risultati
n. colonie
n. colonie
n. colonie
n. colonie
10°
10-1
10-2
10-3
Campione 1
Campione
p
2
Campione 3
Dalla conta si risale al numero di batteri/ml nelle sospensione in esame mediante la
seguente formula:
N= n*1/d*1/V
N= numero di germi/ml del campione puro
n= numero di colonie nella piastra
1/d= reciproco della diluizione dell’inoculo in quella piastra
1/V= reciproco della frazione di volume considerato (1ml) utilizzato per l’inoculo1/10
di ml
39
U.D. 4.2 CONTA SU TERRENO LIQUIDO
OBIETTIVO:
Determinare il numero complessivo di microrganismi presenti in un determinato campione
(carica microbica totale): analisi quantitativa. (Tecnica classica)
PRINCIPIO:
La crescita in terreni liquidi viene rivelata dall’intorbidamento del terreno e/o sviluppo di gas. Il
numero dei batteri presenti nel campione viene calcolato mediante una stima su base
probabilistica basata sulla determinazione dell’indice MPN (Most probable number) che
rappresenta il numero più probabile di microrganismi presenti in un volume noto di campione di
acqua.
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Colture batteriche
TERRENI DI COLTURA
Brodo lattosato
VETRERIA, ...
Beuta, cilindri, bacchette, provettoni, pipette sterili da 10, 1, 0,1 ml
STRUMENTI
Bilancia, autoclave, termostato, bunsen
40
METODICA
Conta dei batteri su terreno liquido (es: ricerca dei batteri coliformi)
1
P
Preparare
e sterilizzare
ili
3 serie
i di 3 provettonii con 10 mll di terreno.
10 ml di Brodo lattosato
concentrazione doppia
con campanella di durham
2
10 ml di Brodo lattosato
concentrazione normale
con campanella di durham
10 ml di Brodo lattosato
concentrazione normale
con campanella di durham
Seminare.
Campione
10 ml
1 ml
0,1 ml
3
Incubare a 37° per 24-48 ore.
RISULTATI
Prova negativa
Prova positiva
Assenza di gas nella campanella
Presenza di gas nella campanella
Per il calcolo dell’MPN si rileva il numero di prove positive per ogni serie di provette seminate
(3 per serie) e, sulla base della sequenza ottenuta, si risale al numero più probabile tramite
apposita tabella (vedi tabella su U.D. 4.4)
41
U.D. 4.3 CONTA PER FILTRAZIONE SU MEMBRANA
OBIETTIVO:
Determinare il numero complessivo di microrganismi presenti in un determinato campione
(carica microbica totale): analisi quantitativa. (Tecnica delle membrane filtranti)
PRINCIPIO:
Filtrando volumi determinati di liquidi attraverso membrane sterili, con una porosità inferiore a
1 μm, e ponendo tali filtri sulla superficie di terreni agarizzati in piastra, dopo incubazione, si
otterranno colonie isolate che possono venire contate.
MATERIALI E STRUMENTI:
STRUMENTI
TERRENI DI COLTURA
PCA, ENDO broth MF, Faecal coliform broth, Azide maltose agar
VETRERIA, ...
p
sterili da 1-10ml,, pprovette,, pprovettoni,, beute,, campanelle
p
di Durham,, ppiastre
Pipette
sterili, filtri sterili con membrana da 0,2 μm
STRUMENTI
Apparato per la filtrazione, autoclave, contacolonie, bilancia, termostato, cappa sterile,
pompa da vuoto, bunsen
42
METODICA
Procedimento A (Conta batterica totale)
(1a FASE)
1
Sterilizzare dentro una busta per autoclave l’apparato
di filtrazione (composto dall’imbuto, il porta filtro, la
beuta codata), pinze di metallo, un cilindro da 100
ml, 5 matracci da 100 ml, pipette graduate da 10 ml.
2
Sterilizzare e piastrare 6 piastre con il terreno PCA.
Sterilizzare una beuta contenente 500 ml di acqua
distillata per le diluizioni del campione.
Sotto la cappa sterile preparare le diluizioni del campione di acqua.
3
(2 campioni 1:10) Prelevare 10 ml di campione e metterlo in tre matracci da 100
ml, portare a volume con acqua sterile. Un matraccio servirà per la diluizione
successiva .
(2 campioni 1:100) Prelevare 10 ml di campione dal matraccio 1:10 e metterlo in
due matracci da 100 ml, portare a volume con acqua sterile.
4
5
Montare l’apparato di filtrazione inserendo tra
l’imbuto e il porta filtro l’apposito filtro sterile,
collegarlo ad una pompa da vuoto e filtrare i
campioni di acqua partendo da quelli più diluiti. Dopo
la prima filtrazione si toglie il filtro e lo si depone
sulla superficie della piastra di PCA. Si procede così
per tutti e sei i campioni (campioni 100 –10-1- 10-2).
Mettere le piastre capovolte in termostato per 24h; una
piastra a 22° e l’altra a 37° per ogni diluizione.
43
METODICA
Procedimento B (Individuazione coliformi totali)
Filtrare 100 ml di campione e seminarlo in piastre con Endo broth
agarizzato.
1
Incubare a 36° per 24h.
Procedimento C (Identificazione coliformi fecali)
Filtrare 100 ml di campione e seminarlo in piastre con Faecal
coliform broth agarizzato.
Incubare a 44° per 24h.
1
Procedimento D (Individuazione Streptococchi fecali)
Filtrare 100 ml di campione e seminarlo in piastre con Azide
maltose agar.
Incubare a 36° pper 48h.
1
Valutazione:
a)
Per la conta batterica totale si prendono in considerazione tutte le colonie presenti
sulla membrana dopo incubazione. Riportare il valore alle diluizioni eseguite. (valori
guida: 10 colonie a 36
36°C
C, 100 colonie a 22°C/1
22 C/1 ml)
b)
Per i coliformi totali contare le colonie rosse e tutte le colonie che presentano riflesso
metallico (fucsina); queste ultime possono essere presumibilmente classificate come
colonie di Escherichia coli. Altre colonie eventualmente presenti non vanno
conteggiate. Riportare il valore a 100 ml di campione.
c)
Per i coliformi fecali contare le colonie in grigio, grigio-blu e blu. Altri tipi di colonie
eventualmente
l
presentii non sii contano. Riportare
Ri
il valore
l
a 100 mll di campione.
i
d)
Per gli streptococchi fecali contare solo le colonie rosso, rosso-scuro, puntiformi
(diametro max 1 mm) con contorni netti e cupoliformi. Ogni altro tipo di colonia non
deve essere conteggiato. Riportare il valore a 100 ml di campione.
44
METODICA
22°C
36°C
Carica batterica totale 100
………./ml
………./ml
10-2
………./ml
………./ml
10-1
………./ml
………./ml
Risultati:
44°C
………./100ml
/100ml
C lif
Coliformi
i totali
t t li
………./100ml
Coliformi fecali
………./100ml
Streptococchi fecali
45
U.D. 4.4 ANALISI MICROBIOLOGICA DELL’ACQUA POTABILE
OBIETTIVO:
Valutare se il campione in esame corrisponde ai requisiti di potabilità dal punto di vista
microbiologico.
PRINCIPIO:
Ricerca e quantificazione delle varie specie che rappresentano indicatori batterici di
inquinamento e più precisamente:
• carica microbica totale
• coliformi
lif
i totali
t t li e fecali
f li
• streptococchi fecali
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI CHIMICI
Cartine indicatrici
TERRENI DI COLTURA
PCA, Lactose broth, Brillant green bile broth, Azide dextrose broth, Ethyl violet azide
broth
VETRERIA, ...
Pipette sterili da 10-1-0,1 ml, provette, provettoni, beute, campanelle di Durham, piastre
sterili
STRUMENTI
Centrifuga, bagnomaria, autoclave, contacolonie, bilancia, termostato, bunsen
PRELIEVO DEI CAMPIONI
Il prelievo viene effettuato con bottiglie sterili in vetro o in plastica con tappo a vite,
chiusi da fogli di carta di alluminio.
Il prelievo sarà effettuato dopo aver fatto defluire l’acqua per alcuni minuti.
I campioni vanno sottoposti all’esame quanto prima, in ogni caso l’intervallo di
tempo fra il prelievo e l’analisi non dovrà superare le 24h.
46
ANALISI MICROBIOLOGICA ACQUA POTABILE
CARICA MICROBICA TOTALE
Semina in PCA per inclusione con
eventuali diluizioni scalari
Test
negativo
Incubare a 36°C per 48h
Incubare a 22°C per 72h
Osservare e contare
le colonie, ricavare
il valore medio
delle piastre alla
stessa diluizione
Osservare e contare
le colonie, ricavare
il valore medio
delle piastre alla
stessa diluizione
COLIFORMI TOTALI E FECALI
STREPTOCOCCHI
Test presuntivo in Lactose broth
Test presuntivo in Azide dextrose broth
Incubare a 36°C per 24/48h
Incubare a 37°C per 48h
SCHEMA DI
LAVORO
no
Intorbidamento
del brodo?
Produzione di gas?
si
no
Test
negativo
Test
positivo
Inoculo in Brillant green
Bile broth
Inoculo in EVA broth
Produzione di gas?
si
Test
negativo
no
Test
negativo
si
Test
positivo
Incubare a 36°C per 24/48h
no
Incubare a 44°C per 24h
Produzione di gas?
Incubare a 37°C per 48h
no
si
Test
negativo
Intorbidamento
e precipitato
color porpora?
si
Test
positivo
Test
positivo
Test
positivo
Conta con metodo MPN
dei coliformi totali
Conta con metodo MPN
dei coliformi fecali
Conta con metodo MPN
degli streptococchi
47
METODICA
(1a FASE)
a)
1
CARICA MICROBICA TOTALE a 36°
36 e 22
22°
Trasferire con pipette sterili, 1 ml del campione di acqua
in 4 piastre, se il campione è molto contaminato
procedere a diluizioni (1:10, 1:100, 1:1000) con acqua
dist. sterile (vedi modulo 4.1/4.2).
2
Piastrare con PCA mantenuto fuso in b.m.
ruotare
delicatamente
le
piastre
per
omogenizzare il campione nel terreno.
3
Incubare 2 piastre a 36° per 48h e le altre 2 a 22° per 72h.
Osservare le colonie cresciute con il contacolonie, ricavare il valore medio su ogni
coppia di piastre, esprimere il risultato come colonie su agar/ml a 36° e 22°C.
48
METODICA
b) COLIFORMI TOTALI E FECALI (test presuntivo)
c) STREPTOCOCCHI FECALI (test presuntivo)
1
Preparare e sterilizzare (per i coliformi):
3 provettoni con campanella di durham contenenti
ognuno 10 ml di Brodo lattosato a concentrazione
doppia.
6 provettoni con campanella di durham contenenti
ognuno 10 ml di Brodo lattosato a concentrazione
normale.
normale
Preparare e sterilizzare (per gli streptococchi):
2
3 provettoni con campanella di durham contenenti
ognuno
g
10 ml di Azide dextrose broth a concentrazione
doppia.
6 provettoni con campanella di durham contenenti
ognuno 10 ml di Azide dextrose broth a concentrazione
normale.
3
Seminare 10 ml di campione nei 3 provettoni contenenti
il Brodo lattosato e 3 con l’Azide dextrose broth a
concentrazione doppia.
Seminare 1 ml di campione nei 3 provettoni contenenti
il Brodo lattosato e 3 con l’Azide dextrose broth a
concentrazione normale.
Seminare 0,1 ml di campione nei 3 provettoni
contenenti il Brodo lattosato e 3 con l’Azide dextrose
broth a concentrazione normale.
4
Incubare a 36° per 24-48 h tutti i test, leggere dopo 24
h considerando positive solo le colture che hanno
crescita con sviluppo di gas e intorbidamento del
terreno. Incubare
I b di nuovo solo
l i tubi
bi negativi
i i per altre
l
24 h.
49
METODICA
b) COLIFORMI TOTALI E FECALI (test di conferma)
c) STREPTOCOCCHI FECALI (test di conferma)
Preparare e sterilizzare:
1
2
3
tanti provettoni con campanella di durham quante
sono le prove positive con 4 ml di Brillant green bile
broth (per i coliformi) e altrettante con 5 ml di EVA
broth (per gli streptococchi).
Seminare 1 ansata di ogni brodocoltura positiva
delle prove presuntive nei tubi contenenti il Brillant
green e 3 ansate in quelli contenenti EVA broth.
Incubare a 36° per 24h i coliformi totali,
a 44° per 24h i coliformi fecali,
a 36° per 48h gli streptococchi.
Osservare i risultati, la determinazione numerica dei batteri ricercati viene espressa rispetto al numero
di tubi positivi (intorbidamento e produzione di gas per i coliformi, sedimento color porpora per gli
streptococchi)
hi) e esprimere
i
l concentrazione
la
i
d i batteri
dei
b
i come MPN/ml
MPN/ l di campione,
i
cioè
i è di numero
più probabile.
50
Tabella MPN
Numero tubi positivi su
3 da 10 ml
3 da 1 ml
3 da 0,1 ml
0
0
1
0
1
1
MPN
per 100 ml
Limiti fiduciari
inferiori
superiori
3
<0,5
9
0
3
<0,5
13
0
0
4
<0,5
20
1
0
1
7
1
21
1
1
0
7
1
23
1
1
1
11
3
36
1
2
0
11
3
36
2
0
0
9
1
36
2
0
1
14
3
37
2
1
0
15
3
44
2
1
1
20
7
89
2
2
0
21
4
47
2
2
1
28
10
150
3
0
0
23
4
120
3
0
1
39
7
130
3
0
2
64
15
380
3
1
0
43
7
210
3
1
1
75
14
230
3
1
2
120
30
380
3
2
0
93
15
380
3
2
1
150
30
440
3
2
2
210
35
470
3
3
0
240
38
1300
3
3
1
460
71
2400
3
3
2
1100
150
4800
Parametri microbiologici
dalla Gazzetta Ufficiale – maggio 1985
Caratteristiche di qualità delle acque destinate al consumo umano
Parametro ed unità di misura
Valore guida
Valore limite
osservazioni
Coliformi fecali/100 ml
-
0
Coliformi totali/100 ml
-
0
Non più del 5% dei campioni
esaminati nell’arco dell’anno e non più
di 2 campioni prelevati nello stesso
punto possono eccedere tale limite.
Comunque mai superiore a 5/100 ml.
10
100
-
Alte cariche
Alt
i h bbatteriche
tt i h richiedono
i hi d
indagini e accertamenti appropriati.
-
0
C t i colonie
Conteggio
l i su agar/1
/1 mll a 36°C
a 22°C
Streptococchi fecali/100 ml
51
U.D. 4.5 VALUTAZIONE DELL’AZIONE INIBENTE DI ALCUNI
DISINFETTANTI DI USO COMUNE
OBIETTIVO:
Confrontare l’attività inibente di alcuni disinfettanti utilizzati comunemente per usi sanitari e
domestici.
PRINCIPIO:
Il potere antibiotico di alcuni composti chimici può essere valutato indagando la loro capacità
di inibire la crescita di microrganismi. Il metodo utilizzato è quello della diffusione in agar
basato sull’uso di dischetti di carta da filtro sterili imbevuti del composto da saggiare. I
dischetti, disposti sulla superficie del terreno agarizzato, seminato con un ceppo microbico
standardizzato, permettono la diffusione del disinfettante nel terreno. Dopo incubazione si
osserveràà intorno
i t
all dischetto
di h tt un alone
l
di inibizione
i ibi i
d ll crescita
della
it che
h avràà un diametro
di
t tanto
t t
più grande quanto più efficace sarà il disinfettante.
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Ceppi di Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Bacillus subtilis
MATERIALI CHIMICI
Alcool denaturato, tintura di iodio, acqua ossigenata 10 volumi, amuchina, ammoniaca
e candeggina di uso commerciale.
TERRENI DI COLTURA
TSB, TSA
VETRERIA ...
VETRERIA,
Beute, cilindri, bacchette, provette 16x100, piastre sterili, beker, dischi di carta da filtro
sterili con diametro di 6 mm, tamponi sterili, pinze, ansa
STRUMENTI
Bilancia, autoclave, termostato, contacolonie, bunsen
52
METODICA
(1a FASE 1° parte)
1
2
Preparare delle provette contenenti 5 ml di TSB,
sterilizzarlo per gli inoculi dei ceppi batterici.
preparare, sterilizzare e piastrare il TSA
doppio volume (40 ml a piastra).
(1a FASE 2° parte)
1
Seminare i brodi prelevando circa 4-5 ansate
di ogni ceppo batterico.
2
Incubare per 18 h a 37° C.
53
METODICA
(2a FASE 1° parte)
Standardizzare l’inoculo confrontando la torbidità
della brodocoltura con quella dello standard
MacFarland, (tale standard corrisponde circa a 108
batteri/ml) usare brodo sterile per eventuali
diluizioni della brodocoltura.
1
(2a FASE 2° parte)
Seminare, con un tampone sterile in maniera
uniforme, ripetendo l’operazione più volte
ruotando la piastra di 60°, i ceppi batterici.
1
3
2
2
4
1
3
Segnare sul fondo delle piastre la posizione in cui
deporre i dischi imbevuti indicando con un numero il
composto da saggiare. Testare, per ogni ceppo batterico,
i disinfettanti più un dischetto imbevuto con acqua
p
i
sterile come controllo. Con le ppinze sterili deporre
dischi sulla superficie dell’agar dopo averli imbevuti dei
campioni di disinfettante.
Incubare le piastre a 37° per 24 h.
54
METODICA
(3a FASE)
La misura degli aloni di inibizione viene fatta su un contacolonie o su fondo scuro, con
un millimetro, compilare poi una tabella con i risultati segnando con + o con – la
presenza o l’assenza di alone.
C
Ceppo
1
1 alcool denaturato
2 tintura di iodio
3 acqua ossigenata 10 volumi
4 amuchina
5 ammoniaca
6 candeggina
55
C
Ceppo
2
U.D. 4.6 ANTIBIOGRAMMA
OBIETTIVO:
Stabilire lo spettro di sensibilità di un determinato ceppo microbico a diversi antibiotici.
PRINCIPIO:
Come nella precedente esperienza (U.D. 4.5), la valutazione della sensibilità del ceppo
microbico in esame a diversi antibiotici, si effettua misurando il diametro dell’alone di
inibizione che si è formato intorno a dischetti contenenti quantità prestabilite e controllate di
antibiotico (tecnica di Kirby-Bauer). L’interpretazione dei risultati la si ottiene consultando
apposite tabelle che permettono di stabilire se il ceppo microbico è resistente, intermedio o
sensibile ad un determinato antibiotico.
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Escherichia Coli, Enterobacter aerogenes
MATERIALI CHIMICI
Standard MacFarland, dischi di antibiotici
TERRENI DI COLTURA
Trypticase Soy broth, Mueller Hinton agar
VETRERIA, ...
Piastre sterili, ansa, provette 16x100, tamponi sterili, pinze mettalliche, beker 100 ml,
righello
STRUMENTI
Bilancia autoclave,
Bilancia,
autoclave termostato,
termostato bunsen
Standard MacFarland:
0,5 ml di Bario cloruro 0,048M + 99,5 ml di Acido Solforico 0,35 N (0,99 ml/100ml
di acido solforico, 0,117 g/10 ml di Bario Cloruro).
Tale standard corrisponde circa a 108 batteri/ml). La soluzione è stabile per circa 6
mesi. Agitare prima dell’uso.
56
METODICA
(1a FASE)
1
Preparare il brodo.
2
Distribuire 4-5 ml di brodo in ogni provetta.
3
Preparare il terreno Mueller Hinton agar
a doppio volume.
4
Distribuire in provettoni con tappo metallico
(40 ml per provettone).
5
Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15’.
57
METODICA
(2a FASE 1°
1 parte)
1
Piastrare il terreno Mueller Hinton agar in ambiente
sterile.
(2a FASE 2° parte)
1
2
Con l’ansa, inoculare un ceppo microbico in ogni
provetta contenente il brodo TSB.
Incubare le provette a 37° per 18h.
58
METODICA
(3a FASE 1°
1 parte)
1
Standardizzare l’inoculo confrontando la torbidità della
brodocoltura con quella dello standard MacFarland, (tale
standard corrisponde circa a 108 batteri/ml) usare brodo
sterile per eventuali diluizioni della brodocoltura.
(3a FASE 2° parte)
1
Immergere un tampone sterile nella brodocoltura
e seminare sulla superficie del terreno in
maniera uniforme, ripetendo l’operazione più
volte ruotando la piastra di 60°.
2
Entro 15’ applicare sulla piastra seminata i dischi
di antibiotici mediante pinze sterili (selezionare
gli antibiotici in relazione al tipo di batteri).
Disporre i dischi ad una analoga distanza tra
loro.
3
Incubare le piastre a 37° per 16-18 h.
59
METODICA
(4a FASE)
Misurare con un centimetro il diametro degli
aloni di inibizione sul fondo della piastra posta
sopra una superficie luminosa. Interpretare i
risultati in base allo schema di lettura.
1
2
Diametro alone di inibizione
Antibiotico
Resistente
Moderat. sensibile
Sensibile
Ampicillina (AM) (enterococchi,
enterobatteri)
t b tt i)
<11
12-13
>14
Ampicillina (AM) (stafilicocchi)
<20
21-28
>29
Amikacina
<14
15-16
>14
Amoxicillina (Gram-)
<11
12-13
>14
Amixicillina (Gram+)
<20
21-28
>29
Acido nalidixico (NA)
<13
14 18
14-18
>19
Eritromicina (E)
<13
14-17
>18
Fosfomicina (FFL)
<10
11-14
>15
Gentamicina (GM)
<12
-------
>13
Neomicina
<12
13-16
>17
Rifampicina
<11
12-18
>19
Penicillina G (P) (Stafilococchi)
<20
21-28
>29
Penicillina G (P)
(Altri microrganismi)
<11
12-21
>22
60
5. CARATTERISTICHE METABOLICHE DEI MICRORGANISMI
U.D. 5.1 UTILIZZAZIONE DELL’AMIDO
OBIETTIVO:
Verificare la capacità dei microrganismi di utilizzare l’amido quale fonte di glucosio per il
proprio metabolismo
PRINCIPIO:
La capacità dei batteri di idrolizzare l’amido, trasformandolo in destrine, maltosio e glucosio,
dipende da una proprietà genetica dei batteri stessi: quella di produrre l’enzima amilasi
Utilizzando un terreno di coltura in cui è presente amido, è possibile rilevarne la presenza, dopo
semina e incubazione, con il reattivo di Lugol, che si colora in blu. Non danno invece
colorazione blu i prodotti di idrolisi dell’amido.
L’aggiunta del Lugol sulla coltura determinerà una colorazione blu se il batterio in esame non
possiede l’amilasi, giallo-bruna o rossa se il batterio è amilasi +
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Escherichia coli e Bacillus subtilis
MATERIALI CHIMICI
Liquido di Lugol
TERRENI DI COLTURA
Starch agar (Nutrient agar, Amido solubile)
VETRERIA, ...
VETRERIA
Beuta, treppiede, piastre sterili monouso, ansa, provette, portaprovette
STRUMENTI
Bilancia tecnica, autoclave, termostato, bunsen
Liquido di Lugol:
((soluzione iodo-iodurata)) composto
p
da 1 g di Iodio,, 2 g di ioduro di ppotassio e 200 ml
di acqua. La soluzione deve essere fresca perché con il tempo si decolora e acidifica
per alterazione dello iodio.
61
METODICA
(1a FASE)
1
Preparare il terreno: soluzione al 10% di amido solubile in
Nutrient agar fuso in ragione di 20ml di soluzione per 100ml
di Nutrient agar.
2
Distribuire in 2 provettoni con tappo metallico
(18-20 ml per provettone).
3
Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15’.
(2a FASE)
1
Piastrare in ambiente sterile.
2
Seminare solo metà di 2 piastre, una piastra con
Escherichia coli e l’altra piastra con Bacillus
subtilis.
3
Incubare a 37° per 48 h.
62
METODICA
(3a FASE)
1
Aggiungere una goccia di Lugol sulla metà piastra
seminata e una goccia sulla metà non seminata.
2
Una colorazione chiara denota che l’amido è stato
idrolizzato, mentre la colorazione blu-azzurro rivela
ancora presenza di amido.
id
63
U.D. 5.2 UTILIZZAZIONE DI CARBOIDRATI DIVERSI
OBIETTIVO:
Saggiare la capacità dei microrganismi di utilizzare carboidrati diversi (Glucosio, Lattosio,
Saccarosio) a scopi fermentativi.
PRINCIPIO:
I microrganismi metabolizzano diversi carboidrati attraverso processi fermentativi che portano
alla produzione di acidi e/o gas.
La produzione di acidi si può rilevare utilizzando un terreno come il Phenol red broth base che
contiene un indicatore di pH, il rosso fenolo, che è rosso in ambiente alcalino, arancio in
ambiente
bi
neutro e giallo
i ll in
i ambiente
bi
acido.
id
La produzione di gas può essere rilevata con le campanelle di Durhan.
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Escherichia coli e Alcaligenes faecalis
MATERIALI CHIMICI
Soluzioni al 10% di glucosio, lattosio, saccarosio
TERRENI DI COLTURA
Phenol red broth base
VETRERIA, ...
Bunsen, beuta, treppiede, ansa, provettoni, portaprovettoni, palloncini tarati, siringhe e
filtri sterili,
sterili campanelle di Durham
STRUMENTI
Bilancia tecnica, autoclave, termostato, bunsen
64
METODICA
(1a FASE)
1
Preparare il terreno.
2
Distribuire in pprovette con tappo
pp a vite ((10 ml pper pprovetta;;
3 provette per ogni microrganismo in esame più una provetta
di controllo che non verrà inoculata).
3
Mettere in ogni provetta una campanella di Durhan.
4
Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15’.
(2a FASE)
1
Aggiungere
i
add ognii provetta 1mll di soluzione
l i
di carboidrato,
b id
utilizzando una siringa munita di filtro sterile (3 provette
per i 3 carboidrati diversi per ogni microrganismo in esame).
2
Con ll’ansa
ansa, inoculare con lo stesso ceppo microbico le 3 provette
con i 3 carboidrati diversi. Ripetere per ogni batterio in esame.
3
Incubare a 37°. Dopo 4h fare la prima lettura;
la seconda dopo 24h.
65
(3a FASE)
1
Osservare il colore del terreno e la presenza di gas all’interno delle campanelle
(dopo 4 e 24 ore) e riportare i risultati nella seguente tabella:
glucosio
microrganismo
i
i
gas
saccarosio
pH
gas
lattosio
pH
gas
pH
E. coli
A. faecalis
2
Caratteristiche colturali dei due batteri
glucosio
microrganismo
E. coli
A. faecalis
saccarosio
l tt i
lattosio
gas
pH
gas
pH
gas
pH
+
+
-
-
+
+
-
-
-
-
-
-
66
U.D. 5.3 OSSIDAZIONE E FERMENTAZIONE
OBIETTIVO:
Saggiare la capacità dei microrganismi di metabolizzare i diversi carboidrati (Glucosio,
Lattosio, Saccarosio) mediante due processi: la fermentazione e l’ossidazione aerobia.
PRINCIPIO:
I processi per metabolizzare i carboidrati sono due: la fermentazione, che avviene in condizioni
di anaerobiosi, e l’ossidazione aerobia.
I microrganismi che fermentano, producono una reazione acida (colorazione gialla) in entrambe
le condizioni, quelli che ossidano producono una reazione acida solo in condizione di aerobiosi.
I microrganismi non fermentanti e non ossidanti danno reazione alcalina (colorazione blu) in
aerobiosi e nessuna modificazione di pH in anaerobiosi.
anaerobiosi
Il terreno contiene blu di bromotimolo come indicatore di pH; con la degradazione del
carboidrato si ha una variazione del pH verso l’acidità e il conseguente viraggio del terreno da
verde a giallo.
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Escherichia coli e Alcaligenes faecalis
MATERIALI CHIMICI
Soluzioni al 10% di glucosio, lattosio, saccarosio
olio di vasellina o paraffina
TERRENI DI COLTURA
O/F agar
VETRERIA, ...
Bunsen, beuta, treppiede, ago per infissione, provette, portaprovette, palloncini tarati,
siringhe e filtri sterili
STRUMENTI
Bilancia tecnica, autoclave, termostato, bunsen
67
METODICA
(1a FASE)
1
Preparare il terreno.
2
Distribuire in provette con tappo a vite (5 ml per provetta;
6 provette per ogni microrganismo in esame:2 per il glucosio,
2 per il saccarosio
i e 2 per il lattosio).
l
i )
3
Preparare una beuta con della paraffina o dell’olio di vasellina.
4
Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15’ sia il terreno che la
paraffina.
(2a FASE)
1
Aggiungere ad ogni provetta 0,5ml di soluzione di carboidrato,
utilizzando una siringa munita di filtro sterile (2 provette per i 3
carboidrati diversi per ogni microrganismo in esame).
2
Seminare per infissione con lo stesso ceppo microbico le 2
provette con i 3 carboidrati diversi. Ripetere per ogni batterio in
esame.
3
Coprire il terreno (una sola provetta per ogni zucchero)
con 2 ml di paraffina liquida, infine tappare.
4
Incubare a 32°-35° per 48h esaminando le provette ogni giorno.
68
(3a FASE)
1
O
Osservare
lla colorazione
l
i
in
i ciascuna
i
coppia
i di provette e riportare
i
i dati
d i in
i tabella.
b ll
glucosio
microrganismo
aperta
lattosio
saccarosio
chiusa
aperta
chiusa
aperta
chiusa
E coli
E.
A. faecalis
2
Caratteristiche
Ca
atte st c e colturali
co tu a dei
de due batteri
batte
glucosio
microrganismo
lattosio
saccarosio
aperta
chiusa
aperta
chiusa
aperta
chiusa
E. coli
AG
AG
-
-
AG
AG
A. faecalis
-
-
-
-
-
-
A = reazione acida
AG = reazione acida e produzione di gas
- = nessuna reazione o reazione alcalina
La produzione di gas si evidenzia con il distacco dal
terreno e lo spostamento verso l’alto della paraffina.
69
U.D. 5.4 UTILIZZAZIONE DI AMINOACIDI
OBIETTIVO:
Saggiare la capacità dei microrganismi di degradare un amminoacido il triptofano, dalla cui
demolizione si ottiene indolo e altri composti.
PRINCIPIO:
Il test dell’indolo serve a caratterizzare alcuni microrganismi appartenenti agli Enterobatteri, la
cui presenza in un campione può o meno indicare contaminazione fecale.
L’indolo è un composto contenente azoto che si forma dalla degradazione del triptofano da parte
di certi batteri.
L degradazione
La
d
d i
add indolo
i d l è svelabile
l bil con il reattivo
i di Kovacs
K
cha
h dà luogo
l
add un composto
colorato di rosso.
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Escherichia coli e Enterobacter aerogenes
MATERIALI CHIMICI
Reattivo di Kovacs
TERRENI DI COLTURA
Acqua triptonata o peptonata
VETRERIA, ...
Bunsen, beuta, treppiede, ansa, provette, portaprovette
STRUMENTI
Bilancia tecnica, autoclave, termostato, bunsen
70
METODICA
(1a FASE)
1
Preparare l’acqua triptonata.
2
Distribuire in 2 provette con tappo a vite (5 ml per
provetta).
3
Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15’.
(2a FASE)
1
Con l’ansa, inoculare un ceppo microbico per ogni provetta.
2
Incubare a 32°-35° per 24-48h.
71
(3a FASE)
1
2
Aggiungere a ciascuna provetta alcune gocce del reattivo di Kovacs
e agitare delicatamente. Dopo alcuni minuti la formazione di una
colorazione rossa sulla superficie del terreno costituisce una prova positiva.
Riportare i dati ottenuti nella tabella.
Indolo
microrganismo
E. coli
l
E. aerogenes
Caratteristiche culturali dei due batteri.
microrganismo
Indolo
E. coli
+
E. aerogenes
-
+ = reazione positiva
- = nessuna reazione
72
U.D. 5.5 ENTEROTUBE
OBIETTIVO:
L’enterotube è un sistema pronto all’impiego per l’identificazione rapida delle
Enterobacteriacae che consente l’esame simultaneo di 15 differenti caratteristiche biochimiche
dei batteri.
PRINCIPIO:
Gli enterobatteri vengono identificati in base alla valutazione dei risultati
di diverse prove biochimiche:
fermentazione del destrosio e produzione di gas
in
decarbossilazione della lisina
anaerobiosi
decarbossilazione dell’ornitina
fermentazione del triptofano e produzione di H2S
fermentazione dell’adonitolo
fermentazione del lattosio
fermentazione dell
dell’arabinosio
arabinosio
in
fermentazione del sorbitolo
aerobiosi
fermentazione del glucosio (Voges-Proskauer)
fermentazione del dulcitolo e della fenilalanina
idrolisi dell’urea
utilizzazione del citrato
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Escherichia coli, Proteus, Enterobacter aerogenes, ...
MATERIALI CHIMICI
Rreattivo di Kovacs, α-naftolo (6% in alcool etilico), idrato di potassio (40g in 60ml di
acqua)
TERRENI DI COLTURA
Kit enterotube
VETRERIA, ...
Portaprovette, siringhe sterili
STRUMENTI
Termostato, bunsen
73
METODICA
(1a FASE)
1
Accanto alla fiamma del bunsen svitare i cappucci
dell’enterotube e con la punta dell’ago prelevare
una colonia isolata.
2
Inoculare l’enterotube ruotando ed estraendo l’ago
attraverso tutti gli scomparti del tubo.
tubo
3
4
5
Reinserire l’ago fino alla tacca e poi spezzarlo
piegandolo. La parte di ago che rimane all’interno
assicura ll’anaerobiosi
anaerobiosi.
Con lo spezzone dell’ago perforare la pellicola di
plastica in corrispondenza dei fori degli ultimi 8
scomparti al fine di creare un ambiente aerobio.
Riavvitare i tappi.
Incubare a 35-37°C per 20-24 h possibilmente in
posizione verticale su un portaprovette con lo
scomparto del destrosio rivolto verso l’alto.
74
(2a FASE)
1
Registrare le reazioni (+ o -)
citratto
ureaa
fenilalaanina
dulcitoolo
Vogess-P
sorbitoolo
arabinoosio
lattossio
adonittolo
H2S
indollo
ornitiina
lisinna
gas
destroosio
e riportarle nella tabella:
reazione
2
Eseguire il test dell’indolo iniettando con una siringa 4
gocce di reattivo di Kovacs direttamente sotto la
pellicola di plastica dello scomparto H2S/indolo (il
reattivo vira al rosso se la prova è positiva).
3
Eseguire il test di Voges-Proskauer iniettando con una
siringa 3 gocce di soluzione di α-naftolo e 2 di KOH
direttamente sotto la pellicola di plastica dello
scomparto VP (il reattivo vira al rosso entro 10 minuti se
la prova è positiva).
4
Registrare gli ultimi due dati.
75
(3a FASE)
1
Per identificare il batterio in esame confrontare i dati ottenuti con la tabella
per l’dentificazione biochimica degli enterobatteri.
2
In alternativa, utilizzare i foglietti di identificazione allegati alla
confezione di Enterotube, contrassegnando per ogni reazione positiva i
numeri corrispondenti.
Per esempio:
Sommare i numeri contrassegnati, come indicato sopra. Il numero a 5 cifre ottenuto
(ID value), consente la rapida identificazione del batterio in esame utilizzando il
sistema di identificazione con codifica computerizzata.
76
6. INTERAZIONE MICRORGANISMI/UOMO
U.D. 6.1 PROTEINA C REATTIVA (Test di agglutinazione indiretta)
OBIETTIVO:
Verificare la presenza di infezioni in atto sul soggetto in esame.
PRINCIPIO:
La proteina C reattiva compare nel siero umano in risposta ad una grande varietà di processi
infiammatori determinati da infezioni batteriche, nel reumatismo acuto, nell’infarto miocardico,
nelle neoplasie maligne. La proteina C ha un forte potere antigene e produce negli animali da
laboratorio un anticorpo specifico chiamato “reactive protein antiserum” CRPA. La ricerca della
PCR si esegue utilizzando l’antisiero CRPA.
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Siero, sieri positivo e negativo per PCR
MATERIALI CHIMICI
Kit PCR
VETRERIA, ...
Vetrini per agglutinazione a fondo nero
77
METODICA
Il siero in esame deve essere limpido intero e
diluito 1/20 (1 parte di siero e 19 parti di
soluzione tampone pH 8,2).
1
2
I sieri di controllo positivo e negativo sono
prediluiti 1:20 e quindi pronti all’uso. Agitare
prima dell’uso.
Agitare delicatamente prima dell’uso il reattivo al Latex con la proteina C reattiva.
S un apposito
Su
i vetrino
i a fondo
f d nero, diviso
di i in
i tre settori,
i sii procede
d come segue:
I settore
II settore
III settore
1 goccia di siero in esame
+
1 goccia di siero positivo
+
1 goccia di siero negativo
+
1 goccia di Latex test PCR
1 goccia di Latex test PCR
1 goccia di Latex test PCR
3
4
Miscelare con l’apposita bacchetta e
quindi roteare delicatamente il vetrino
per 1’ circa.
Il test è positivo con la comparsa di agglutinazione visibile ad occhio nudo
trascorsi da 1 a 3 minuti. Agglutinazioni posteriori non sono da considerare.
78
U.D. 6.2 TITOLO ANTI-O-STREPTOLISINICO (Test di neutralizzazione)
OBIETTIVO:
Determinare la presenza o meno nel siero in esame di anticorpi anti O-streptolisinici e valutarne
il titolo.
PRINCIPIO:
La O-streptolisina è una emolisina prodotta da Streptococcus pyogenes beta emolitico. La Ostreptolisina provoca sulla membrana delle emazie dei fori dai quali fuoriesce l’emoglobina. Gli
anticorpi che si fissano alla tossina, (reazione di neutralizzazione) impediscono l’evento. Come
sistema rivelatore della presenza o meno di anticorpi nel siero si usano le emazie. Se i globuli
rossi più il siero in esame,
esame vengono lisati dall’aggiunta di O-streptolisina
O streptolisina non si è verificata una
reazione di neutralizzazione, dunque nel siero non sono presenti anticorpi anti O-streptolisinici.
Viceversa l’assenza di lisi segnala la presenza di anticorpi capaci di legare e neutralizzare la
tossina.
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
O-streptolisina titolata, globuli rossi di coniglio al 5%
MATERIALI CHIMICI
Soluzione tampone a pH 6,5
VETRERIA,, ...
Pipette in vetro o pipette automatiche, puntali, provette da sierologia, portaprovette
STRUMENTI
Centrifuga, bagnomaria
79
METODICA
(1a FASE)
Diluire il siero
1/10 = 0,2 ml di siero + 1,8 ml di soluzione tampone
1/100 = 0,5 ml siero 1/10 + 4,5 ml
“
“
1/500 = 1 ml siero 1/100 + 4 ml
“
“
1
Lavare la sospensione di globuli rossi almeno 3
volte con il tampone, centrifugando ogni volta a
1500-2000 rpm per 5’. Dopo il lavaggio finale
preparare la sospensione al 5% in tampone.
2
3
Disporre 14 provette come da schema:
1:10
1:100
1:500
Controlli
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
siero diluito
0,8
0,2
1
0,8
0,6
0,4
0,3
1
0,8
0,6
0,4
0,2
-
-
tampone
0,2
0,8
-
0,2
0,4
0,6
0,7
-
0,2
0,4
0,6
0,8
1,5
1
reagente
o-streptolisina
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
-
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
provetta
Agitare ed incubare a 37° per 15’
emazie al 5%
0,5
0,5
0,5
0,5
Agitare e incubare a 37° per 45’, ripetere l’agitazione dopo 15’. Centrifugare le provette per
1-2’ a 1000-1500rpm
Il titolo del siero in esame è espresso dalla più alta diluizione che è capace di inibire
l’emolisi. L’emolisi nelle provette è caratterizzata dal colore rosso della soluzione in
esame. Le unità anti-o-streptolisiniche sono espresse come il reciproco del titolo di
anticorpi come nello schema:
provetta
diluizione
provetta
diluizione
1
1/12
8
1/500
2
1/50
9
1/625
3
1/100
10
1/833
4
1/125
11
1/1250
5
1/166
12
1/2500
6
1/250
13
non vi deve essere emolisi
7
1/333
14
vi deve essere emolisi completa
80
APPENDICE
TERRENI DI COLTURA
AGAR BIOS SPECIAL LL
Preparazione
Agar Bios Special LL è l'agente solidificante d'elezione per i
terreni dl coltura per microbiologia.
Sciogliere 71.4 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata
fredda, portare all'ebollizione sotto agitazione bollire per
cinque minuti, raffreddare in bagnomaria a 50°C ed
aggiungere, con le cautele dell'asepsi, 10 ml di una
soluzione acquosa di 2,3,5 trifeniltetrazolio cloruro (TTC)
all'1% sterilizzata per filtrazione; il terreno così preparato
può essere conservato a 50°C per circa tre ore prima di
essere versato nelle piastre. Le piastre preparate possono
essere conservate per circa
i 155 giorni
i i in
i frigorifero
f i if
all buio.
b i
Grazie al suo elevato grado di purezza fornisce soluzioni
acquose limpide alle concentrazioni d'uso nei terreni di
coltura (1.5%).
AZIDE DEXTROSE BROTH
F
Formula
l (grammi
(
i per litro)
lit )
Peptocomplex
15.0
Beef Extract
4.5
Glucose
7.5
Il terreno non aggiunto di TTC può essere sterilizzato in
autoclave a 121°C per 10 minuti e quindi conservato in
frigorifero: una volta scelto un modo di preparazione
attenervisi sempre.
Sodium Chloride
7.5
pH finale 7.2±0.2.
Sodium Azide
0.2
Impiego
Preparazione
Sciogliere 34.7 g di polvere in 100 ml di acqua distillata
fredda. Scaldare fino a completa solubilizzazione, distribuire
in tubi da 10 ml ed autoclavare a 121°C per 15 minuti.
Per inoculi superiori a 1 ml per 10 ml di terreno, preparare il
terreno a concentrazione doppia o multipla. pH finale
7.2±0.2.
Impiego
Azide
A
id Dextrose
D t
B th è un terreno
Broth
t
selettivo
l tti
per la
l
determinazione presuntiva degli streptococchi fecali nelle
acque e negli alimenti: la composizione è conforme a quanto
stabilito da OMS e APHA.
Eseguire il conteggio in tubi, secondo il metodo del numero
più probabile; variare l'entità dell'inoculum (multipli o
frazioni di 1 ml) in funzione del tipo di campione, allestendo
almeno cinque tubi per ogni diluizione.
Usare come liquido per diluizione tampone di fosfati oppure
una soluzione
l i
acquosa di peptone allo
ll 0.5%
0 5% (p/v).
( / ) Incubare
I b
a
35°C per 24 ore, osservare se vi è sviluppo; in caso negativo
protrarre l'incubazione per altre 24 ore.
Calcolare il risultato servendosi delle apposite tabelle ed
esprimerlo come numero più probabile presuntivo.
Confermare il risultato presuntivo trapiantando in Ethyl
Violet Azide Broth
AZIDE MALTOSE AGAR (KF)
Formula (grammi per litro)
Peptocomplex
10
Yeast Extract
10
Sodium Chloride
5
Sodium Glycerophosphate
10
Maltose
20
Lactose
1
Agar Bios LL
15
Sodium Azide
400 mg
Brom Cresol Purple
15
81
Azide Maltose Agar, preparato secondo la formula di
Kenner, Clark e Kabler, è un terreno selettivo utilizzato per
l'isolamento ed il conteggio degli streptococchi fecali.
APHA e FDA raccomandano il terreno nell'isolamento
primario degli enterococchi (nel senso lato del termine)
nelle acque e negli alimenti con la tecnica della membrana
filtrante o con il conteggio in piastra (agar-germi).
Su Azide Maltose Agar coltivano con colonie da rosse a
rosa per la riduzione del TTC tutti gli streptococchi fecali
considerati tali da Hartman: enterocchi di gruppo D (S.
f
faecalis,
li S.
S faecalis
f
li subsp.
b
li f i
liquefaciens,
S faecalis
S.
f
li subsp.
b
zymogenes, S. faecium), i non enterococchi di gruppo D (S.
bovis, S. equinus) ed inoltre S. mitis e S. salivarius. Dopo
48 ore a 35°C si registra sul terreno una crescita scarsa con
colonie incolori, di Lactobacillus plantarum e di
Pediococcus cerevisiae; completamente inibiti sono gli
streptococchi non di gruppo D (S. cremoris, S. lactis, S.
pyogenes, S. termophilus) altri batteri acido lattici
(Leuconostoc mesenteroides, L. lactis, L. acidophilus) ed i
coliformi.
APHA nell'esame degli alimenti suggerisce di inoculare 1
ml delle diluizioni decimali del campione con la tecnica
dell'agar germi e di incubare le piastre a 35°C per 48 ore.
Per il test di conferma trapiantare 5-10 colonie tipiche in
Brain Heart Infusion Broth e incubare a 35°C per 18-24
ore; usare queste brodocolture per una colorazione Gram,
un test della catalasi, un trapianto in Aesculin Bile Broth,
una semina in Brain Heart Infusion Broth normale
(incubazione a 45°C) e addizionato di NaCI 6.5%. La
g
ppresuntiva di streptococco
p
fecale è data da:
diagnosi
catalasi negativa, sviluppo in brodo bile dopo 72 ore a
35°C, crescita a 45°C e in presenza a di NaCI. Tra gli
streptococchi fecali considerati da APHA solo S. equinus,
S. bovis non coltivano in presenza di NaCI 6.5%.
BRILLIANT GREEN BILE BROTH 2%
ENDO BROTH MEMBRAN FILTER
Formula (grammi per litro)
Formula (grammi per litro)
Ox Bile Bios
20.0000
Peptone Bios D
5.000
Lactose
10.0000
Peptomeat
5.000
Peptomeat
10.0000
Biotone
10.000
Brilliant Green
0.013
Yeast Extract
1.500
Lactose
12.500
Preparazione
Sodium Chloride
5.000
Sciogliere 40 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata
fredda, riscaldare fino a soluzione, distribuire e autoclavare a
121°C per 15 minuti. Si raccomanda di non eccedere nel
tempo e nella temperatura di sterilizzazione.
sterilizzazione Per un terreno
2X sciogliere 80 g di terreno in 1000 ml di acqua.
Dipotassium Phosphate
4.375
Monopotassium Phosphate
1.375
Sodium
di Sulphite
l hi
2.100
pH finale 7.2±0.2.
Impiego
Brilliant Green Bile Broth 2% è un terreno selettivo
raccomandato per la determinazione e la conferma dei
q
nei liquami,
q
nei pprodotti lattierocoliformi nelle acque,
caseari, negli alimenti. La presenza del verde brillante
sopprime la crescita dei batteri anaerobi lattosio-fermentanti
(C/ostridium perfringens) non ottenendosi falsi positivi con
incubazione a 44°C; il verde brillante ed i sali biliari
inibiscono la crescita dei microrganismi Gram positivi. Nella
rassegna dei metodi per la determinazione dei coliformi negli
alimenti ICMSF suggerisce l'uso del Brilliant Green Bile
Broth 2% per la determinazione, con il metodo del numero
più probabile, dei coliformi totali con incubazione a 35-37°C
per 24 e 48 ore, seguito dal test di conferma su piastre di
Vi l Red
Violet
R d Bile
Bil Agar
A
o di Endo
E d Agar
A
i b a 35-37°C
incubate
35 37°C per
48 ore; questo metodo è soprattutto utilizzato nei laboratori
europei.
ICMSF in conformità ad APHA ed a FDA consiglia l'uso del
Brilliant Green Bile Broth 2% nel test di conferma dei
coliformi: trasferire un'ansata di crescita microbica dai tubi
positivi di Lauryl Pepto Bios Broth o di Lactose Broth in tubi
di Brilliant Green Bile Broth 2% e incubare a 35°C per 24 e
48 ore. La formazione di gas entro le 48 ore conferma la
presenza dei coliformi nei tubi del test presuntivo in Lauryl
Pepto Bios Broth. Seguendo la procedura descritta da
Mackenzie, ICMSF descrive l'uso del terreno al verde
brillante nella determinazione dei coliformi fecali: trasferire
un'ansata di crescita dai tubi positivi di Mac Conkey Broth in
provette di Brilliant Green Bile Broth 2% e di Peptone Water
ed incubare a 44±0.1°C; osservare lo sviluppo di gas nelle
provette di Brilliant Green Bile Broth 2% dopo 24 e 48 ore di
incubazione ed eseguire il test dell'indolo sulla crescita di 24
ore in Peptone Water; le colture che producono gas e sono
positive sono da considerarsi coliformi di origine
g
indolo p
fecale.
Sodium Desoxycholate
0.100
Sodium Lauryl Sulphate
0.050
Basic Fuchsin
1.050
Preparazione
Sciogliere 48 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata
fredda contenente 20 ml di etanolo, mescolare e portare
all'ebollizione.
ll' b lli i
N
Non
autoclavare.
l
Il terreno deve
d
essere
usato il giorno stesso della sua preparazione; se necessario
conservare al buio a 4°C per non più di 96 ore.
pH finale 7.2±0.2.
Impiego
Endo Broth Membran Filter è un terreno selettivo per il
conteggio dei coliformi nell'acqua e nel latte con la tecnica
della membrana filtrante.
Per l'esecuzione del metodo si consiglia di seguire le
indicazioni dell'APHA. I coliformi coltivano con viraggio
del terreno verso il color porpora con o senza riflessi
metallici in superficie. Il volume di campione da filtrare
deve essere scelto in base al numero di cellule batteriche
che si attende di trovare.
La quantità ideale è quella che fornisce una crescita
microbica compresa tra 50 e 200 colonie.
Ad eccezione delle acque potabili e delle acque delle
piscine che devono essere filtrati in duplicato ad un unico
volume di 100 o 500 ml, tutti gli altri campioni di acqua
devono essere filtrati a tre diversi livelli volumetrici, diluiti
o non diluiti, (Si veda la tabella sottostante).
Volumi da filtrare per il conteggio dei coliformi nelle
acque:
Anche OMS raccomanda per le acque potabili l'uso del
Brilliant Green Bile Broth 2% per il test di conferma dei
coliformi con incubazioni differenziate a 37°C ed a 44°C per
rispettivamente 48 e 6-4 ore per la distinzione tra coliformi e
coliformi fecali; il test di conferma segue la semina
preliminare
in Lactose Broth o in Mac Conkey Broth e precede il test di
verifica finale in terreno solido (Endo Agar o Levine EMB
Blue Agar o Mac Conkey Agar OMS).
82
Per le acque potabili l'arricchimento preliminare del
campione dà risultati eccellenti, anche se esso non è
indispensabile per l'esame di routine dei campioni.
EOSINE METHYLENE BLUE AGAR
ETHYL VIOLET AZIDE BROTH
Formula (grammi per litro)
Formula (grammi per litro)
Peptone Bios D
10.00
Biotone
20.0
Sodium Chloride
5.00
Sodium Chloride
5.0
Lactose 5.00 Sucrose
5.00
Glucose
5.0
Dipotassium Phosphate
20.0
Dipotassium Phosphate
2.7
Methylene Blue
0.065
Monopotassiurn Phosphate
2.7
Eosin Yellow
0.40
Sodium Azide
0.4
Agar Bios LL
15.00
Ethyl Violet
0.83 mg
P
Preparazione
i
P
Preparazione
i
Sciogliere 42.5 g di polvere in 1000 mi di acqua distillata
fredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione, distribuire e
sterilizzare a 121°C per 15 minuti.
Sciogliere 35.8 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata
fredda. Scaldare fino a completo scioglimento del terreno,
distribuire in provette ed autoclavare , a 121°C per 15
minuti. Si raccomanda di non eccedere nel tempo di
sterilizzazione.
Raffreddare il terreno a circa 50°C e, prima di trasferirlo in
piastra, agitare delicatamente per disperdere il materiale
flocculante che si forma durante la sterilizzazione.
pH finale 7.0±0.2.
pH finale 7.2±0.2.
Impiego
Impiego
Eosine Methylene Blue Agar è un terreno differenziale
preparato secondo una modificazione del terreno originale di
Halt-Harris e Teague, da usarsi in piastra per l'isolamento
degli enterobatteri e per la differenziazione dei microrganismi
lattosio-Saccarosio fermentanti.
Ethyl Violet Azide Broth è un terreno selettivo per la
determinazione degli enterococchi nelle acque, come indice
di un inquinamento fecale delle stesse. Il terreno è
preparato secondo una modificazione della formula
originale proposta da Litsky ed è in accordo con le
specificazioni dell'APHA riguardo all'uso delle tecniche
per la determinazione degli streptococchi fecali nelle
acque.
I batteri Gram-positivi sono notevolmente inibiti. La
combinazione
bi i
d ll' i e del
dell'eosina
d l blu
bl di metilene
il
nell terreno,
contenente lattosio e saccarosio, permette di distinguere i
membri dei generi Escherichia e Enterobacter dagli altri
enterobatteri.
L'uso dell'azide sodica, associata al violetto di etile, rende il
terreno selettivo per gli enterococchi essendo inibiti tutti gli
altri microrganismi Gram-positivi ed i microrganismi
Gram-negativi.
I batteri lattosio-saccarosio fermentanti sull'EMB Agar
formano colonie mucoidali e convesse con una colorazione
da rosso a porpora con assenza o presenza di riflessi metallici.
Salmonella, Shigella e gli altri batteri lattosio-saccarosio non
fermentanti formano colonie da incolori a rosa.
Gli enterococchi che si devono considerare come indicatori
di inquinamento fecale sono: Streptococcus faecalis subsp.
liquefaciens, Streptococcus faecalis subsp. zymogenes,
Streptococcus faecium, Streptococcus bovis, Streptococcus
equinus.
La presenza del tampone fosfato nel terreno permette di
distinguere E. coli da E. aerogenes; E. coli anche in presenza
di un sistema tampone, produce una notevole acidificazione
del terreno, mentre E. aerogenes, avendo modeste proprietà
fermentanti, provoca una minore acidificazione del terreno.
Le caratteristiche di crescita di questi microrganismi,
resistenza alle alte temperature, ai detergenti, ai
disinfettanti, fanno si che l'indice di inquinamento da loro
espresso debba essere integrato dalla ricerca di altri
indicatori faecali (coliformi).
L'abbassamento del p H durante la crescita di E. coli induce
la formazione di legami amidici tra l'eosina e il blu di
metilene che si traduce in una colorazione porpora metallica
delle colonie.
APHA consiglia di utilizzare l'Ethyl Violet Azide Broth per
il test di conferma degli enterococchi coltivati nei tubi di
Azide Broth. Dopo 24-48 ore di incubazione delle provette
di Azide Broth si trasferiscono tre ansate di crescita
i bi in
i tubi
bi contenentii 10 mll di Ethyl
E h l Violet
Vi l Azide
A id
microbica
Broth e si incuba per 24 ore a 35°C.
Per l'isolamento degli enterobatteri patogeni si consiglia di
utilizzare, parallelamente all'EMB Agar, terreni più selettivi
quali l'XLD, il Brilliant Green Agar, ecc.
Nella tabella sottostante sono riportate le caratteristiche
colturali di alcuni microrganismi su EMB Agar:
83
La presenza di enterococchi è rivelata dall'intorbidimento
del brodo e dalla formazione di un anello porporino attorno
al menisco del liquido.
FAECAL COLIFORM BROTH
Preparazione
Formula (grammi per litro)
Sciogliere 13 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata
fredda. Scaldare fino a completa solubilizzazione,
distribuire in tubi Durham ed autoclavare a 121°C per 15
minuti. Se necessario, usare il terreno a doppia o tripla
concentrazione
concentrazione.
Biotone
10.0
Peptocomplex
5.0
Yeast Extract
3.0
Sodium Chloride
5.0
Lactose
12.5
Bile Salts Bios
1.5
Aniline Blue
0.1
pH finale 6.8±0.2.
Impiego
Preparazione
Sciogliere
S
i li
37 g di polvere
l
i 1000 mll di acqua distillata
in
di ill
fredda; addizionare 10 ml di una soluzione al1'1 %, in
NaOH 0.2 N, di acido rosolico. Portare all'ebollizione sotto
agitazione, raffreddare e saturare dei tamponi assorbenti
sterili con 2 ml di terreno in piastre Petri.
p H finale 7.4±0.1.
Lactose Broth è consigliato da APHA per la
determinazione presuntiva dei coliformi con il metodo del
numero più probabile, nelle acque e nei liquami, per
eseguire il test finale di conferma dei coliformi nei prodotti
lattiero caseari dopo la semina in Endo Agar o in Levine
g ed è consigliato
g
da FDA e ICMSF pper
EMB Blue Agar
l'arricchimento non selettivo di SaJmonella.
Il terreno contiene lattosio, estratto di carne e peptone in
quantità tali da permettere una crescita ottimale dei
microrganismi non particolarmente esigenti quali sono i
coliformi.
Per la determinazione presuntiva dei coliformi nelle acque
APHA suggerisce la seguente tecnica:
Impiego
p
in in accordo alla formula
Faecal Coliform Broth,, ppreparato
proposta da APHA, è utilizzato per il conteggio dei coliformi
fecali nell'acqua con il metodo delle membrane filtranti. Per
l'esecuzione del test filtrare un volume opportuno di
campione d'acqua (si veda la tabella sottostante) e depositare i
filtri sui tamponi impregnati di Faecal Coliform Broth in
piastre Petri. Entro 30 minuti deporre in bagnomaria
termostatato a 44-45°C e incubare in contenitori a tenuta per
24 ore. I coliformi fecali coltivano con colonie blu, le rare
colonie date dai coliformi non fecali appaiono di colore
ggrigio-crema.
g
Per il conteggio
gg delle colonie si consiglia
g di
utilizzare un microscopio a basso potere d'ingrandimento (1015 ingrandimenti).
inoculare una serie di tubi da fermentazione con volumi
i ti di campione
i
i modo
in
d da
d non alterare
lt
il rapporto
t
appropriati
tra volume finale di terreno inoculato e ingredienti per litro;
ogni variazione rispetto allo schema di lavoro consigliato e
riportato nella tabella sottostante, può alterare le
caratteristiche biologiche del terreno
Volumi da filtrare per il conteggio del coliformi fecali nelle
acque:
Incubare i tubi da fermentazione a 35°C ed eseguire una
p
prima
lettura agitando
g
leggermente
gg
le pprovette dopo
p 24 ore;;
se non si osserva produzione di gas incubare per ulteriori
24 ore.
La formazione di gas entro le 48 ore è indice di positività
per i coliformi. Il limite arbitrario di 48 ore può escludere
la possibilità di coltivare occasionali coliformi che
fermentano lentamente il lattosio, i quali comunque hanno
scarso interesse sanitario e non inficiano la validità del
metodo.
GELATIN BIOS
Gelatin Bios, costituita da materiale proteico, è utilizzata
come agente solidificante nei terreni di coltura per la
microbiologia e per saggiare l'attività gelatinolitica dei batteri.
Gelatin Bios, priva di carboidrati a fermentabili e di
conservanti, è realmente solubile in acqua e fornisce soluzioni
limpide e prive di colore.
LACTOSE BROTH
Formula (grammi per litro)
Beef Extract
3
Peptocomplex
5
Lactose
5
84
Co e a e il test ppresuntivo
Confermare
esu t vo co
con se
seminee da
dai tub
tubi pos
positivi
tv
di Lactose Broth in tubi di Brilliant Green Bile Broth 2% e
ricercare, se necessario, i coliformi fecali con semine in EC
Medium.
La presenza di coliformi nelle acque è considerata indice di
inquinamento fecale; il loro ritrovamento in prodotti
lattiero caseari è indice di cicli produttivi non
rigorosamente controllati da un punto di vista sanitario e/o
di modalità di conservazione non idonee.
M17 AGAR
Preparazione
Formula (grammi per litro)
Tryptone
2.50
Meat Peptone
2.50
Sciogliere 69.2 g di agar e 54.2 g di brodo in 1000 ml di
acqua distillata fredda. Portare all'ebollizione sotto
agitazione, aggiungere 1 ml di polisorbato 80 (Tween),
distribuire ed autoclavare a 121°C per 15 minuti.
Soya Peptone
5.00
pH finale 6.4±O.2.
Yeast Extract
2.50
Impiego
Meat Extract
5.00
Sodium Glycerophosphate
19.00
MRS Agar e Broth, preparati secondo la formula di De
Man, Rogosa e Sharpe, sono terreni selettivi indicati per
l'isolamento dei lattobacilli.
Magnesium Sulphate
0.25
Ascorbic Acid
0.50
Lactose
5.00
00
Agar Bios LL
15.00
Sui due terreni coltivano lattobacilli provenienti da
qualsiasi materiale: latte, prodotti lattiero caseari, cavo
orale, feci, ed inoltre i lattobacilli normalmente difficili da
coltivare
lti
su altri
lt i terreni
t
i (Lactobacillus
(L t b ill
b i
brevis,
Lactobacillus fermentum).
De Man e coll. riportano una migliore rispondenza
dell'MRS Agar rispetto ai terreni contenenti estratto di
pomodoro di Briggs e di Cox Briggs e al terreno all'estratto
di carne di De Man, nell'isolamento dei lattobacilli.
Preparazione
Sciogliere 57 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata
fredda. Scaldare fino a completa solubilizzazione, distribuire
beuta ed autoclavare a 121°C per 15 minuti. Non eccedere
nella temperatura di ebollizione. L
L’acidità
acidità del terreno può
idrolizzare parzialmente l’agar.
pH finale 6.8±0.2.
Impiego
Il terreno M17 è selettivo
Sterptococcus thermophilus.
per
l’identificazione
di
MRS AGAR
Il Tween 80, il sodio acetato e il triammonio citrato
intensificano la crescita dei lattobacilli; il magnesio solfato
è inserito per motivi precauzionali poiché lo Yeast Extract
d
dovrebbe
bb fornire
f i una quantità
i à di magnesio
i sufficiente
ffi i
alla
ll
crescita dei lattobacilli. Per l'isolamento dei lattobacilli
operare come segue: inserire 1 mi delle diluizioni decimali
del campione in piastre Petri e addizionare 10-15 ml di
terreno, lasciar solidificare e addizionare un secondo strato
di MRS Agar non inoculato e incubare a 37°C per 3 giorni
o a 30°C per 5 giorni. Le colonie coltivate su MRS Agar o
la crescita in MRS Broth devono essere sottoposte ai tests
biochimici per l'identificazione dei lattobacilli in MRS
Aesculin Broth, MRS Arginine Broth ed in MRS
F
Fermentation
t ti Broth.
B th
Formula (grammi per litro)
Peptomeat
10.00
MUELLER HINTON MEDIUM
Beef Extract
10.00
Formula (grammi per litro)
Yeast Extract
5.00
Beef, Infusion from
300.0
Glucose
20.00
Hydrolyzed Casein Bios A
17.5
Dipotassium Phosphate
2.00
Starch
15
1.5
6odium Acetate
5.00
Agar Bios LL
14.0
Triammonium Citrate
2.00
Magnesium Sulphate
0.20
MUELLER HINTON BROTH
Manganous Sulphate
0.05
Formula (grammi per litro)
Agar Bios LL
15.00
Biomeat
2.0
Hy Casein Bios A
17.5
Starch
1.5
MRS BROTH
Formula (grammi per litro)
Preparazione
Peptomeat
10.00
Beef Extract
10.00
Yeast Extract
5.00
Glucose
20.00
Dipotassium Phosphate
2 00
2.00
Non superare il tempo e la temperatura di sterilizzazione
indicati.
6odium Acetate
5.00
pH finale 7.4±0.2.
Triammonium Citrate
2.00
Magnesium Sulphate
0.20
Manganous Sulphate
0.05
Sciogliere 36 g di agar e 21 g di brodo in 1000 ml di acqua
distillata fredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione
l'agar e scaldare fino a completa soluzione il brodo,
distribuire ed autoclavare a 115°C per 10 minuti.
85
Impiego
NUTRIENT BROTH
Mueller Hinton Medium e Broth sono terreni originariamente
preparati per l'isolamento dei meningococchi e dei
gonococchi e trovati indicati, dato i bassi livelli di acido paminobenzoico per il test di sensibilità ai sulfamidici.
Formula (grammi per litro)
Mueller Hinton Medium è raccomandato da FDA per il test di
sensibilità agli antibiotici chemioterapici con il metodo
dell'agar diffusione utilizzando dischi di carta da 6 mm ad
alta concentrazione.
Preparazione
Mueller Hinton Medium è preparato con peptoni
rigorosamente selezionati, contenenti bassi livelli di agenti
inibitori dei sulfamidici e del co-trimossazolo, tanto che è
possibile effettuare l'antibiogramma senza ricorrere
all'utilizzo del sangue lisato di cavallo per neutralizzare
ll'azione
azione della timidina antagonista del trimetoprim
nell'associazione trimetoprim-sulfametossazolo. Il contenuto
di cationi bivalenti (Ca++, Mg++) del terreno è entro
l'intervallo di valori suggerito da Reller e coll. (Ca++: 50-100
mg/l; Mg++: 20-35 mg/l), cosicché gli aloni di inibizione da
aminoglucosidi su Pseudomonas aeruginosa risultano entro il
range raccomandato da ASM e riportati in tabella.
Nell'esecuzione dell'antibiogramma secondo il metodo di
Bauer e coll. e raccomandato da FDA utilizzare il Mueller
piastre da 14 cm o da 10 cm, in strato di 4
Hinton Medium in p
mm (60 ml di terreno per piastre Ø 140 mm 25 ml per piastre
Ø 100 mm); addizionare sangue defibrinato di montone o di
cavallo al 4-5% per eseguire l'antibiogramma su specie
batteriche
particolarmente
esigenti
(streptococchi,
pneumococchi) e utilizzare l'agar cioccolato con gli emofili.
Per preparare l'inoculo sospendere 4-5 colonie coltivate su
terreno primario d'isolamento in 4-5 ml di Tryptic Soy Broth
e incubare per 2-6 ore fino a che la brodocoltura raggiunga la
stessa densità dello standard opacimetrico preparato
aggiungendo a 99.5
99 5 ml di acido solforico 0.36
0 36 N,
N 0.5
0 5 ml di
bario cloruro 1 %. Entro 15 minuti dalla preparazione
dell'inoculo immergere un tampone sterile nella brodocoltura,
spremerlo contro le pareti della provetta per eliminare
l'eccesso di liquido quindi strisciare sulla superficie dell'agar
in piastra in modo da ottenere una dispersione uniforme
dell'inoculo.
Lasciare asciugare le piastre quindi depositare i dischi di carta
premendoli sulla superficie dell'agar con la punta dell'ago;
depositare un massimo di 5 dischi nelle piastre Ø 100 mm e
un massimo di 9 dischi nelle piastre Ø 140 mm in modo tale
che tra i dischi e il bordo della piastra vi siano non meno di 2
cm. Incubare 18 ore a 35°C quindi leggere gli aloni di
inibizione tenendo conto della zona completamente priva di
crescita microbica e con bordi netti. Essendo numerose le
variabili del metodo dell'agar diffusione che giocano un ruolo
fondamentale per l'ottenimento di risultati precisi ed accurati
(inoculo, strato dell'agar, temperatura di incubazione,
contenuto dei dischi, etc.), è indispensabile stabilire un
programma per il controllo di qualità del metodo. Per tale
scopo sii utilizzano
tili
d
due
ceppi:
i Staphylococcus
St h l
aureus,
Escherichia coli; questi ceppi devono essere inseriti di routine
nella procedura operativa, ogni volta che si esegue
l'antibiogramma.
Beef Extract
3
Peptomeat
5
Sciogliere 23 g di agar e 8 g di brodo in 1000 ml di acqua
distillata fredda. Portare ad ebollizione sotto agitazione,
distribuire ed autoclavare a 121°C per 15 minuti.
pH finale 6.8±0.2.
Impiego
Nutrient Agar e Nutrient Broth sono terreni a base di
peptoni di carne utilizzati per la coltivazione dei
microrganismi non particolarmente esigenti sotto il profilo
delle richieste nutritive.
Il Beef Extract e il Peptomeat forniscono una quantità di
carbonio, azoto e vitamine sufficienti per la crescita della
maggior parte dei microrganismi non esigenti
(enterobatteri, stafilococchi).
L'APHA raccomanda l'uso di Nutrient Agar nell'esame
microbiologico delle acque e dei prodotti lattiero caseari. I
t
terreni
i possono essere impiegati
i i ti come base
b
a cuii
aggiungere vari materiali quali carboidrati, sali, coloranti
ecc., per ottenere terreni selettivi, differenziali,
d'arricchimento. Il Nutrient Agar e il Nutrient Broth, sono
stati tra i primi terreni utilizzati in microbiologia e tuttora
possono essere usati di routine per l'esame a delle acque,
degli alimenti, per
preparare colture stock, per la
coltivazione preliminare di un campione da sottoporre a
successivi esami batteriologici, per l'isolamento dei
microrganismi in coltura pura.
O/F HUGH LEIFSON BASE
Formula (grammi per litro)
Peptone Bios D
2.00
Sodium Chloride
5.00
Dipotassium Phosphate
0.30
B
Bromthymol
th
l Blue
Bl
0 03
0.03
Agar Bios LL
2.50
Preparazione
Sciogliere 9.8 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata
fredda. Portare ad ebollizione sotto agitazione, distribuire
ed autoclavare a 121°C per 15 minuti. Raffreddare a 50°C
ed aggiungere sterilmente una soluzione del carboidrato
desiderato (concentrazione finale 1-2% p/v) ovvero, per
evitare la lunga preparazione delle soluzioni sterili,
sterili
addizionare dischi di carta contenenti carboidrati.
Inoculare due tubi e ricoprire uno di essi con olio di
vasellina sterile.
pH finale 7.1±0.2.
NUTRIENT AGAR
Impiego
Formula (grammi per litro)
Beef Extract
O/F Hugh Leifson Base preparato in accordo alla formula
proposta da Hugh e Leifson è un terreno a cui possono
i i varii carboidrati
b id i per lo
l studio
di delle
d ll
essere aggiunti
ossidazioni e/o fermentazioni dei microrganismi.
3
Peptomeat
5
Agar Bios LL
15
86
Il terreno è usato per la differenziazione della flora intestinale
non enterica, Gram negativa dagli enterobatteri, per la
differenziazione dei micrococchi e per la determinazione del
modello metabolico con cui vengono degradati gli zuccheri
dai microrganismi.
Nelle tabelle sottostanti sono indicati i modelli di reazione
su O/F Hugh Leifson Base, e le caratteristiche colturali di
alcuni microrganismi su detto terreno.
L utilizzo dei carboidrati da parte dei batteri può avvenire
L'utilizzo
secondo due processi: fermentativo o ossidativo.
Alcuni microrganismi sono capaci di utilizzare i carboidrati
con produzione di acido solamente in condizioni aerobie, altri
in condizioni sia aerobie che anaerobie (anaerobi facoltativi).
La degradazione anaerobia dei carboidrati avviene attraverso
la via metabolica di Embden Meyerhof o attraverso una
combinazione di questa con lo « shunt » dei pentosi con la
via di Entner Doudoroff; tutte e tre le vie metaboliche
richiedono la fosforilazione iniziale del glucosio, hanno come
prodotto
d
i
intermedio
di l'acido
l' id piruvico,
i i
richiedono
i hi d
un composto
organico come acettore ultimo di elettroni e conducono a
metaboliti finali diversi essendo diverso il patrimonio
enzimatico delle varie specie batteriche.
La degradazione ossidativa del glucosio non richiede la sua
fosforilazione iniziale, ha come prodotto intermedio l'acido
piruvico e richiede l'ossigeno o un composto inorganico,
come acettore finale di elettroni.
+ reazione positiva, acidificazione con viraggio al giallo
dell’indicatore
L'O/F Medium Base, addizionato del carboidrato adatto,
permette di distinguere
di i
tra i due
d processii metabolici
b li i descritti.
d
i i
g
, nessun cambiamento di colore del
- reazione negativa,
mezzo
Il terreno contiene il blu di bromotimolo come indicatore di
pH; una variazione del pH del mezzo verso l'acidità, indotta
dalla degradazione del carboidrato aggiunto, fa virare
l'indicatore da verde a giallo. Il permanere, dopo
l'incubazione, di una colorazione verde del terreno o
l'apparizione di una colorazione blu, dovuta ad una
trasformazione alcalina del mezzo, indicano che il test è
negativo e che non vi è stata nessuna degradazione dei
carboidrati
carboidrati.
Il terreno ha un basso contenuto di peptoni per evitare una
loro degradazione da parte dei microrganismi con
metabolismo ossidativo, che porterebbe alla formazione di
prodotti finali di natura alcalina che potrebbero mascherare
l'acidità del mezzo.
O/F Hugh Leifson Base è un terreno semisolido; la presenza
dell'agar a una concentrazione del 0.25% impedisce ai
prodotti acidi formatisi di disperdersi verso la superficie con
una conseguente loro diluizione.
diluizione
Il dipotassio fosfato è incorporato per promuovere la
fermentazione dei carboidrati e per stabilizzare il pH del
terreno, mentre il sodio cloruro stimola la crescita di
Brucella.
II glucosio è il carboidrato che più frequentemente viene
usato per il test O/F; Cowan e Steel comunque raccomandano
di usare, per la differenziazione dei microrganismi che non
degradano il glucosio, una batteria di zuccheri costituita da
glucosio lattosio,
glucosio,
lattosio saccarosio,
saccarosio maltosio.
maltosio
Per l'esecuzione del test si inoculano due provette, contenenti
il carboidrato alla concentrazione dell'1 %, per infissione di
un ago caricato di una sospensione batterica. Dopo aver
ricoperto una delle provette con olio di vasellina si incuba per
48 ore o più a 37°C.
I microrganismi con metabolismo ossidativo produrranno
un'acidificazione del mezzo, con viraggio dell'indicatore da
verde a giallo, nella provetta aperta; i batteri con metabolismo
fermentati o produrranno
fermentativo
prod rranno un'acidificazione
n'acidifica ione del terreno in
entrambe le provette.
Con il test O/F si può determinare anche la produzione di gas
da parte dei microrganismi e la loro mobilità (crescita diffusa
a partire dalla linea dell'inoculo).
87
PEPTONE WATER
Formula (grammi per litro)
Peptone Bios D
10
Sodium Chloride
5
P
Preparazione
i
Sciogliere 15 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata
fredda. Riscaldare agitando, distribuire ed autoclavare a
121°C per 15 minuti.
Per studi sull'utilizzazione degli zuccheri aggiungere, prima
della sterilizzazione, a 900 ml di terreno, 100 ml di una
soluzione acquosa allo 0.2% di un indicatore (porpora
bromocresolo, blu bromotimolo o rosso fenolo).
Aggiungere alla base sterilizzata una soluzione sterile dello
zucchero desiderato e distribuire in tubi con campanella
oppure addizionare alle provette dischi di carta contenenti
carboidrati.
L'aggiunta di alcuni zuccheri può produrre un
abbassamento del pH del terreno: in questo caso
ricorreggere il pH con NaOH 0.1 N sterile.
pH finale 7.2±0.2.
p ego
Impiego
Peptone Water, dato l'elevato contenuto in triptofano del
Peptone Bios D, è particolarmente adatto come substrato
per .la determinazione della produzione di indolo.
La capacità di metabolizzare il triptofano con formazione
di indolo è caratteristica distintiva di alcune specie
batteriche; il test è perciò utile ai fini dell'identificazione e
classificazione dei microrganismi.
Il tempo e la temperatura di incubazione variano a seconda
d ll specie
della
i batterica
b
i in
i esame; la
l presenza di indolo
i d l può
essere rivelata con il reattivo di Kovacs o di Erlich.
Il metodo prescelto deve essere controllato con ceppi di
collezione: Escherichia coli indolo +, Enterobacter
aerogenes indolo -.
Seguendo la procedura descritta da Mackenzie, ICMSF
suggerisce l'uso di Peptone Water nel test di conferma dei
coliformi fecali negli alimenti: trasferire un
un'ansata
ansata di crescita
microbica dai tubi positivi di Mac Conkey Broth in provette
di Peptone Water e di Brilliant Green Bile Broth 2% e
incubare a 44°C; eseguire il test dell'indolo sulla crescita di
24 ore in Peptone Water e osservare lo sviluppo di gas in
Brilliant Green Bile Broth 2% dopo 24 ore e 48 ore. Le
colture che a 44°C sono indolo positive e producono gas sono
da considerarsi coliformi di origine fecale. Peptone Water è
anche utilizzato come base per lo studio della utilizzazione
degli zuccheri. Dopo l'aggiunta degli zuccheri incubare alla
temperatura desiderata e osservare tutti i giorni per 7 giorni se
vi è stata produzione di gas e/o di acido.
Tali prove, che vanno sotto il nome generico di “prove di
fermentazione degli zuccheri“, anche se a volte vengono
eseguite su microrganismi a metabolismo prevalentemente
ossidativo e se fanno uso di carboidrati che non sono solo
zuccheri ma anche alcoli e glucosidi, consistono nel
seminare il germe in esame, in coltura pura, in terreni
contenenti
t
ti varii carboidrati.
b id ti
Phenol Red Agar Base e Broth, contengono il rosso fenolo
come indicatore di pH che, da rosso, in terreno alcalino,
diventa arancio in terreno neutro e giallo in terreno reso
acido dall’attacco dei carboidrati da
parte dei
microrganismi.
Metodo in terreno solido con dischi di carta (Bios Discs)
Peptocomplex
11.000
Dividere il terreno autoclavato in piastre sterili (Ø 14 mm),
lasciar solidificare indi seminare in superficie il germe in
esame. Per ottenere risultati più rapidi e più netti ricorrere
alla tecnica dell'agar-germi. Deporre i Bios Discs sulla
superficie dell'agar inoculato, facendo attenzione che siano
opportunamente distanziati e ben aderenti al terreno
(seminare anche una piastra di controllo senza carboidrati)
incubare a 37°C. La produzione di acido è segnalata da un
alone di viraggio giallo attorno ai dischi.
Sodium Chloride
5.000
Metodo in terreno liquido con dischi di carta (Bios Discs)
Ph l Red
Phenol
R d
0 025
0.025
Agar Bios LL
15.000
Nelle provette di Phenol Red Broth Base autoclavate,
autoclavate
introdurre sterilmente i Bios Discs e inoculare con
un'ansata di crescita microbica. Seminare anche una
provetta di controllo senza carboidrati e incubare a 37°C.
PHENOL RED AGAR BASE
Formula (grammi per litro)
La produzione di acido è segnalata dal viraggio al giallo del
brodo di coltura. Con entrambi i terreni la produzione di
acido è rapida, è bene quindi eseguire letture frequenti, la
prima dopo circa 4 ore. Dopo che si è osservata una
reazione positiva scartare il tubo; prolungando infatti il
pperiodo di incubazione si ppuò assistere ad un'inversione
della reazione con viraggio dell'indicatore verso l'alcalinità.
PHENOL RED BROTH BASE
Formula (grammi per litro)
Peptomeat
10.000
Beef Extract
3 000
3.000
Sodium Chloride
5:000
Phenol Red
0.018
TRIPTIC GLUCOSE EXTRACT AGAR
Formula (grammi per litro)
Preparazione
Sciogliere 31 g di agar e 18 g di brodo in 1000 ml di acqua
distillata fredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione,
distribuire in tubi da fermentazione il brodo in ragione di 33-44
ml per tubo, e in beuta l'agar, autoclavare a 121°C per 15
minuti.
Raffreddare a circa 50°C ed aggiungere con le precauzioni
dell'asepsi una soluzione sterilizzata per filtrazione
dell'appropriato carboidrato, in modo che si ottenga una
concentrazione finale dell'1-2% (p/v).
Per evitare la lunga preparazione delle soluzioni sterili si può
addizionare in provetta (brodo) o deporre sulla superficie
dell'agar
dell
agar in piastra,
piastra dischi di carta contenenti carboidrati
pH finale 7.4±0.1
Impiego
Phenol Red Agar Base e Broth Base sono terreni contenenti
un indicatore di pH utilizzati per lo studio delle fermentazioni
dei carboidrati rispettivamente con il metodo in terreno solido
e con il metodo in terreno liquido. Phenol Red Broth Base è
preparato in accordo alla formula raccomandata da AOAC e
per lo studio della fermentazione dei carboidrati
da ICMSF p
con il metodo preparato da “International Committe on
Enterobacteriaceae"; Phenol Red Agar Base è preparato in
accordo alla formula raccomandata da APHA.
Per l'identificazione e la classificazione delle specie
batteriche si fa spesso ricorso a prove biochimiche che ne
studiano il metabolismo glucidico.
88
Peptone Bios D
5
Beef Extract
3
Glucose
1
Agar Bios LL
15
TRIPTIC GLUCOSE YEAST AGAR
agar)
(Plate count
Formula (grammi per litro)
Peptone Bios D
5.0
Yeast Extract
2.5
Glucose
1.0
Agar Bios LL
15.0
Preparazione
Sciogliere 24 g di Tryptic Glucose Extract Agar e 23.5 g di
Tryptic Glucose Yeast Agar in 1000 ml di acqua distillata
fredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione, distribuire
ed autoclavare a 121
121°C
C per 15 minuti.
minuti
pH finale 7.0±0,2.
Impiego
Tryptic Glucose Extract Agar e Tryptic Glucose Yeast Agar
sono terreni d'uso generale raccomandati da APHA, ICMSF,
AOAC per il conteggio dei microrganismi con la tecnica
dell'agar germi, utilizzato in passato per la conta microbica
totale nel latte e prodotti lattiero caseari,
caseari Tryptic Glucose
Extract Agar è ora raccomandato da APHA insieme al
Tryptic Glucose Yeast Agar, solo per il conteggio dei
microrganismi nelle acque e negli alimenti, Tryptic Glucose
Yeast Agar, corrispondente al Plate Count Agar (Standard
Methods Agar) di APHA, AOAC, ICMSF, è il terreno
d'elezione per il conteggio dei microrganismi aerobi e di
quelli anaerobi facoltativi eterotrofi, nell'acqua, latte, prodotti
lattiero caseari, alimenti.
Lo schema di lavoro da seguire per effettuare la conta
microbica
i bi su ciascun
i
tipo
i
di materiale
i l deve
d
essere il più
iù
possibile conforme a quanto raccomandato dagli organismi
ufficiali citati. Il metodo dell'APHA consiste nel preparare
diverse diluizioni del campione in esame; a 1 ml di ciascuna
diluizione in piastre Petri viene aggiunto in duplicato uno dei
due terreni al 44-46°C. Dopo aver mescolato l'inoculo con
agar si incuba per 48 ore a 32-35°C e quindi si contano le
colonie coltivate, in quelle piastre in cui siano presenti da 30
a 300 colonie. Per il conteggio di microrganismi che
richiedono altre temperature di crescita si incuba a 5-7°C per
10 giorni a 20°C per 3-5
3 5 giorni e a 45°C per 2-3
2 3 giorni.
giorni
TRYPTIC SOY AGAR
Formula (grammi per litro)
Tryptic Casein Bios D
15
Soy Peptone
5
SQdium Chlbride
5
Agar'Bios LL
15
TRYPTIC SOY BROTH
Formula (grammi per litro)
Tryptic C~sein Bios D
17.0
Soy PeptoÌle
3.0
Sodium Ch.foride
5.0
Dipotassium Phosphate
2.5
Glucose
2.5
Preparazione
Sciogliere 40 g di agar e 30 g di brodo in 1000 ml di acqua
distillata fredda.
fredda
Portare all
all'ebollizione
ebollizione sotto agitazione,
agitazione
distribuire e autoclavare a 121°C per 15 minuti.
pH finale 7.3±0.2.
Impiego
Tryptic Soy Agar e Tryptic Soy Broth sono terreni d'uso
generale che supportano la crescita di una larga varietà di
microrganismi.
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Per le loro caratteristiche nutrizionali; per l'assenza di
inibitori, per la possibilità di essere supplementati con i
composti più svariati, i due terreni si prestano bene per
l'isolamento dei patogeni, per lo studio dei microrganismi a
crescita fastidiosa, per il mantenimento dei ceppi di
collezione, per la preparazione di autovaccini, per
l'
l'esecuzione
i
d ll' tibi
dell'antibiogramma.
Il sangue è l'additivo più comune per il Tryptic Soy Agar e
viene aggiunto a concentrazioni variabili tra il 5 e i115%
come sangue defibrinato (di coniglio, cavallo, montone,
uomo).
In alcuni casi (isolamento di Neisseria e di Haemophilus) il
sangue viene aggiunto come tale al terreno e poi riscaldato
a 80°C per 10 minuti ottenendo così l'agar cioccolato.
Tryptic Soy Agar è comunemente usato per il conteggio dei
germi presenti nelle urine e negli espettorati ed in
microbiologia alimentare per la conta dei microrganismi
presenti nel latte, carni, alimenti conservati, ecc.
Tryptic Soy Broth è utilizzato per la coltivazione di
microrganismi aerobi, aerobi facoltativi, inclusi alcuni
funghi e, aggiunto d'agar a concentrazioni 0.1-0.2% per la
coltivazione degli anerobi obbligati.
BIBLIOGRAFIA
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Pitzurra/Franceschini
Elementi di microbiologia
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Microbiologia
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Laboratorio di microbiologia
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