Obiettivo 1.

Obiettivo 1. Tipizzazione high-throughput delle razze bovine per la diagnostica e la selezione
Descrizione. L’aumento delle conoscenze a livello del genoma e i progressi nell’ambito delle
biotecnologie hanno permesso di considerare con più interesse le mutazioni puntiformi del DNA. Gli
SNP sono i marcatori più diffusi nel genoma animale (uno ogni 500-1000 nucleotidi). Questi
marcatori, oltre ad essere i più frequenti nel genoma, si prestano ad essere analizzati mediante
sistemi completamente automatizzati, detti di “high-throughput”, che sfruttano il fatto che i due
alleli di uno SNP possono essere analizzati e trattati in modo binario. Fra le tecniche di
genotipizzazione fino ad ora sviluppate, la tecnologia di indagine molecolare più avanzata è quella
che utilizza i microarray a DNA o “DNA-chip”. Questa metodica si basa sull’utilizzo di supporti solidi
su cui sono fissate sonde oligonucleotidiche ad alta densità, che permettono di analizzare
contemporaneamente migliaia di SNP in un solo esperimento. Rispetto all’analisi del DNA con
tecniche classiche, l’analisi ottenuta con la tecnica dei microarray permette di ottenere, con un solo
test, molteplici diagnosi contemporaneamente, migliorando i sistemi attualmente in uso in termini
di informazione genetica sul singolo animale e con tempi e costi ridotti nell’ottenimento del
risultato.
Attualmente, per quanto riguarda la specie bovina, in letteratura sono disponibili informazioni
relative a molte mutazioni che hanno un effetto su caratteristiche produttive, riproduttive, di
resistenza alle malattie e che causano difetti genetici. Molte altre informazioni relative a geni che
influenzano i caratteri produttivi sono attualmente utilizzate, mediante test molecolari a livello del
DNA, nella selezione dei riproduttori in modo da evitare l’utilizzo dei portatori di varianti non
desiderate e per la scelta dei soggetti portatori di combinazioni geniche favorevoli. Oltre che per il
miglioramento genetico degli animali di interesse zootecnico, la genetica molecolare offre gli
strumenti per l'analisi di paternità e l'identificazione degli animali.
Il servizio di tipizzazione per tutte le Associazioni Nazionali Allevatori di tutte le specie e razze
domestiche è fornito dal Laboratorio Genetica e Servizi di Cremona (LGS, società privata di ricerca
e sviluppo del settore biotecnologico applicato alla produzione zootecnica), in stretta dipendenza
con le Associazioni Nazionali degli Allevatori, seguendo protocolli storici che utilizzano microsatelliti
per l’accertamento di paternità e maternità e tecniche individuali e separate di amplificazione del
DNA per le diagnostiche più specifiche. Attualmente LGS utilizza in licenza d’uso una metodologia
per la diagnostica molecolare del solo genotipo lattoproteico bovino (22 polimorfismi corrispondenti
a 21 varianti genetiche delle proteine del latte individuati con un’unica analisi). Questa metodologia
è stata brevettata da IBBA-CNR e VSA-UNIMI (Brevetto MI2006A000529 depositato il 22.03.2006)
ed è stata testata in via temporanea, sempre da LGS, nella forma del “diritto di opzione”. LGS è
fortemente interessata ad estendere ed elevare tale metodologia a standard generale di tutta la
sua attività diagnostica di servizio. Il progetto in questione si pone pertanto il concreto obiettivo di
realizzare un miglioramento tecnologico di diretta ricaduta pratica e applicativa con un significativo
risparmio economico accompagnato da un diretto miglioramento della qualità dei servizi erogati. In
particolare il progetto è finalizzato alla messa a punto di una tecnica altamente automatizzata, di
semplice esecuzione ed economica per la genotipizzazione simultanea di SNP nella specie bovina
utilizzando la tecnologia dei DNA microarray. Gli SNP che verranno analizzati riguardano
polimorfismi con dirette implicazioni sulla sintesi delle proteine (caseine e sieroproteine) e del
grasso del latte, polimorfismi a livello di geni candidati per la qualità della carne, a livello di geni
coinvolti nella determinazione del colore del mantello e a livello di geni coinvolti nella suscettibilità
a malattie genetiche. Inoltre, sarà utilizzato un panel di SNP appositamente scelti per le indagini di
parentela, utilizzando quale punto di partenza 20 SNP precedentemente analizzati. Ai fini della
diagnosi di parentela il panel di 20 SNP dovrà essere incrementato per cui si prevede uno
screening di ulteriori SNP, fra i quali verrà operata una scelta in base alla valutazione delle
frequenze alleliche, oppure una valutazione della fattibilità dell’impiego di SNP già utilizzati con la
stessa metodica in modo da ottenere un panel idoneo di almeno 50 SNP. Per lo screening degli
SNP e per la scelta del panel è necessario un campionamento realizzato con campioni provenienti
da animali appartenenti a diverse aree geografiche. In tal modo sarà allestita una biobanca
genetica che potrà essere messa a disposizione di enti di ricerca per futuri studi.
Questa ricerca presenta alcuni elementi di interazione con due progetti, n. 962 e n. 837,
attualmente finanziati dalla regione Lombardia nell’ambito del Programma triennale di ricerca in
campo agricolo che coinvolgono fra gli enti attuatori anche alcuni degli esecutori del presente
obiettivo. In particolare, il progetto n. 962 “Diagnosi precoce di mastiti subcliniche per un
miglioramento quali-quantitativo delle produzioni lattiero-casearie” prevede l’applicazione della
medesima tecnologia molecolare dei chip a DNA, utilizzati in questo caso per la valutazione dello
stato sanitario di bovine da latte allevate in aziende lombarde. Dalle interazioni positive tra i due
progetti, che prevedono di applicare la stessa tecnologia innovativa in due ambiti diversi ma
paralleli, potranno derivare benefici per l’intera filiera: allevatori, aziende di lavorazione e
trasformazione del latte, consumatori.
Per quanto concerne invece il progetto regionale n. 837 “Identificazione di QTL per resistenza alla
mastite e per caratteristiche nutrizionali del latte in popolazioni di bovini da latte” si possono
evidenziare obiettivi comuni fra i due progetti, quali la caratterizzazione genetica degli animali al
fine di operare una selezione anche per caratteri sanitari e nutrizionali, ma ottenuti utilizzando
metodiche molecolari differenti. Anche in questo caso, la condivisione di informazioni risultanti
dall’analisi di diverse regioni genomiche con marcatori molecolari differenti potrebbe ampliare le
conoscenze attualmente disponibili sul genoma bovino, in particolare per quanto riguarda quelle
regioni coinvolte nella resistenza a determinate malattie o che influiscono sulla caratteristiche
nutrizionali del latte. In questo modo si potrà fornire un valido strumento di selezione per la
valorizzazione e il miglioramento qualitativo delle produzioni del comparto zootecnico lombardo.
Attività ed articolazione temporale
1. Pianificazione degli esperimenti: mese 1, 13 e 25. La prima fase del progetto consiste nella
pianificazione delle azioni che si svolgeranno nei tre anni successivi. Questa fase si rende
indispensabile dato il numero di campioni previsti (1500) e la stretta interazione e
complementarietà fra i vari partner nel corso delle attività previste. In particolare, all’inizio di ogni
anno dei 3 anni di progetto, sarà definito il tipo di materiale ottimale da raccogliere per le analisi
successive (campioni di sangue o di bulbo pilifero).
2. Raccolta campioni: dal mese 2 al mese 8, dal 14 al 20, dal 26 al 30.La raccolta dei campioni
verrà eseguita in collaborazione con LGS. Si prevede di raccogliere in tre anni 1500 campioni, circa
500 all’anno. Da ognuno di questi campioni sarà estratto il DNA che verrà opportunamente
stoccato fino al momento dell’analisi.
3. Scelta dei polimorfismi (SNP) oggetto delle analisi: dal mese 3 al mese 12. La scelta dei
polimorfismi verrà eseguita nel corso del primo anno del progetto, in contemporanea alla prima
raccolta ed analisi dei campioni, al fine di ottenere un panel idoneo di almeno 50 SNP.
4. Identificazione molecolare degli SNP mediante l’utilizzo della tecnologia microarray: dal mese 4
al mese 12, dal 14 al 24, dal 26 al 36. Verrà utilizzato un sistema d’ibridazione associato a
processo enzimatico compiuto in fase liquida. Il sistema impiegato è composto da una reazione di
ligazione (LDR, Ligation Detection Reaction) combinata con un array universale (UA, Universal
Array). Questo metodo richiede un’amplificazione tramite PCR delle regioni in cui si localizzano gli
SNP di interesse, seguita da una reazione di LDR.
5. Realizzazione di un software di acquisizione ed archiviazione dei dati: dal mese 4 al mese 12,
dal 14 al 24, dal 26 al 36. Una fase di analisi statistica si rende indispensabile per raccogliere ed
analizzare tutti i dati disponibili. L’analisi statistica verrà eseguita utilizzando un software
appositamente progettato per questo scopo e collegato a quello del sistema microarray impiegato.
In questo modo sarà possibile acquisire ed archiviare i dati, nonché calcolare frequenze alleliche,
PI (Probabilità di Identità), PE (Probabilità di Esclusione), ed altri parametri per l’accertamento
della parentela, ed eventualmente le analisi di associazione con caratteri produttivi e la presenza di
malattie genetiche in una popolazione. Questa attività verrà compiuta in collaborazione con VSAUNIMI.
6. Studio di fattibilità sviluppo test diagnostico: dal mese 31 al 36. Lo studio di fattibilità necessita
di una fase indipendente che richiede la raccolta definitiva di dati per poter scegliere il panel di
SNP più informativo possibile ai fini dell’identificazione e dell’accertamento di parentela e per
progettare un test rapido da sviluppare come kit diagnostico.
7. Analisi conclusiva dei risultati e redazione del rapporto conclusivo: al mese 36. In questa ultima
fase si procederà ad una analisi conclusiva dei risultati, che si concretizzerà con la stesura di un
rapporto finale di ricerca che riassumerà tutti i dati ottenuti e gli obiettivi raggiunti.
Milestones
M4.1.1 Valutazione della prima raccolta dei campioni e di verifica delle prime analisi molecolari
eseguite (fine dell’8° mese).
M4.1.2 Valutazione della prima raccolta di dati, prima di iniziare la raccolta di campioni e le analisi
del secondo anno. (fine del 12° mese).
M4.1.3 Valutazione della seconda raccolta di campioni e verifica dello sviluppo del chip a DNA (fine
del 18° mese).
M4.1.4 Valutazione della raccolta di dati, prima di iniziare la raccolta di campioni e le analisi del
terzo anno (fine del secondo anno).
M4.1.5 Punto di verifica delle analisi molecolari eseguite (fine del 30° mese).
M4.1.6 Valutazione complessiva del progetto intero. In questa analisi finale verrà valutata la
opportunità o meno di passare alla fase brevettuale del test molecolare sviluppato, sulla scorta
delle informazioni ottenute dalle analisi statistiche e dallo studio di fattibilità. Il lavoro di analisi
conclusiva dei dati si concretizzerà con la redazione di un rapporto di fine progetto.
Risultati attesi – Deliverables
D4.1.1 Identificazione di un panel idoneo di almeno 50 SNP da utilizzare nei bovini per la
tipizzazione di caratteri produttivi e per la diagnosi di parentela mediante DNA chip.
D4.1.2 Realizzazione di un prototipo di DNA chip per i test molecolari di tipizzazione di caratteri
produttivi e per la diagnosi di parentela.
D4.1.3 Realizzazione di un kit diagnostico per la tipizzazione di caratteri produttivi e per la diagnosi
di parentela basato sull’utilizzo del panel di SNP precedentemente individuato mediante la
tecnologia DNA chip.
Esecutori e Partners
Collaboreranno attivamente allo svolgimento di questo obiettivo il Dipartimento Scienze e
Tecnologie Veterinarie per la Sicurezza Alimentare dell’Università degli Studi di Milano (VSA-UNIMI)
e LGS, società del settore biotecnologico applicato alla produzione zootecnica che opera a sua
volta in stretto collegamento con le Associazioni Nazionali degli Allevatori.
Nell’ambito di questo obiettivo, LGS si occuperà della raccolta dei campioni e dell’estrazione del
DNA, IBBA dello sviluppo di DNA chip e VSA-UNIMI della realizzazione di un software per
l’acquisizione e l’archiviazione dei dati. Tutti i partners si occuperanno della scelta iniziale del panel
di polimorfismi oggetto dell’analisi e dello studio finale di fattibilità per lo sviluppo del kit
diagnostico.